顧亞寧，吳琳芳，林德寶，鄒秉章，王思榮，周魯宏，賀紀正

(1.福建師范大學地理科學學院，福建 福州 350117；2.福建師范大學濕潤亞熱帶山地生態(tài)國家重點實驗室培育基地，福建 福州 350117；3.福建省上杭白砂國有林場，福建 上杭 364205)

識別植被變化條件下土壤微生物的多樣性和群落組成是理解植被-微生物-土壤反饋的基礎。細菌是土壤中最豐富且分布最廣的微生物類群，在地球生物化學循環(huán)和物質(zhì)轉(zhuǎn)換等地下生態(tài)過程中發(fā)揮核心作用[1]。土壤細菌生命活動所需的能量主要來自地上凋落物和地下根系分泌物[2]。植被的變化可影響土壤細菌的多樣性、群落組成和生活策略，形成植物-土壤細菌反饋體系[3-4]。因此，土壤細菌的多樣性及群落組成可作為反映森林轉(zhuǎn)換和土壤健康的敏感性指標[5]。

提高森林覆蓋率和森林質(zhì)量被認為是緩解氣候變化，提升森林碳匯功能的重要手段[6]。亞熱帶是我國最重要的人工林產(chǎn)區(qū)，占我國人工林總面積的65%以上。馬尾松(Pinusmassoniana)是本區(qū)域重要的造林樹種[7]。當前的純林面臨著生物多樣性喪失、土壤退化和對病蟲害抵抗力下降等生態(tài)風險[8]。相比純林，混交林往往具有更高的生物多樣性、生物量、土壤肥力和抵抗力，可提供更多樣化的生態(tài)服務和森林產(chǎn)品[6，9-10]。因此，利用本土闊葉樹種進行混交被認為是改善馬尾松人工林的最有效方式[5，11]。有研究表明地上植物性狀和地下土壤微生物群落特征具有相互依賴性，樹種特征驅(qū)動土壤微生物群落變化[1]。樹種豐富度增加會對土壤微生物群落多樣性和結構產(chǎn)生一定影響[12]。森林類型轉(zhuǎn)換以及樹種多樣性增加會顯著改變地上生產(chǎn)力、土壤養(yǎng)分或土壤微環(huán)境，從而改變土壤微生物多樣性和群落組成[13]。然而，從土壤微生物角度評估混交林和純林土壤健康的差異依然十分匱乏，且結論存在差異[14]。如梁艷等[5]發(fā)現(xiàn)，亞熱帶馬尾松人工林與針闊混交林的土壤細菌群落結構相似，但多樣性和生物代謝通路功能顯著高于闊葉純林；丁國昌等[15]發(fā)現(xiàn)亞熱帶杉木林轉(zhuǎn)換為黑木相思林后，表層土壤中革蘭氏陽性、陰性菌和放線菌的豐度顯著增加；楊世福等[16]發(fā)現(xiàn)從馬尾松林演替為針闊混交林過程中，土壤細菌群落發(fā)生顯著變化：酸桿菌門(Acidobacteriota)和浮霉菌門(Planctomycetota)的相對豐度顯著增加，綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度呈降低趨勢，暗示群落養(yǎng)分策略由R策略者轉(zhuǎn)變?yōu)镵策略者細菌占優(yōu)勢。土壤微生物參與土壤碳循環(huán)、調(diào)控土壤養(yǎng)分循環(huán)、改善土壤環(huán)境，土壤微生物對于維持土壤健康具有重要意義[17]。朱永官等[18]認為土壤健康由土壤物理化學以及生物指標共同綜合評估，其中的微生物指標因為其繁殖周期短對環(huán)境的變化更為敏感等多種優(yōu)點，是綜合診斷土壤健康的理想標志物，純林和混交林的土壤健康是否達到天然次生林水平已經(jīng)成為熱點問題[19]。利用土壤微生物評價純林、混交林以及天然次生林土壤健康標準可為亞熱帶森林可持續(xù)發(fā)展提供重要理論依據(jù)。此外，土壤具有高度的空間異質(zhì)性，理化性質(zhì)的垂直變化會影響土壤微生物的群落結構[19]。目前對于土壤微生物的研究大多數(shù)集中在20 cm的表層土壤，對更深層土壤微生物群落組成的研究非常匱乏。

本文以我國亞熱帶典型馬尾松純林、馬尾松闊葉混交林、闊葉混交林和天然次生林為研究對象，分層采集(0～10 cm)和(30～50 cm)土壤進行16S高通量測序，闡明天然林、人工純林和混交林中不同深度土壤細菌分類多樣性和群落組成差異；并進一步識別影響細菌多樣性和優(yōu)勢類群的因素，以期從土壤微生物角度評估森林混交改造對土壤健康和生態(tài)功能的影響，為亞熱帶人工林樹種選擇和馬尾松純林改造提供科學指導。

1 研究區(qū)和研究方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于福建省龍巖市上杭縣白砂國有林場(25°04′-25°15′ N，116°30′ -116°38′ E)[20]。研究區(qū)為中亞熱帶季風氣候，年平均氣溫為20.1 ℃，年平均降水量1 600 mm，海拔400～800 m。土壤主要為花崗巖發(fā)育而成的紅壤。2021年6月，選取典型的20年生馬尾松成熟林(PM)、40年生馬尾松過熟林(PO)、30年生馬尾松闊葉混交林(PB)、20年生闊葉混交林(BM)和40年生天然次生林(SF)[20]。人工林由林場統(tǒng)一經(jīng)營管理：馬尾松成熟林與馬尾松過熟林均為馬尾松純林；馬尾松闊葉混交林補種4年闊葉樹種，優(yōu)勢種為馬尾松(P.massoniana)、米老排(Mytilarialaosensis)、火力楠(Micheliamacclurei)、楓香(Liquidambarformosana)等；闊葉混交林優(yōu)勢樹種為米老排(M.laosensis)、火力楠(M.macclurei)、楓香(L.formosana)等；天然林優(yōu)勢樹種為木荷(Schimasuperba)、赤楠(Syzygiumbuxifolium)和毛冬青(Ilexpubescens)等[11]。

每個森林類型設置3個樣地，每個樣地建立3個20 m×20 m樣方。為減少異質(zhì)性，在每個樣方中分層采取9鉆表層(0～10 cm)和深層土壤(30～50 cm)，并混勻作為樣方代表土壤樣品[20]。收集每個樣方中的凋落物。將混合土壤樣品過2 mm篩，挑去根系及礫石，根據(jù)實驗指標需求對混合土樣保存于-80、4 ℃以及陰涼處風干，用于后續(xù)的微生物高通量測序、微生物生物量和其他土壤理化性質(zhì)測定。

1.2 土壤微生物總DNA的提取、高通量測序和生物信息學分析

土壤總DNA采用Fast DNA Spin Kit試劑盒(MP Biomedicals，LLC，USA)按照說明手冊的操作步驟進行提取。將提取的DNA用NanoDrop分光光度計(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質(zhì)量。選取通用引物515F/907R，利用PCR擴增技術對細菌V4-V5區(qū)進行擴增。在Illumina MiSeq平臺上進行測序。對原始測序序列進行拼接、質(zhì)控和過濾，后使用UPARSE軟件在99%相似度下對優(yōu)化序列進行聚類，使用DADA2插件進行降噪處理后獲得擴增子測序變體(ASVs)序列。代表性序列與Silva數(shù)據(jù)庫對比注釋用于后續(xù)分析[21]。

1.3 土壤基本理化性質(zhì)的測定

土壤含水量利用烘干法測定。利用pH計(FE20-FiveEasyTMpH，MettlerToledo，German)對土壤懸濁液測定pH值。利用碳氮元素分析儀(VarioMAX，Elementar，Germany)測定總碳和總氮含量。使用流動分析儀(San++ System，Skalar，Holland)測定土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和速效磷含量[22-23]。采用氯仿熏蒸法測定微生物生物量碳氮磷[24]，并使用島津碳氮分析儀(TOC Vcph，Shimadzu，Kyoto Japan)測定可溶性有機碳。土壤粒徑使用激光衍射粒度分析儀(Mastersizer 3000，Malvern，England)測定。

1.4 統(tǒng)計分析

計算Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)來指示細菌alpha多樣性。采用雙因素方差來檢驗森林類型和土壤深度對微生物多樣性的顯著影響。采用Kruskal-WallisH檢驗進一步評估細菌優(yōu)勢門的組成差異。利用主坐標分析(PCoA)檢驗不同土壤深度中細菌群落組成在不同森林類型中的顯著差異。此外，利用相關分析和隨機森林模型來檢驗細菌多樣性及優(yōu)勢細菌類型與凋落物和土壤生物物理化學因子間的關系。

2 結果

2.1 不同森林類型中表層和深層土壤細菌物種組成

對不同林型土壤樣品進行16S rRNA高通量測序，經(jīng)過質(zhì)量修整和去除嵌合體后，得到12 595個細菌ASVs，聚類為33門，92綱，196目，308科，510屬，924種。表層土壤中，相對豐度最高的優(yōu)勢菌門為酸桿菌門(Acidobacteriota：37.84%±0.03)、變形菌門(Proteobacteria：35.33%±0.02)、浮霉菌門(Planctomycetota：9.5%±0.02)以及放線菌門(Actinobacteriota：7.07%±0.01)；類似地，深層土壤中相對豐度最高的為酸桿菌門(32.38%±0.01)、變形菌門(30.98%±0.03)、浮霉菌門(11.2%±0.02)以及綠彎菌門(Chloroflexi：10.71%±0.02)(見圖1)。Kruskal-WallisH分析結果表明，酸桿菌門、變形菌門和浮霉菌門相對豐度在不同森林類型中有顯著差異(表1)。在表層土壤中，酸桿菌門的相對豐度在闊葉混交林中最低(33.92%)，而在馬尾松過熟林和天然次生林較高，分別為40.82%和39.02%。表層土壤中變形菌門的相對豐度在天然次生林中最高，在馬尾松過熟林中最低，分別為36.98%和32.42%；而在深層土壤中，其相對豐度在闊葉混交林中最低，為24.62%。在不同土壤深度中，浮霉菌門相對豐度均表現(xiàn)為在天然次生林中最高，在馬尾松闊葉混交林中最低。

表1 Kruskal-Wallis H檢驗結果顯示不同森林中主要細菌優(yōu)勢門的差異Tab.1 Results of Kruskal Wallis H test showing the difference of main bacterial phyla in different forests

PB：馬尾松闊葉混交林；BM：闊葉混交林；SF：天然次生林；PO：馬尾松過熟林；PM：馬尾松成熟林；n=9。圖1 不同森林類型中細菌優(yōu)勢物種的相對豐度(門水平)Fig.1 Relative abundance of dominant bacterial phyla in different forest types(phylum level)

2.2 不同森林類型中表層和深層土壤細菌多樣性指數(shù)

本研究以Chao1、Shannon指數(shù)以及譜系多樣性指數(shù)來表征細菌alpha多樣性。雙因素方差分析結果表明，森林類型對Shannon指數(shù)以及譜系多樣性指數(shù)存在顯著影響(P<0.05)，土壤深度則顯著影響Chao1指數(shù)(P<0.05)(見圖2)。

(a)Chao 1指數(shù);(b)Shannon指數(shù);(c)譜系多樣性指數(shù)(Pd)。BM：闊葉混交林;PM：馬尾松成熟林;PO：馬尾松過熟林;PB：馬尾松闊葉混交林;SF：天然次生林。*P<0.05;nsP> 0.05;n=9。 圖2 不同森林類型之間土壤細菌群落的alpha多樣性Fig.2 Alpha diversity of soil bacterial communities in different forest types

2.3 不同森林類型中表層和深層土壤細菌的群落組成分布

利用PCoA來研究不同森林類型間細菌群落組成的相似性或相異性(圖3)。同一森林類型內(nèi)土壤細菌群落有很好的相似性，不同森林類型間有較高的相異性。分析結果表明，在表層土壤中PCoA的兩個維度分別解釋了25.88%與9.53%的變異(R=0.85，P=0.001)。主坐標軸1可將馬尾松純林與其他森林類型分開，闊葉混交林和天然次生林的細菌群落較為相似。在深層土壤中前兩軸分別解釋了17.36%與11.39%的變異(R=0.61，P=0.001)。與表層土壤不同的是，馬尾松闊葉混交林與天然次生林的細菌群落更為相似(見圖3)。馬尾松混交林和天然次生林的組內(nèi)變異略大。

(a)表層土壤;(b)深層土壤。BM：闊葉混交林;PM：馬尾松成熟林;PO：馬尾松過熟林;PB：馬尾松闊葉混交林;SF：天然次生林。圖3 不同森林類型間土壤細菌群落的主坐標分析結果Fig.3 Principal coordinate analysis of soil bacterial communities in different forest types

2.4 土壤細菌群落的優(yōu)勢類群及alpha多樣性指數(shù)的主要影響因素

表層土壤中酸桿菌門、擬桿菌門、RCP2-54、WPS-2與土壤pH值顯著負相關，變形菌門、浮霉菌門與土壤pH值顯著正相關(P<0.01)，但在深層土壤中只有黏球菌門、RCP2-54與土壤pH值顯著相關(P<0.01)。表明不同土壤深度主要優(yōu)勢細菌門與pH值關系有所差異。深層土壤中變形菌門、浮霉菌門與凋落物碳氮比顯著負相關(P<0.01)，綠彎菌門則相反。同時，綠彎菌門在表層土壤和深層土壤中均與土壤氮含量顯著負相關，這表明其可能為貧營養(yǎng)菌群(見圖4)。深層土壤中，酸桿菌門、變形菌門與土壤總碳呈顯著正相關(P<0.05)，變形菌門、浮霉菌門均與土壤總氮顯著正相關(P<0.05)；在表層土壤中速效磷與變形菌門、浮霉菌門呈顯著負相關、放線菌門、綠彎菌門呈現(xiàn)顯著正相關(P<0.05)。硝態(tài)氮與浮霉菌門和放線菌門也存在相關性(P<0.05)。而不論表層和深層土壤中浮霉菌門均與硝態(tài)氮顯著負相關(見圖4)。類似地，隨機森林模型的結果也表明微生物生物量碳含量(MBC)和土壤pH分別是影響表層和深層土壤細菌Shannon指數(shù)最重要的理化因素(見圖5)。此外，凋落物的碳氮比也顯著影響土壤細菌的多樣性。

3 討論

3.1 亞熱帶典型森林中土壤細菌的優(yōu)勢類群和多樣性

本研究中土壤優(yōu)勢細菌類群與前人報道一致。馬翠霞[25]研究發(fā)現(xiàn)在毛竹人工林，杉木人工林以及闊葉林中土壤優(yōu)勢細菌門也為酸桿菌門、變形菌門、綠彎菌門和放線菌門，且研究中的人工林與天然林之間微生物群落組成存在差異。類似地，陳進等[26]對黔中馬尾松林0～20 cm土壤的調(diào)查結果也表明，變形菌門、放線菌門和酸桿菌門為優(yōu)勢類群。研究結果表明，表層和深層土壤中優(yōu)勢的3個細菌類群的相對豐度均受到森林類型的顯著影響(圖1，表1，P<0.05)。一般來說，酸桿菌門為嗜酸的寡營養(yǎng)細菌，對較貧瘠和酸性的土壤有較強的適應性[27]；變形菌門具有固碳、固氮和解磷等生態(tài)功能，參與養(yǎng)分礦化，可加速土壤有機質(zhì)的分解[28]；浮霉菌門是促進植物生長的關鍵細菌類群，其常與植物根際相關，在營養(yǎng)循環(huán)或病原體控制中發(fā)揮關鍵作用[29]。森林類型對土壤細菌優(yōu)勢門的顯著影響暗示，在森林類型轉(zhuǎn)換過程中，細菌參與的土壤碳礦化和養(yǎng)分循環(huán)發(fā)生顯著變化。由于研究區(qū)土壤呈顯著酸性且相對貧瘠，因此，嗜酸且耐貧營養(yǎng)的酸桿菌門相對豐度優(yōu)勢顯著，這一推論也由其相對豐度分別與pH值和MBC含量極顯著相關(P<0.001)來支持(圖4)。

依據(jù)互補假說，多樣的樹種組合往往伴隨著凋落物和根系分泌物數(shù)量和質(zhì)量以及土壤微環(huán)境的高度異質(zhì)性，可為土壤細菌提供更加多元化的生態(tài)位[30]。因此，很多研究表明，相比人工純林，樹種多樣性增加或樹種混交會顯著促進土壤細菌多樣性[4]。森林類型對土壤細菌Shannon多樣性指數(shù)和譜系多樣性指數(shù)有顯著影響，符合互補假說。但森林類型對細菌豐富度無顯著影響(圖2)，這與宋戰(zhàn)超等[12]對廣西混交人工實驗林、Chen等[28]對湖南大山?jīng)_森林公園以及Lei等[31]對杉木人工林轉(zhuǎn)化為混交林后的研究結果類似。這可能歸因于微生物多樣性的改變?nèi)Q于某種特定植物的特征而不是植物多樣性[12，32]。此外，研究樣地轉(zhuǎn)換時間較短，土壤細菌對原始土壤條件具有一定適應性，對土壤養(yǎng)分利用存在一定的偏好性。在評估森林轉(zhuǎn)換的生態(tài)效應時，應將深層土壤納入考慮。

3.2 亞熱帶典型森林中土壤細菌的群落組成差異

細菌群落組成指示著細菌的群落動態(tài)和生態(tài)功能。研究的PCoA結果顯示，不同林齡的馬尾松純林土壤細菌群落相近，且第一軸將純林與混交林和天然林分開。天然林與闊葉混交林表層土壤的細菌群落組成更為相近，而在深層土壤中，天然林與馬尾松闊葉混交林土壤細菌群落組成更為相似(圖3)，這與以往的研究結果類似。Chen等[28]基于大山?jīng)_森林公園的研究發(fā)現(xiàn)，亞熱帶喬木群落距離與土壤細菌β多樣性顯著正相關，暗示樹種組成對土壤細菌組成的影響強于樹種豐富度。類似地，對亞熱帶森林研究表明，樹種豐富度增加會增加變形菌門和放線菌門的相對豐度，反而降低酸桿菌門的相對豐度[33]，并推測這是由于樹種混交改善凋落物的質(zhì)量，通過養(yǎng)分獲得性來間接調(diào)節(jié)不同養(yǎng)分獲取策略菌群的相對比例。研究結果表明，構建混交林在一定程度上可改善純林微生物類型，可將土壤細菌群落調(diào)整至天然次生林水平。

3.3 土壤微生物優(yōu)勢菌群和多樣性的影響因素

森林混交可通過調(diào)節(jié)土壤凋落物以及根系的數(shù)量和質(zhì)量以及土壤理化性質(zhì)來調(diào)節(jié)土壤微生物的群落組成和功能[12]。對全球尺度以及中國東部森林的研究表明，土壤pH值是影響細菌生態(tài)位分化和群落組成最重要的驅(qū)動因子[34-35]。此前的meta分析也表明植被組成是通過調(diào)節(jié)土壤pH間接影響土壤微生物多樣性和群落結構，而非通過植物多樣性[36]。據(jù)報道，酸桿菌門和放線菌門的相對豐度與土壤pH值顯著負相關[7]；綠彎菌門和WPS-2類群的相對豐度在貧瘠土壤中較高[37-38]，這些研究結果暗示了這些類群適應低pH和貧瘠的生境，這與本研究中這些類群相對豐度與土壤pH值以及氮含量的顯著負相關關系一致(圖4)。類似地，放線菌門主要與硝態(tài)氮、速效磷和MBC含量顯著正相關，暗示了研究區(qū)內(nèi)放線菌門采用富營養(yǎng)養(yǎng)分策略，這也與曹升等[39]對南平亞熱帶杉木林中放線菌與有機質(zhì)的協(xié)同關系一致。此外，本研究中的隨機森林模型發(fā)現(xiàn)，土壤細菌alpha多樣性主要受土壤pH值和凋落物養(yǎng)分調(diào)控，這與南亞熱帶混交人工林中pH和氮含量驅(qū)動力結果一致[12]。同樣地，Lei等[31]發(fā)現(xiàn)土壤pH值和土壤有機質(zhì)顯著影響土壤細菌群落，強調(diào)了利用調(diào)節(jié)樹種來進行近自然森林修復是通過調(diào)節(jié)土壤pH值和養(yǎng)分含量來間接調(diào)節(jié)根際的土壤細菌組成。

4 結論

亞熱帶主要森林土壤細菌主要類群為酸桿菌門、變形菌門、浮霉菌門和綠彎菌門。酸桿菌門、變形菌門和浮霉菌的相對豐度受到森林類型的顯著影響。森林類型對土壤細菌豐富度Chao1指數(shù)無顯著影響，但是顯著影響土壤細菌Shannon指數(shù)和群落組成，暗示了森林類型轉(zhuǎn)換顯著影響土壤細菌的組成而非細菌豐富度，且對群落組成的影響在不同深度中有所不同。土壤pH值和養(yǎng)分含量是影響關鍵細菌類群和多樣性的重要影響因素。研究結果為亞熱帶區(qū)域優(yōu)化組配樹種來提升地下生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)功能的經(jīng)營策略提供科學依據(jù)。土壤健康受到地上地下多種因素的共同作用，在后續(xù)的研究中要綜合森林的微地形、植被生物量和覆蓋度等多種數(shù)據(jù)，更加深層次、全面地闡明森林轉(zhuǎn)換影響土壤健康的相關機制。