許淑瑩，王冬梅，歐陽松應(yīng)，2

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福建 福州 350117)

核酸檢測是病原體快速檢測的重要方法之一，對于在實驗室中難以培養(yǎng)或生長速度不理想的病原體來說，基于核酸擴(kuò)增的檢測技術(shù)具有明顯優(yōu)勢[1]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)[2]可以擴(kuò)增特定核酸序列片段，廣泛應(yīng)用于檢測中，迄今為止，大多數(shù)核酸檢測是通過PCR或?qū)崟r熒光定量PCR (real-time quantitative PCR，qPCR)進(jìn)行的[3]，但PCR需要變溫?zé)嵫h(huán)過程，需要專業(yè)人員配備專業(yè)儀器進(jìn)行操作，檢測時間長，限制其在現(xiàn)場檢測的應(yīng)用。為了滿足現(xiàn)場診斷需求，近年來研究學(xué)者們開發(fā)了多種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[4]、依賴核酸序列性擴(kuò)增技術(shù) (nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)[5]、單引物等溫擴(kuò)增(single primer isothermal amplification，SPIA)[6]、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(strand displacement amplification，SDA)[7]、依賴解旋酶的等溫擴(kuò)增技術(shù)(helicase-dependent amplification，HDA)[8]、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification，RCA)[9]和重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinant enzyme polymerase amplification，RPA)[10]等。等溫擴(kuò)增技術(shù)在恒溫條件下進(jìn)行，減少了對變溫儀器的需求，其中，RPA在37～42 ℃之間反應(yīng)15～20 min即可完成，具有更大的應(yīng)用潛力。

1 RPA的原理及技術(shù)流程

1.1 原理

RPA是由英國TwistDx公司于2006年提出的核酸擴(kuò)增技術(shù)[10]。該技術(shù)利用多種酶在體外模擬T4噬菌體內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，在恒溫條件下實現(xiàn)擴(kuò)增。傳統(tǒng)PCR反應(yīng)無法在恒溫條件下實現(xiàn)擴(kuò)增，近幾年發(fā)展較快的LAMP、NESBA等可以在65 ℃恒溫條件下完成擴(kuò)增反應(yīng)，而RPA可以在37～42 ℃的條件下實現(xiàn)恒溫擴(kuò)增。RPA與PCR具有相似的一點是利用兩個相反引物實現(xiàn)擴(kuò)增，這使其在引物設(shè)計上相比較于恒溫擴(kuò)增技術(shù)更具優(yōu)勢，其他的等溫擴(kuò)增技術(shù)如LAMP需要設(shè)計復(fù)雜的引物，這也成為非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)的原因之一。PCR反應(yīng)依賴耐高溫的DNA聚合酶，反應(yīng)過程需要復(fù)雜的變溫程序來實現(xiàn)擴(kuò)增，而RPA恒溫擴(kuò)增反應(yīng)過程需要更多的酶參與。以重組酶(Uvs X)、DNA單鏈結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶作為核心酶[10]，其擴(kuò)增原理是重組酶Uvs X蛋白在加載因子(T4 Uvs Y)協(xié)助下與寡核苷酸引物形成核蛋白絲復(fù)合物，該復(fù)合物在雙鏈DNA模板尋找同源序列并通過引物在同源位點進(jìn)行鏈交換形成 D環(huán)，D環(huán)一側(cè)為引物與模板鏈雜交形成的雙鏈結(jié)構(gòu)，另一側(cè)為解開的互補(bǔ)鏈，單鏈結(jié)合蛋白隨即結(jié)合互補(bǔ)鏈，防止引物解離，隨后重組酶從核蛋白絲結(jié)構(gòu)上解體后，在dNTPs存在下新引物啟動另一條鏈置換反應(yīng)，DNA聚合酶結(jié)合引物的一端進(jìn)行延伸，并通過循環(huán)過程實現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增[3](見圖1)。

圖1 RPA擴(kuò)增原理圖Fig.1 RPA amplification schematic

1.2 反應(yīng)條件和引物探針設(shè)計

RPA反應(yīng)體系包括Tris、乙酸鉀、乙酸鎂、二硫青素醇(DTT)、Carbowax20M(或聚乙二醇)、dNTPs、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶等[10]，同時需要加入引物探針組合以及反應(yīng)關(guān)鍵酶，整個反應(yīng)在37 ℃條件下進(jìn)行。需要提出的是，體系成分的添加[11]和反應(yīng)條件[12]對擴(kuò)增有影響，如加入甜菜堿可以有效避免非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)[13]，表明RPA體系成分并不固定，可根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)整。RPA引物長度在30～35個堿基范圍內(nèi)較為合適[14]，但是比較長的引物給設(shè)計帶來了一定難度，為避免形成二級結(jié)構(gòu)或是導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，應(yīng)避免核苷酸長重復(fù)或多次小重復(fù)，引物GC含量在30%～70%之間[15]。RPA一般使用的探針有exo、fpg和nfo等。反應(yīng)結(jié)合側(cè)流測定需要nfo探針，在5′端帶有FAM熒光團(tuán)標(biāo)記，內(nèi)部帶有堿基類似物用于核酸內(nèi)切酶IV(Nfo)的識別和切割，同時反向引物帶有5′端生物素標(biāo)記，與探針形成雙標(biāo)記擴(kuò)增子[14]，在側(cè)流系統(tǒng)中金納米粒子與抗FAM抗體偶聯(lián)，雙標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物被特異性抗體捕獲[10]，檢測線的固定抗體捕獲生物素，也可以通過利用地高辛和生物素分別標(biāo)記的引物，不使用nfo探針也能夠保留特異性[16]。實時RPA可使用exo或fpg探針。exo探針兩側(cè)帶有熒光團(tuán)和淬滅劑，并由內(nèi)部堿基類似物分離，探針與靶序列結(jié)合時，外切核酶進(jìn)行切割將熒光團(tuán)與其淬滅劑分離，攜帶淬滅劑的部分被釋放，另一帶有熒光團(tuán)的片段可以通過聚合酶進(jìn)行延伸，導(dǎo)致熒光與擴(kuò)增成比例放大[17]，在5～10 min可產(chǎn)生檢測信號[10]。fpg探針的5′端攜帶淬滅劑，熒光團(tuán)結(jié)合在淬滅劑下游的內(nèi)部位置[17]，在探針結(jié)合靶基因時，DNA糖基化酶識別切割產(chǎn)生2個不可擴(kuò)展的序列片段[14]，熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離導(dǎo)致熒光放大。

1.3 產(chǎn)物檢測

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳測定

與其他的擴(kuò)增技術(shù)類似，RPA可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物檢測，電泳比較簡單且可以提供產(chǎn)物大小的信息，在實驗室研究階段經(jīng)常使用。不足的是，電泳過程需要轉(zhuǎn)移樣品可能會導(dǎo)致氣溶膠污染，致使假陽性結(jié)果出現(xiàn)，并且反應(yīng)過程需要在相應(yīng)儀器中進(jìn)行，應(yīng)用于現(xiàn)場還存在限制。相關(guān)的設(shè)備如手持式凝膠電泳設(shè)備的開發(fā)，將電泳過程集中在一個手掌大小的工具中，同時與基于FIA卡的直接采樣工具相結(jié)合，可以滿足現(xiàn)場檢測需求[18]。

1.3.2 橋式絮凝測定

橋式絮凝測定一般用于DNA片段的純化過程，可作為核酸擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的手段。橋式絮凝測定依據(jù)羧基官能化的磁珠的可逆絮凝過程[19]。在磁場存在的情況下，磁珠與RPA擴(kuò)增產(chǎn)物聚集纏繞形成絮狀物，阻止兩者在去除磁場之后重新分散開。在沒有擴(kuò)增產(chǎn)物時，磁珠在去除磁場后重新分散存在于溶液中，不存在絮狀物。因而可以通過體系中反應(yīng)絮凝狀態(tài)的存在情況，無需設(shè)備，依靠肉眼觀察對結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.3.3 濁度或比色測定

核酸擴(kuò)增過程可以產(chǎn)生焦磷酸根離子，可與溶液中的鎂離子結(jié)合形成焦磷酸鎂沉淀，通過反應(yīng)管的濁度變化進(jìn)行結(jié)果的判讀，這一特性被應(yīng)用于恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的結(jié)果報告中。常用的檢測染料有SYBR Green I[20]、Celfinder、鈣黃綠素、孔雀石綠等。辣根過氧化物酶(HRP)/H2O2與3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物偶聯(lián)是廣泛使用的比色系統(tǒng)之一，可用于RPA擴(kuò)增產(chǎn)物檢測，利用被生物素或是生物素標(biāo)記的dNTPs修飾的引物擴(kuò)增靶標(biāo)基因，再加入鏈霉親和素-HRP，隨后加入TMB和H2O2產(chǎn)生顏色變化，可通過肉眼或紫外可見光度計進(jìn)行結(jié)果判讀，還可以利用TMB的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)安培定量[21]。相關(guān)研究表明，基于該比色系統(tǒng)的RPA結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)在特異性、靈敏性、重現(xiàn)性等方面表現(xiàn)較好[22]。

1.3.4 通過pH值的定量測定

通過擴(kuò)增體系pH值變化可為核酸檢測提供更簡便的終點檢測方法[23]，擴(kuò)增過程的副產(chǎn)物產(chǎn)生及積累可以使反應(yīng)混合物的pH值發(fā)生變化[24]，目前已有利用pH變化和RPA反應(yīng)結(jié)合的檢測方案[25]。需要注意，RPA體系的緩沖液和其他成分有緩沖作用，以及擴(kuò)增過程中多種分子機(jī)制可能影響pH變化，相關(guān)的檢測策略的應(yīng)用需確定體系的緩沖能力，盡可能降低RPA試劑盒的緩沖能力[24]，同時避免緩沖能力改變對于相關(guān)酶以及DNA擴(kuò)增過程的影響。

1.3.5 側(cè)向流動檢測

側(cè)流測定(LFA)因具有成本低、操作簡便的優(yōu)勢而受到關(guān)注。LEA在核酸檢測上有兩種不同結(jié)合原理的選擇，涵括核酸側(cè)流檢測(LF)和核酸側(cè)流免疫檢測(LFIA)[26]。核酸與側(cè)向流動LF結(jié)合需對特異性引物進(jìn)行修飾，在擴(kuò)增過程產(chǎn)生特殊標(biāo)記產(chǎn)物，產(chǎn)物中間有互補(bǔ)的雙鏈片段，兩側(cè)有單鏈的部分，單鏈尾部片段作為設(shè)計片段，與捕獲探針上的互補(bǔ)單鏈片段實現(xiàn)雜交，從而實現(xiàn)產(chǎn)物檢測。LFIA也需要進(jìn)行特異性引物修飾設(shè)計，正向和反向引物通常用生物素和另一種具有高抗體親和力的抗原進(jìn)行標(biāo)記[27]，最后擴(kuò)增產(chǎn)物帶有標(biāo)記，并通過標(biāo)記物的高親和力結(jié)合或抗原抗體免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，可以實現(xiàn)對靶標(biāo)或靶標(biāo)產(chǎn)物的檢測。相較于凝膠電泳與擴(kuò)增熒光信號的檢測，側(cè)向流動檢測更具有現(xiàn)場應(yīng)用的潛力，RPA技術(shù)所需要的擴(kuò)增溫度在沒有任何加熱儀器的條件下也可以達(dá)成，同樣具有現(xiàn)場應(yīng)用的高潛力，RPA結(jié)合側(cè)向流動檢測的側(cè)向流動試紙條(RPA-LFD)被提出并應(yīng)用于不同的病原體檢測，可以實現(xiàn)現(xiàn)場即時檢測[28]，減少了檢測對于設(shè)備的需求。

1.3.6 實時檢測

RPA可結(jié)合熒光探針進(jìn)行實時檢測[29-30]，實時熒光定量RPA中探針兩側(cè)分別標(biāo)記熒光團(tuán)和淬滅團(tuán)，當(dāng)探針與靶序列DNA 結(jié)合，相應(yīng)酶識別切割位點，熒光團(tuán)和淬滅團(tuán)分開使熒光變強(qiáng)，產(chǎn)生與擴(kuò)增DNA數(shù)量成正比的熒光信號，熒光信號強(qiáng)度可由熒光信號檢測器或掃描儀識讀，結(jié)果易于判斷。目前的實時監(jiān)測以熒光應(yīng)用為主，還可以用無標(biāo)記的環(huán)形諧振器對固相重組酶聚合酶擴(kuò)增進(jìn)行實時監(jiān)測，擴(kuò)增片段與固定在環(huán)形諧振器表面上的互補(bǔ)捕獲探針雜交[31]，并通過諧振波長的變化進(jìn)行檢測。

2 RPA的應(yīng)用策略

2.1 常規(guī)RPA的應(yīng)用

食源性病原體會導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題?？焖贆z測食源性病原體有重要意義，基于RPA的檢測方案已經(jīng)被提出用于大腸桿菌O157∶H7[32]、金黃色葡萄球菌[33-34]、沙門氏菌[35]、單核細(xì)胞增生性李斯特菌[36]等食源性病原體的檢測(表1)。需要注意的是，存在少量病原體感染的食物等樣品可能在隨后保存過程出現(xiàn)病原菌迅速繁殖的情況，因此，食源性病原體的檢測靈敏度更受關(guān)注。在實際操作過程中可以通過菌體預(yù)富集[35]進(jìn)一步提高檢測靈敏度。

表1 食源性病原體的RPA檢測Tab.1 RPA detection of foodborne pathogens

RPA也被用于其他病原體的檢測，如結(jié)核病分枝桿菌[20]、布魯氏菌[37]等。研究表明，RPA的檢測靈敏度不亞于傳統(tǒng)PCR及其他擴(kuò)增技術(shù)，并在時間和溫度上具有優(yōu)勢。RPA不需要在擴(kuò)增反應(yīng)前進(jìn)行DNA純化過程，在對臨床樣本的檢測中表現(xiàn)良好。在COVID-19大流行期間，各種等溫擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于SARS-CoV-2的診斷[38]。RPA在研究報告中被證明是SARS-CoV-2的診斷工具之一[39](表2)，檢測不需要提取病毒RNA，可以防止污染問題。RPA也被用于其他病毒的檢測，如HIV[40]、腺病毒[41]。已有研究提出通過非儀器化孵育結(jié)合RPA技術(shù)對HIV-1進(jìn)行快速檢測，在環(huán)境溫度或者使用簡單的化學(xué)加熱器孵育[40]，檢測HIV-1與檢測儀器的結(jié)果相近。RPA還被應(yīng)用于致病真菌如隱球菌[42]、產(chǎn)毒鐮刀菌[43]、黃曲霉[44]、大豆疫霉病菌[45]的感染檢測，還有應(yīng)用于原生動物寄生蟲的檢測[46-47]，RPA顯示出了其在分子診斷方面的巨大潛力。

表2 SARS-CoV-2的RPA檢測Tab.2 RPA detection for SARS-CoV-2

2.2 逆轉(zhuǎn)錄RPA(RT-RPA)

RT-RPA的提出為RPA的進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，實現(xiàn)樣品中RNA到DNA的轉(zhuǎn)換過程，將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與DNA擴(kuò)增在一個步驟中完成。RT-RPA已經(jīng)被應(yīng)用于SARS-CoV-2[48，50-51]的檢測過程，對于一些高致病性的RNA病毒，RT-RPA提供了更多的現(xiàn)場檢測方法(表3)，如H7N9[52]、H9N2[53]、塞卡病毒[54]、登革熱病毒[55]等。

表3 病毒RPA診斷的相關(guān)研究Tab.3 Research on virus diagnosis using RPA technology

2.3 實時RPA

實時PCR廣泛應(yīng)用于病原體診斷，實時RPA也能夠應(yīng)用于病原體的檢測中。開發(fā)用于大腸桿菌O157：H7[57]、副溶血性弧菌[58]、土拉弗朗西斯菌[59]、單核細(xì)胞增多性李斯特菌[60]、虹彩病毒[61]、肺炎支原體[62]等病原體的RPA檢測，不同的檢測方案中體現(xiàn)了RPA技術(shù)在檢測時間和靈敏度上的優(yōu)勢。搭配便捷式熒光檢測儀[57]或ESEQuant管掃描儀[59]等設(shè)備，在操作和時間上存在明顯的優(yōu)勢。針對血細(xì)胞虹彩病毒的實時RPA檢測限為每個反應(yīng)11個拷貝[61]，對其他病毒也有低至幾拷貝的檢出限[63]，谷物中黃曲霉的RPA檢測也被證實了不亞于實時熒光定量PCR方法的特異性[44]，不同的報告中展示了實時RPA在疾病監(jiān)測上替代實時PCR的可能性。

2.4 多靶標(biāo)RPA

開發(fā)多靶標(biāo)檢測技術(shù)方案具有重要意義。多靶標(biāo)檢測需要建立合適的終點檢測方案，有報告提出了不同類型的RPA多靶標(biāo)檢測方法，包括針對病原體[64-66]、病毒[41]的檢測，以及針對SARS-CoV-2與其他呼吸道病毒的聯(lián)合檢測[67](表4)。一種基于紙芯片的裝置，通過在PES膜上劃分反應(yīng)區(qū)來實現(xiàn)用于3種食源性致病菌多靶標(biāo)檢測[64]，RPA反應(yīng)在培養(yǎng)基中進(jìn)行可以避免污染，紙封閉和膠帶封閉也可避免氣溶膠污染的產(chǎn)生，同時利用試紙閱讀器的終點定量分析[65]，提供了新的可視化方案。一種雙重檢測土拉弗朗西斯菌和鼠疫耶爾森菌RPA方法被成功提出[66]，該技術(shù)方案中在引物中加入特殊識別序列，能夠有效捕撈過量引物，最后采用橫向流動法對無過量引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。SARS-CoV-2感染與其他呼吸道病毒感染癥狀具有相似性，利用RPA結(jié)合測序建立的同時監(jiān)測SARS-CoV-2和多種呼吸道病毒合并感染的策略[67]，對于在疾病感染期間進(jìn)行有效診斷起到了促進(jìn)作用。針對多種原生動物的多重RPA測定方案也具有可行性[68]。總的來說，基于RPA檢測可以實現(xiàn)從單靶標(biāo)到多靶標(biāo)檢測，而且通過檢測設(shè)備等方面的不斷創(chuàng)新，利用重新設(shè)計引物和探針序列實現(xiàn)不同靶標(biāo)的檢測。但多重檢測中還需考慮靶標(biāo)負(fù)擔(dān)問題，需要針對檢測目的進(jìn)行條件優(yōu)化以提高反應(yīng)的靈敏度。

表4 多靶標(biāo)的RPA檢測Tab.4 Multi-target RPA detection

2.5 側(cè)流RPA

利用重組酶聚合酶擴(kuò)增聯(lián)合側(cè)流系統(tǒng)的病原體檢測是一個重要趨勢，用于HIV檢測的紙和塑料裝置[69]可以儲存RPA反應(yīng)所需凍干酶以及促進(jìn)反應(yīng)所需組分的混合，這是RPA側(cè)流檢測在設(shè)備上的突破之一。目前針對不同病原菌，包括假單胞菌[70-71]、大腸桿菌[57]、金黃色葡萄球菌[72]、副溶血性弧菌[73]、沙眼衣原體[74]、鯉科皰疹病毒2[75]、惡性瘧原蟲[76]等的RPA側(cè)流檢測都顯示了檢測特異性，有望被開發(fā)應(yīng)用于現(xiàn)場檢疫站甚至是居家檢測。產(chǎn)毒素真菌大多數(shù)具有比較強(qiáng)的致癌或致畸能力，是病原體監(jiān)測中的重要關(guān)注對象。側(cè)流RPA也被開發(fā)用于產(chǎn)毒鐮刀菌[43]、大豆疫霉病菌[45]、隱球菌病[42]的檢測，諸多報告表明了RPA具有重要的應(yīng)用潛力。在側(cè)流測定中比較重要的材料就是金納米粒子，其在樣品檢測線和對照線顯色上起到關(guān)鍵作用，但金納米粒子存在局限，比如在靈敏度和分辨率上存在不足。為了避免該不足，一種納米銪粒子橫向流動免疫結(jié)合RPA同時檢測單核增生李斯特菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌O157∶H7等致病菌的方法[77]被成功開發(fā)，該研究用熒光壽命長、熒光強(qiáng)度高的納米銪粒子代替膠體金作為標(biāo)記材料，有效提高了結(jié)果分析的靈敏度與定量分辨率。

2.6 RPA-CRISPR/Cas系統(tǒng)

CRISPR是生物體基因組編輯的強(qiáng)大工具之一，結(jié)合不同類型Cas內(nèi)切酶能準(zhǔn)確識別核酸序列，但對低水平序列無法做到有效識別，若結(jié)合上游核酸擴(kuò)增技術(shù)，再通過CRISPR/Cas對擴(kuò)增產(chǎn)物或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物識別切割[78-79]，就能夠?qū)崿F(xiàn)對低拷貝樣品的檢測，通過熒光團(tuán)和淬滅劑分離實現(xiàn)肉眼或儀器的結(jié)果判讀。RPA的擴(kuò)增溫度與Cas內(nèi)切酶的工作溫度接近，在上游擴(kuò)增技術(shù)中RPA無疑是一個良好選擇。RPA-CRISPR/Cas系統(tǒng)目前已被應(yīng)用于多種病原體檢測(表5)，包括寄生蟲[80-81]、致病菌[82-83]、病毒[49，84]等。

表5 RPA-CRISPR/Cas系統(tǒng)的病原體檢測Tab.5 Pathogen detection of RPA-CRISPR/Cas systems

利用RT-RPA-CRISPR/Cas12a的SARS-CoV-2檢測方法已被開發(fā)[49]，用DNA修飾金納米微粒比色，靶向ORF1 ab和N區(qū)，在擴(kuò)增時dsDNA結(jié)合激活Cas12a反式切割，被包裹的DNA底物被AuNPs水解表現(xiàn)為表面等離子體共振，通過紫外-可見光光譜和肉眼觀察，RPA-CRISPR/Cas12a協(xié)同檢測能有效避免出現(xiàn)其他冠狀病毒引起的假陽性。一種結(jié)合微推進(jìn)反應(yīng)器(Cas12a-MPR)[83]的檢測方案被成功建立，通過體系條件優(yōu)化，可以實現(xiàn)在同一反應(yīng)器中進(jìn)行CRISPR/Cas12a切割和RPA擴(kuò)增過程。從現(xiàn)有研究看，RPA-CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用快速、靈敏且具有良好的特異性，顯示出在病原體現(xiàn)場檢測的前景。

2.7 集成與微型化RPA檢測

大規(guī)模篩查能夠有效控制高傳染性疾病的傳播，而檢測過程的試劑消耗、檢測樣品量不足等問題有待解決?；赗PA的集成微型化設(shè)備如微芯片、微流控裝置提供了多樣化的檢測平臺，結(jié)合數(shù)字方法、生物傳感器在檢測中表現(xiàn)出不同優(yōu)勢?；赗PA的手提箱式實驗室也被成功開發(fā)用于檢測SARS-CoV-2[50]，該檢測具有良好擴(kuò)增性能，適用于資源有限的地區(qū)現(xiàn)場即時檢測。其他更加小巧便捷的設(shè)備也被開發(fā)用于SARS-CoV-2的檢測，Liu等[51]利用微流整合側(cè)流RPA設(shè)計了檢測設(shè)備，將RT-RPA與試紙檢測系統(tǒng)集成微流控芯片，在簡單的核酸提取之后反應(yīng)30 min就可得到結(jié)果，檢出限可達(dá)1拷貝。Fu等[85]成功建立了一種基于鏈霉親和素包被的金納米顆粒結(jié)合RPA的側(cè)流條狀生物傳感器檢測方案，該檢測利用智能手機(jī)和筆記本電腦就可以完成實驗結(jié)果數(shù)據(jù)的收集以及定量分析，可用于腸道沙門氏菌的臨床定量檢測。一種稱為PADLOCK的方法利用微流體實現(xiàn)液滴數(shù)字RPA(ddRPA)進(jìn)行核酸絕對定量[86]，微流體注射與液滴發(fā)生器耦合，通過MgOAc注射觸發(fā)反應(yīng)過程避免過早擴(kuò)增，實現(xiàn)精準(zhǔn)的定量，結(jié)合CRISPR/Cas13a系統(tǒng)表現(xiàn)出單分子檢測能力，體現(xiàn)出核酸定量的巨大前景。Luo等[87]報告了一種利用水凝膠納米流控芯片的數(shù)字RPA系統(tǒng)，能夠?qū)Σ≡w進(jìn)行絕對定量，應(yīng)用于單核細(xì)胞增多性李斯特菌的檢測限可達(dá)單拷貝，且能夠避免體系預(yù)擴(kuò)增導(dǎo)致的錯誤結(jié)果，并且提出了新的“隨機(jī)重疊理論”對核酸精準(zhǔn)定量。該操作相對簡單，整個過程快速(<10 min)，具有高靈敏度、高特異性以及抗抑制能力。集成與微型化設(shè)備的研究發(fā)明是RPA技術(shù)應(yīng)用于現(xiàn)場的關(guān)鍵，不同POC診斷工具應(yīng)用于現(xiàn)場檢測模式是否具有可行性還需要證明，但RPA本身對于環(huán)境條件的低需求以及擴(kuò)增上的優(yōu)勢使其在現(xiàn)場應(yīng)用上具有較大的潛力。

3 展望

基于核酸的病原體檢測技術(shù)在不斷發(fā)展，相較傳統(tǒng)的PCR技術(shù)及其他核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)，RPA不需要昂貴裝置，對溫度要求低，反應(yīng)時間短，可以在資源有限的地區(qū)實現(xiàn)快速檢測的目的，但目前RPA技術(shù)在現(xiàn)場即時檢測的實際應(yīng)用還比較少，未來還可能在以下方面有進(jìn)一步突破：①結(jié)合RPA技術(shù)的特點，設(shè)計更為巧妙的裝置實現(xiàn)對于病原體的單重和多重檢測，使結(jié)果判定更簡便、直觀，例如類似于保溫杯的加熱裝置或者一些手提式設(shè)備等都可以為未來的相關(guān)研究提供思路；②最重要的是成本問題，任何需要被普遍利用的技術(shù)都需要考慮成本效應(yīng)，目前的RPA技術(shù)大多直接利用商品化的試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，在成本上是一個比較大的問題，因此，如果能夠在未來研發(fā)出更為低廉、高效的相應(yīng)試劑和酶制劑，就能夠解決根本上的商業(yè)成本受限問題等，給病原體核酸檢測帶來新的可能。