楊陽，何巧玉

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（PTSD）是一種嚴(yán)重的心理障礙疾病，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜且目前對(duì)其的治療方式有限［1-2］。因此，有必要探索干預(yù)、治療和預(yù)防PTSD的新方法。PTSD患者伴有各種心理和行為異常，其中認(rèn)知功能障礙較為常見，故改善PTSD患者認(rèn)知功能一直是主要的治療目標(biāo)［3］。丹酚酸（Sal）作為一種從丹參中提取的天然化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學(xué)活性。Sal A 可通過抑制神經(jīng)炎癥和神經(jīng)細(xì)胞凋亡減輕慢性腦缺血引起的大鼠認(rèn)知功能障礙［4］；Sal B 能夠通過多種機(jī)制改善阿爾茨海默病導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙［5］。但Sal 能否有效改善PTSD 誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙以及其相關(guān)機(jī)制至今仍未知。研究表明，糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）/β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）信號(hào)通路在學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知損傷的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用［6］。此外，長(zhǎng)期給予Sal A 可通過激活Wnt3a/GSK-3β/β-Catenin信號(hào)通路抑制缺血性卒中大鼠的神經(jīng)元凋亡并改善神經(jīng)功能［7］；Sal B 能夠通過促進(jìn)GSK-3β 磷酸化同時(shí)抑制β-Catenin磷酸化，從而促進(jìn)神經(jīng)元分化與增殖［8］。本研究以丹參中含量豐富、生物活性強(qiáng)的水溶性化合物Sal B 為干預(yù)藥物，初步探討Sal B 對(duì)PTSD 模型大鼠認(rèn)知功能的影響以及GSK-3β/β-Catenin 信號(hào)通路在此過程中的作用，以期為PTSD防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～7 周齡SPF 級(jí)健康雄性Wistar 大鼠60只，體質(zhì)量190～210 g，購自北京北方艾特生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2020-0005。大鼠在溫度23～25 ℃、12 h光/暗循環(huán)、相對(duì)濕度50%～55%的動(dòng)物房?jī)?nèi)統(tǒng)一飼養(yǎng)，自由攝食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》中的相關(guān)要求，按照3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 藥物、主要試劑與儀器 Sal B（純度HPLC≥98%）、Nissl 染色液（焦油紫法）購自北京索萊寶科技有限公司；GSK-3β抑制劑CHIR-99021，純度99.71%，購自美國(guó)MCE公司；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；兔抗鼠裂解的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）、B細(xì)胞淋巴瘤基因-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β，Ser9）一抗抗體購自美國(guó)Invitrogen 公司；兔抗鼠原癌基因（c-Myc）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、總GSK-3β（t-GSK-3β）、總β-Catenin（t-β-Catenin）、磷酸化β-Catenin（p-β-Catenin）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）一抗抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗購自英國(guó)Abcam 公司；超敏ECL底物液購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。EthoVision XT 動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)購自荷蘭Noldus公司；曠場(chǎng)箱（100 cm×100 cm×40 cm）購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；生物顯微鏡（BX53 型）購自日本Olympus 公司；凝膠成像分析系統(tǒng)（WD-9413C 型）購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PTSD 大鼠模型構(gòu)建 采用單一延長(zhǎng)應(yīng)激（single prolonged stress，SPS）法構(gòu)建PTSD 大鼠模型［9-10］。將大鼠置于有機(jī)玻璃制成的束縛裝置中固定束縛2 h，然后置于透明的圓柱形玻璃容器，高50 cm，直徑35 cm，水深35 cm，水溫23～25 ℃，強(qiáng)迫游泳20 min；隨后，取出大鼠并擦干，使其休息15 min后使用乙醚麻醉1～2 min，直到失去意識(shí)；待大鼠清醒后放回籠中飼養(yǎng)。若大鼠出現(xiàn)毛發(fā)豎立、警覺性增高、聚集蜷縮、易激惹等應(yīng)激現(xiàn)象，則視為造模成功［11］。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 60 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、PTSD組、Sal B低劑量組、Sal B高劑量組和GSK-3β 抑制劑組，每組12 只。除正常組外，其余組大鼠均構(gòu)建PTSD 模型。Sal B 低、高劑量組分別灌胃10、20 mg/kg Sal B［12］；GSK-3β 抑制劑組灌胃30 mg/kg CHIR-99021，研究前期已通過預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)30 mg/kg CHIR-99021對(duì)正常飼養(yǎng)大鼠無明顯毒性作用；正常組、PTSD組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。

1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 給藥結(jié)束后，通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠自主活動(dòng)能力和探索行為能力。將大鼠放入1個(gè)100 cm×100 cm×40 cm 的黑色曠場(chǎng)箱中，箱子底部平分為25 個(gè)方格，正上方放置1個(gè)攝像機(jī)，視野可覆蓋整個(gè)場(chǎng)箱內(nèi)部。觀察大鼠活動(dòng)情況，記錄5 min內(nèi)大鼠的爬行格數(shù)，4爪均進(jìn)入方格才計(jì)數(shù)；站立次數(shù)，大鼠后肢直立，前肢離開地面≥1 cm 的次數(shù)；采用EthoVision XT 動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)測(cè)定運(yùn)動(dòng)總距離。實(shí)驗(yàn)過程保持安靜，每只大鼠從中間格放入，每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用75%乙醇擦拭場(chǎng)箱內(nèi)部以消除其殘留氣味。

1.2.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。將直徑160 cm、水深30 cm、水溫22～24 ℃的圓形水池平分為4個(gè)象限，并在其中1個(gè)象限中放入1個(gè)直徑10 cm的平臺(tái)，位于水面1 cm以下，水池上方安裝攝像機(jī)。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)。訓(xùn)練大鼠從每個(gè)象限的正中間出發(fā)尋找平臺(tái)，記錄大鼠自每個(gè)象限出發(fā)找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期，若大鼠未能在120 s 內(nèi)找到平臺(tái)，則進(jìn)行引導(dǎo)，并將逃避潛伏期記為120 s，連續(xù)訓(xùn)練4 d，4次/d，結(jié)果取平均值。為了保證大鼠的體力，應(yīng)使每次游泳時(shí)間間隔≥10 min。（2）空間探索試驗(yàn)。于第5天撤去平臺(tái)，將大鼠從同一位點(diǎn)放入水中，記錄大鼠120 s 內(nèi)跨越原平臺(tái)次數(shù)以及首次跨越原平臺(tái)時(shí)間。

1.2.5 海馬組織Nissl染色 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組按隨機(jī)數(shù)字表法取大鼠6 只，腹腔注射10%水合氯醛使其麻醉，使用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流固定后摘取完整大腦，4%多聚甲醛固定24 h 后進(jìn)行脫水、透明和石蠟包埋，制備常規(guī)腦組織石蠟切片，厚4μm。腦組織石蠟切片脫蠟至水，將切片浸入Nissl染色液中室溫孵育15 min，蒸餾水沖洗后70%乙醇分色，隨后脫水、透明、封片后置于顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)及數(shù)目變化，尼氏小體呈紫色，細(xì)胞核呈淡紫色。

1.2.6 海馬組織TUNEL染色 將1.2.5制備的腦組織石蠟切片脫蠟至水后滴加TUNEL 反應(yīng)混合液37 ℃孵育1 min，PBS洗滌后DAB 顯色，蘇木素襯染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照，TUNEL染色陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，任選5個(gè)視野計(jì)數(shù)TUNEL染色陽性細(xì)胞和總細(xì)胞，結(jié)果取平均值。以TUNEL 染色陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示神經(jīng)元凋亡率（%）。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)海馬組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 每組剩余6只大鼠麻醉后處死，小心剝離海馬組織，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液于冰上充分裂解，離心取上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離等量變性蛋白（上樣量20μg），隨后將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h 后于兔抗鼠cleaved caspase-3、Bax、c-Myc、Cyclin D1、t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-β-Catenin、p-β-Catenin、GAPDH 一抗稀釋液中4 ℃孵育過夜，稀釋比例為1∶1 000，PBS洗滌后于對(duì)應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗稀釋液中室溫孵育1.5 h，稀釋比例為1∶20 000，PBS 洗滌后ECL 顯色。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH灰度值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為學(xué)比較 與正常組比較，PTSD 組大鼠爬行格數(shù)、站立次數(shù)和運(yùn)動(dòng)總距離減少（P＜0.05）；與PTSD 組比較，Sal B 低、高劑量組和GSK-3β 抑制劑組爬行格數(shù)、站立次數(shù)和運(yùn)動(dòng)總距離增多（P＜0.05）；與Sal B低劑量組比較，Sal B高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠爬行格數(shù)、站立次數(shù)和運(yùn)動(dòng)總距離增多（P＜0.05）；Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠爬行格數(shù)、站立次數(shù)和運(yùn)動(dòng)總距離比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the number of crawling cells,standing times and total distance of exercise in open field experiment between the five groups of rats表1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中爬行格數(shù)、站立次數(shù)和運(yùn)動(dòng)總距離比較（n=12，）

Tab.1 Comparison of the number of crawling cells,standing times and total distance of exercise in open field experiment between the five groups of rats表1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中爬行格數(shù)、站立次數(shù)和運(yùn)動(dòng)總距離比較（n=12，）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與PTSD 組比較，c與Sal B 低劑量組比較，P＜0.05。表2—6同。

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F爬行格數(shù)/個(gè)76.33±4.68 48.21±3.95a 61.83±4.40b 72.50±4.06bc 69.58±4.12bc 82.233＊＊站立次數(shù)/次14.25±1.46 5.17±0.85a 9.08±1.02b 12.47±1.25bc 11.67±1.18bc 108.915＊＊運(yùn)動(dòng)總距離/cm 2 436.18±90.29 1 059.67±52.43a 1 836.29±71.85b 2 345.35±83.86bc 2 308.42±89.27bc 635.255＊＊

2.2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)比較 與正常組比較，PTSD 組大鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺(tái)時(shí)間延長(zhǎng)，跨越原平臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.05）；與PTSD 組比較，Sal B 低、高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺(tái)時(shí)間縮短，跨越原平臺(tái)次數(shù)增多（P＜0.05）；與Sal B低劑量組比較，Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺(tái)時(shí)間縮短，跨越原平臺(tái)次數(shù)增多（P＜0.05）；Sal B高劑量組和GSK-3β抑制劑組大鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺(tái)時(shí)間和跨越原平臺(tái)次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2、3。

Tab.2 Comparison of escape latency in Morris water maze experiment between the five groups of rats表2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期比較（n=12，s，）

Tab.2 Comparison of escape latency in Morris water maze experiment between the five groups of rats表2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期比較（n=12，s，）

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F 1 d 31.59±4.42 75.64±6.83a 56.78±5.97b 43.15±5.62bc 46.06±4.98bc 104.545＊＊2 d 23.47±4.03 70.95±6.92a 49.26±5.84b 35.24±5.16bc 37.58±5.34bc 126.256＊＊組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F 3 d 15.26±3.15 67.08±6.54a 41.65±5.23b 30.57±4.31bc 33.19±4.58bc 182.284＊＊4 d 8.95±2.64 61.24±6.71a 33.17±4.38b 24.97±3.97bc 27.12±3.65bc 217.942＊＊

Tab.3 Comparison of the times of crossing the original platform and the time of crossing the original platform for the first time in Morris water maze experiment between the five groups of rats表3 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中跨越原平臺(tái)次數(shù)和首次跨越原平臺(tái)時(shí)間比較 （n=12，）

Tab.3 Comparison of the times of crossing the original platform and the time of crossing the original platform for the first time in Morris water maze experiment between the five groups of rats表3 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中跨越原平臺(tái)次數(shù)和首次跨越原平臺(tái)時(shí)間比較 （n=12，）

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F跨越原平臺(tái)次數(shù)/次9.25±1.38 3.42±0.85a 4.83±0.96b 7.67±1.25bc 7.00±1.04bc 51.921＊＊首次跨越原平臺(tái)時(shí)間/s 10.68±1.29 39.45±3.18a 27.84±2.86b 19.07±1.95bc 21.31±2.42bc 233.936＊＊

2.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)變化 Nissl 染色后光鏡下可見正常組大鼠海馬神經(jīng)元輪廓清晰，排列整齊，染色均勻，核大而圓，尼氏小體豐富；與正常組比較，PTSD 組大鼠海馬神經(jīng)元受損，表現(xiàn)為外形不規(guī)則、排列紊亂且存在不同程度萎縮以及尼氏小體數(shù)量減少等；與PTSD 組比較，Sal B 低劑量組、Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬神經(jīng)元損傷均有不同程度改善，其中Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬神經(jīng)元損傷改善程度幾乎相近，且均優(yōu)于Sal B低劑量組，見圖1。

Fig.1 Pathological changes of hippocampal neurons in each group(Nissl staining,×200)圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)變化（Nissl染色，×200）

2.4 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率以及海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，PTSD組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與PTSD 組比較，Sal B 低劑量組、Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與Sal B低劑量組比較，Sal B高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；Sal B高劑量組和GSK-3β抑制劑組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、3，表4。

Fig.2 Apoptosis of hippocampal neurons in each group(TUNEL staining,×200)圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況（TUNEL染色，×200）

Fig.3 The expression of Bax and cleaved caspase-3 protein in hippocampus of each group detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

Tab.4 Comparison of apoptosis rate of hippocampal neurons and expression levels of Bax and cleaved caspase-3 in hippocampal tissue between the five groups of rats表4 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of apoptosis rate of hippocampal neurons and expression levels of Bax and cleaved caspase-3 in hippocampal tissue between the five groups of rats表4 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（n=6，）

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F神經(jīng)元凋亡率/%5.89±0.96 57.26±7.85a 32.17±5.43b 20.42±2.56bc 22.05±3.18bc 100.345＊＊Bax 0.18±0.04 0.79±0.06a 0.51±0.06b 0.29±0.05bc 0.32±0.06bc 115.510＊＊cleaved caspase-3 0.27±0.05 0.92±0.08a 0.63±0.06b 0.41±0.05bc 0.45±0.07bc 94.342＊＊

2.5 各組大鼠海馬組織中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子Cyclin D1、c-Myc 蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，PTSD 組大鼠海馬組織中Cyclin D1、c-Myc 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與PTSD 組比較，Sal B 低劑量組、Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬組織中Cyclin D1、c-Myc 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與Sal B 低劑量組比較，Sal B 高劑量組和GSK-3β抑制劑組海馬組織中Cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；Sal B 高劑量組和GSK-3β抑制劑組海馬組織中Cyclin D1、c-Myc 蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4，表5。

Fig.4 The expression of Cyclin D1 and c-Myc protein in hippocampal tissue of rats in each group detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬組織中Cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)

Tab.5 Comparison of protein expression levels of c-Myc and Cyclin D1 in hippocampal tissue between the five groups of rats表5 各組大鼠海馬組織中c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平比較（n=6，）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of c-Myc and Cyclin D1 in hippocampal tissue between the five groups of rats表5 各組大鼠海馬組織中c-Myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平比較（n=6，）

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F Cyclin D1 0.69±0.06 0.23±0.04a 0.40±0.05b 0.54±0.05bc 0.51±0.06bc 63.761＊＊c-Myc 0.57±0.05 0.18±0.03a 0.35±0.03b 0.46±0.04bc 0.42±0.05bc 74.750＊＊

2.6 各組大鼠海馬組織中GSK-3β/β-Catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，PTSD組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-β-Catenin 蛋白表達(dá)水平升高，p-GSK-3β、t-β-Catenin 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與PTSD組比較，Sal B低劑量組、Sal B 高劑量組和GSK-3β 抑制劑組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-β-Catenin 蛋白表達(dá)水平降低，p-GSK-3β、t-β-Catenin 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與Sal B 低劑量組比較，Sal B 高劑量組和GSK-3β抑制劑組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-β-Catenin 蛋白表達(dá)水平降低，p-GSK-3β、t-β-Catenin 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；Sal B高劑量組和GSK-3β抑制劑組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-β-Catenin、p-β-Catenin 蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5，表6。

Fig.5 The expression of t-GSK-3β,p-GSK-3β,t-β-Catenin and pβ-Catenin in hippocampal tissue of rats in each group detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-β-Catenin、p-β-Catenin蛋白表達(dá)情況

Tab.6 Comparison of protein expression levels of t-GSK-3β,p-GSK-3β,t-β-Catenin and p-β-Catenin in hippocampal tissue between the five groups of rats表6 各組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-β-Catenin、p-β-Catenin蛋白表達(dá)水平比較（n=6，）

Tab.6 Comparison of protein expression levels of t-GSK-3β,p-GSK-3β,t-β-Catenin and p-β-Catenin in hippocampal tissue between the five groups of rats表6 各組大鼠海馬組織中t-GSK-3β、p-GSK-3β、t-β-Catenin、p-β-Catenin蛋白表達(dá)水平比較（n=6，）

組別正常組PTSD組Sal B低劑量組Sal B高劑量組GSK-3β抑制劑組F t-GSK-3β 0.15±0.03 0.78±0.06a 0.54±0.05b 0.37±0.04bc 0.34±0.04bc p-GSK-3β 0.61±0.05 0.18±0.03a 0.35±0.04b 0.45±0.04bc 0.47±0.05bc t-β-Catenin 0.79±0.05 0.23±0.04a 0.51±0.05b 0.65±0.05bc 0.66±0.06bc p-β-Catenin 0.18±0.03 0.67±0.06a 0.49±0.05b 0.35±0.04bc 0.33±0.05bc 165.088＊＊83.802＊＊107.528＊＊92.378＊＊

3 討論

有循證依據(jù)的心理療法是PTSD 的一線治療方法，認(rèn)知行為療法是其主要療法，包括延長(zhǎng)暴露（實(shí)地暴露和想象暴露）、認(rèn)知加工療法、眼動(dòng)脫敏和再加工等。血清素再攝取抑制劑是PTSD 的一線治療藥物，通常與其他治療干預(yù)措施聯(lián)合使用［3］。但現(xiàn)有的治療方式周期長(zhǎng)、見效慢，用于PTSD 臨床治療的藥物仍十分有限，且存在不良反應(yīng)。因此，進(jìn)一步探究PTSD發(fā)病機(jī)制并開發(fā)新的PTSD治療藥物具有重大意義。基于動(dòng)物模型尋找治療藥物或治療靶點(diǎn)是PTSD 研究的一大熱點(diǎn)［13-14］。本研究通過SPS 法構(gòu)建了PTSD 大鼠模型，結(jié)果顯示，相比于正常飼養(yǎng)大鼠，PTSD模型大鼠爬行格數(shù)、站立次數(shù)、運(yùn)動(dòng)總距離、跨越原平臺(tái)次數(shù)減少，逃避潛伏期、首次跨越原平臺(tái)時(shí)間延長(zhǎng)，表明模型大鼠自主活動(dòng)能力、探索行為能力和學(xué)習(xí)記憶能力受到損害，即存在一定認(rèn)知功能障礙。此外，海馬與PTSD認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，且海馬神經(jīng)元凋亡、損傷也是PTSD模型中神經(jīng)病理學(xué)變化的主要特征［15-16］。本研究中，Nissl 染色后觀察可見PTSD 模型大鼠海馬神經(jīng)元嚴(yán)重受損；此外，海馬神經(jīng)元凋亡率以及海馬組織中促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3 表達(dá)水平升高，而細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子Cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)水平降低，表明PTSD 模型大鼠存在海馬神經(jīng)元凋亡、損傷等病理變化，與既往研究結(jié)果［15-16］一致。同時(shí)以上研究結(jié)果提示PTSD大鼠模型構(gòu)建成功，可用于藥物治療效果研究。

近年來，中醫(yī)藥用于PTSD 治療受到廣泛關(guān)注。Sal B 作為一種來源于丹參干燥根和根莖的重要天然產(chǎn)物，既是丹參的主要生物活性成分之一，也是Sal類的代表成分，其抗氧化［17］、抗癌［18］、抗神經(jīng)元凋亡［19］等作用已被證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，給予10 mg/kg、20 mg/kg Sal B 治療后，PTSD 模型大鼠自主活動(dòng)能力、探索行為能力、學(xué)習(xí)記憶能力以及海馬神經(jīng)元損傷程度均有所改善，同時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡率以及海馬組織中Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)降低，Cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)水平升高，且20 mg/kg的作用效果優(yōu)于10 mg/kg。Sal B 能夠減輕PTSD 模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡、損傷并改善大鼠認(rèn)知功能障礙。Yu 等［20］研究顯示Sal B 可通過激活A(yù)KT/CREB/BDNF 信號(hào)通路在戊四唑誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型中發(fā)揮抗驚厥和抗細(xì)胞神經(jīng)元凋亡作用。Zhao等［21］研究表明，Sal B能夠通過抑制氧化應(yīng)激和恢復(fù)線粒體功能來防止1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。但Sal B在PTSD模型大鼠中的作用機(jī)制仍有待明確。

研究證實(shí)，腦內(nèi)GSK-3β/β-Catenin 信號(hào)通路調(diào)控異常與阿爾茨海默?。?2］、帕金森?。?3］等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和病情進(jìn)展密切相關(guān)，且抑制GSK-3β 活性可改善由多種疾病引起的認(rèn)知功能障礙［24-25］。GSK-3β/β-Catenin 信號(hào)通路中，GSK-3β、β-Catenin均在胞質(zhì)中以磷酸化和非磷酸化2種形式存在，GSK-3β 磷酸化后活性受到抑制，失活的GSK-3β不能再使β-Catenin磷酸化，導(dǎo)致β-Catenin在胞質(zhì)內(nèi)大量聚集并進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞增殖、分化等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，如Cyclin D1、c-Myc等［26］。本研究顯示，PTSD模型大鼠海馬中t-GSK-3β、p-β-Catenin 蛋白表達(dá)水平升高，p-GSK-3β、t-β-Catenin蛋白表達(dá)水平降低，表明海馬中GSK-3β/β-Catenin信號(hào)通路參與PTSD 發(fā)生。而給予Sal B 治療后，PTSD 模型大鼠海馬中t-GSK-3β、p-β-Catenin 蛋白表達(dá)水平降低，p-GSK-3β、t-β-Catenin 蛋白表達(dá)水平升高，提示Sal B 可能通過降低PTSD 模型大鼠海馬中GSK-3β 活性，增加β-Catenin 活性，進(jìn)而誘導(dǎo)Cyclin D1、c-Myc 蛋白表達(dá)，同時(shí)抑制Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)元存活、分化以及抑制其凋亡作用。據(jù)報(bào)道，Sal B可通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路減少神經(jīng)元凋亡并促進(jìn)神經(jīng)元存活，從而在脊髓損傷大鼠模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［27］。CHIR-99021既是一種高度特異性、安全且有效的GSK-3β 抑制劑，也是一種有效的Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路激活劑［28-29］。本研究顯示，CHIR-99021 對(duì)PTSD 模型大鼠海馬中GSK-3β/β-Catenin信號(hào)通路以及神經(jīng)元凋亡、損傷和認(rèn)知功能障礙的作用效果接近于20 mg/kg Sal B，并優(yōu)于10 mg/kg Sal B。這進(jìn)一步證實(shí)了Sal B減輕PTSD模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡、損傷并改善認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制與調(diào)節(jié)GSK-3β/β-Catenin信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，Sal B 能夠減輕PTSD 模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡、損傷并改善認(rèn)知功能障礙，抑制GSK-3β/β-Catenin 信號(hào)通路，且調(diào)節(jié)GSK-3β/β-Catenin信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制之一（圖6）。本研究為PTSD防治提供了新的見解，但存在指標(biāo)檢測(cè)方法單一等局限性，有待后續(xù)進(jìn)一步補(bǔ)充與完善。

Fig.6 Signal path diagram of Sal B圖6 Sal B的信號(hào)通路圖