姜忠敏，張春艷，劉敏，鄭潔，李艷霞，仁青措，孟緯，劉曉智△

微乳頭型肺腺癌是肺癌中的罕見(jiàn)病理亞型之一，其在肺癌的發(fā)生率不超過(guò)3%。微乳頭型肺腺癌在病灶早期即出現(xiàn)廣泛淋巴管癌栓，易侵犯胸膜，并發(fā)生骨轉(zhuǎn)移［1］，從而導(dǎo)致患者手術(shù)及化療效果不佳，預(yù)后極差［2］。因此，尋找提高此類患者療效的新方法勢(shì)在必行。腫瘤類器官能夠高度還原腫瘤親本組織的遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征［3］，極大地縮短化療藥物或靶向藥物的篩選時(shí)間［4］，提高個(gè)體化治療精度。然而，目前針對(duì)不同病理亞型的肺癌類器官的培養(yǎng)基的研發(fā)及相應(yīng)靶向藥物的篩選仍處于起步階段，尚少見(jiàn)微乳頭型肺腺癌類器官培養(yǎng)及靶向藥物篩選的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究嘗試從1 例確診為微乳頭型肺腺癌患者手術(shù)切除組織中提取和培養(yǎng)原代肺腺癌類器官，并基于其基因突變表型，篩選出潛在的靶向治療藥物，再以上述肺腺癌類器官為研究對(duì)象，選出抑瘤效果最佳的靶向藥物，為臨床醫(yī)師提供治療參考。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌類器官培養(yǎng)基、原代組織保存液（伯楨生物），消化液Ⅰ（創(chuàng)芯國(guó)際），Hanks'平衡鹽溶液（HBSS，美國(guó)Gibco 公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色液（武漢賽維爾公司）；環(huán)保脫蠟液（珠海貝索生物），無(wú)水乙醇（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠），甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor-l，TTF-1）抗體、角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）抗體、新天冬氨酸蛋白酶A（Napsin A）抗體和Ki67 抗體（北京中山金橋）；核酸提取試劑盒、基因檢測(cè)試劑盒（廈門(mén)艾德生物）；塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼（美國(guó)MedChem Express 公司）；alamarBlueTM細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）。

1.2 病例信息 患者，女，53歲，主因體檢發(fā)現(xiàn)肺部占位7 d入院。既往無(wú)高血壓、糖尿病病史，無(wú)肺結(jié)核、肝炎等傳染病史，否認(rèn)吸煙史。胸CT 示右下肺占位性病變，大小約2 cm×2 cm。其中，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和細(xì)胞角蛋白19 片段（CYFRA21-1）分別為1.42μg/L和3.35μg/L。病理診斷為肺腺癌，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Ki67、Napsin A、TTF-1、CK7和CD31均呈陽(yáng)性，其中微乳頭型（40%）、乳頭型（30%）、腺泡型（20%）、貼壁型（10%），侵及胸膜下，并見(jiàn)支氣管侵犯和氣腔播散，可見(jiàn)脈管內(nèi)癌栓。

1.3 腫瘤樣本的收集 本研究方案得到天津市第五中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（WZX-EC-KY2022028）。在患者知情同意的前提下，從術(shù)中切除的肺腺癌標(biāo)本中提取腫瘤組織。為避免腫瘤組織污染及蛋白降解，手術(shù)標(biāo)本離體后用無(wú)菌生理鹽水沖洗3次，于離體30 min內(nèi)獲取0.4 cm×0.4 cm的新鮮腫瘤組織2塊。將腫瘤組織放入適量冰冷的原代組織保存液中，于2～3 h內(nèi)低溫（4 ℃）轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行原代提取、分離。

1.4 微乳頭型肺腺癌類器官的提取、分離與培養(yǎng) 將腫瘤組織轉(zhuǎn)移到生物安全柜中，用冰冷HBSS 洗滌樣品3 次。對(duì)照HE染色結(jié)果，認(rèn)真判別組織塊中微乳頭型肺腺癌區(qū)域，用無(wú)菌眼科剪剪成約0.5 mm3的碎塊。根據(jù)組織量加入適量消化液，于37 ℃培養(yǎng)箱消化約30 min，用1 mL 槍頭充分吹散，直至組織塊全部順利進(jìn)出槍頭后終止消化。將消化后的組織細(xì)胞懸液經(jīng)100μm細(xì)胞過(guò)濾器研磨過(guò)濾。取過(guò)濾后的細(xì)胞少許，用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力。當(dāng)細(xì)胞活力達(dá)80%以上時(shí)，濾液以200×g低溫離心3 min。將細(xì)胞沉淀物于冰上用適量Matrigel 重懸，混勻，接種于24 孔板中，37 ℃培養(yǎng)箱放置15 min。最后加入肺癌類器官培養(yǎng)基觀察。

1.5 微乳頭型肺腺癌類器官的鑒定

1.5.1 HE 染色 收集適量微乳頭型肺腺癌類器官，經(jīng)瓊脂糖預(yù)包埋后于4%多聚甲醛中固定1 h。將固定后的類器官與親本組織經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片后行HE染色和免疫組化染色。以上石蠟切片依次放入環(huán)保脫蠟液中進(jìn)行3次脫蠟，2次置入無(wú)水乙醇后在95%、90%、80%、70%乙醇和蒸餾水中各浸泡5 min。隨后將切片置于蘇木精溶液中染色5 min 后流水沖洗。再用0.5%鹽酸乙醇分化30 s，流水沖洗0.5 h，伊紅染色3 min，流水沖洗30 min。將切片放入95%乙醇中浸泡2次，各5 min，再放入無(wú)水乙醇中浸泡2次，各5 min，使其徹底脫水。脫水后的切片依次放入環(huán)保脫蠟液浸泡3次，每次5 min，透明后取出，晾干后滴加中性樹(shù)膠封片。

1.5.2 免疫組化染色及評(píng)分 將HE染色后的類器官與親本組織用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行高壓熱修復(fù)抗原。將樣品用H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，隨后經(jīng)封閉、一抗（TTF-1、Napsin A、CK7、p63）工作液和二抗工作液孵育后，用DAB 顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水、透明后封片即可鏡下觀察。評(píng)分方法：每張切片隨機(jī)讀取10個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野數(shù)100個(gè)細(xì)胞，首先按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分，≤4%為0分；5%～25%為1 分；26%～50%為2 分；51%～75%為3 分；≥76%為4 分。然后按染色強(qiáng)度評(píng)分：不著色為0分；黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3 分。兩者乘積數(shù)作為總評(píng)分，≥4 分為高表達(dá)，≤3分為低表達(dá)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚核酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)基因突變 提取類器官與親本組織核酸，反轉(zhuǎn)錄后按照基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)親本癌組織和微乳頭型肺腺癌類器官中基因突變情況。檢測(cè)指標(biāo)：間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、c-ros 肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene 1-receptor tyrosine kinase，ROS1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶受體Ret（proto-oncogene tyrosineprotein kinase receptor Ret，RET）融合基因聯(lián)合檢測(cè)，及表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、KRAS、神經(jīng)母細(xì)胞瘤RAS病毒癌基因同源物（Neuroblastoma RAS Viral Oncogene Homolog，NRAS）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基p110α（PIK3CA）、BRAF、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，Met）基因突變聯(lián)合檢測(cè)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性25 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，36 個(gè)循環(huán)。每份樣本與陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照樣本同步上機(jī)分析。隨后通過(guò)SLAN全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)8.2.2計(jì)算Ct值，并得出樣本結(jié)論。

1.7 靶向藥物治療與半數(shù)致死劑量（IC50）檢測(cè) 基于以上基因檢測(cè)結(jié)果及基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)推薦的靶向藥物，選擇3種靶向RET融合的藥物塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼，使用alamarBlueTM細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。微乳頭型肺腺癌類器官培養(yǎng)3 d 后加入梯度濃度的藥物（塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼的濃度分別為0.001、0.01、0.1、1、5、10、20、40、60和80μmol/L）干預(yù)，48 h后在培養(yǎng)基中加入終濃度為10%的活性試劑，繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，于酶標(biāo)儀檢測(cè)其在波長(zhǎng)570 nm和參考波長(zhǎng)600 nm處的光密度（OD）值。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照（無(wú)細(xì)胞）組、陰性對(duì)照（未經(jīng)處理細(xì)胞）組及DMSO 溶劑對(duì)照組。最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)量各種靶向藥物對(duì)微乳頭型肺腺癌類器官的IC50。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，2組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微乳頭型肺腺癌類器官的生長(zhǎng)狀態(tài) 原代培養(yǎng)第2天可見(jiàn)折光性強(qiáng)的微小克隆球形成；第4天可見(jiàn)克隆球體積進(jìn)一步增大，其間可見(jiàn)蜂窩狀細(xì)胞間隔；第12 天可見(jiàn)克隆球直徑超過(guò)60 μm，周長(zhǎng)達(dá)到200μm，克隆球截面面積超過(guò)4 000μm2；第14天進(jìn)行首次細(xì)胞傳代，至第2代及第3代腫瘤細(xì)胞克隆球長(zhǎng)勢(shì)良好，未見(jiàn)明顯老化與凋亡，見(jiàn)圖1。

Fig.1 Culture of micropapillary lung adenocarcinoid organoid圖1 微乳頭型肺腺癌類器官的培養(yǎng)

2.2 微乳頭型肺腺癌類器官的表型鑒定 HE染色結(jié)果顯示，腫瘤親本組織中，腫瘤腺腔內(nèi)可見(jiàn)簇狀、絲狀乳頭，乳頭無(wú)纖維血管軸心，腫瘤細(xì)胞體積較大，胞漿嗜酸，核漿比高，胞核中-重度異型；微乳頭型肺腺癌類器官中，腫瘤細(xì)胞胞體較大，胞漿嗜酸，核漿比高，可見(jiàn)中-重度異型胞核。兩者細(xì)胞形態(tài)高度相似。免疫組化及評(píng)分結(jié)果顯示，微乳頭型肺腺癌類器官中TTF-1、CK7、Napsin A 和Ki67 的蛋白表達(dá)水平與腫瘤親本組織基本一致，見(jiàn)圖2、表1。

Tab.1 Analysis of immunohistochemical result score表1 免疫組化結(jié)果評(píng)分分析

Fig.2 HE staining and immunohistochemistry experiments identify the phenotype of micropapillary lung adenocarcinoma organoid圖2 HE染色及免疫組化實(shí)驗(yàn)鑒定微乳頭型肺腺癌類器官的表型

2.3 基因突變檢測(cè)結(jié)果 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，微乳頭型肺腺癌親本組織樣本和類器官的突變基因結(jié)果一致，均體現(xiàn)為RET 融合陽(yáng)性，見(jiàn)圖3。其余ALK、ROS1 融合基因檢測(cè)及EGFR、KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF、HER2、Met基因突變檢測(cè)均為陰性。

Fig.3 The detection results of RET fusion genes in parental tissue and its organoid圖3 腫瘤親本組織和類器官RET融合基因檢測(cè)結(jié)果

2.4 受試靶向藥物IC50檢測(cè)結(jié)果 3 種靶向RET 融合的受試藥物塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼的IC50檢測(cè)結(jié)果分別為59.71、42.87、10.02 μmol/L，凡德他尼對(duì)該例微乳頭型肺腺癌類器官的抑瘤效果最為明顯，見(jiàn)圖4。

Fig.4 IC50 results of target drugs圖4 受試靶向藥物IC50檢測(cè)結(jié)果

3 討論

肺腺癌的演進(jìn)歷程一般包括腺瘤樣增生—原位腺癌—微浸潤(rùn)腺癌—浸潤(rùn)腺癌4 個(gè)階段，其中浸潤(rùn)腺癌中又包含貼壁型、腺泡型、乳頭型、實(shí)體型、微乳頭型病理亞型［5］。就復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)而言，貼壁型肺腺癌為低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，腺泡型和乳頭型肺腺癌為中等復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，而微乳頭與實(shí)體型肺腺癌為高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［6］。我國(guó)微乳頭型肺腺癌的發(fā)生率低于2%，屬于相對(duì)罕見(jiàn)類型［7］。其具有小病灶，大轉(zhuǎn)移，多數(shù)發(fā)現(xiàn)時(shí)即為晚期，術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間短等特點(diǎn)［8］。研究表明，即使微乳頭型腫瘤細(xì)胞成分只有1%，也會(huì)嚴(yán)重影響患者的生存［9］。因此，在肺腺癌的各種病理亞型中，微乳頭型被認(rèn)為是預(yù)后最差的病理類型［10］，而靶向微乳頭型腫瘤細(xì)胞亞群的治療尤為關(guān)鍵。

近年來(lái)，人源性腫瘤類器官的成功培養(yǎng)為腫瘤患者靶向藥物的篩選和精準(zhǔn)治療提供了重要實(shí)驗(yàn)工具。腫瘤類器官具有高度保留腫瘤親本組織遺傳和表觀遺傳特征，極大地縮短靶向藥物篩選時(shí)程和提高精準(zhǔn)度的優(yōu)勢(shì)［11］。然而，瘤內(nèi)異質(zhì)性的存在是降低靶向藥物篩選精度，制約精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展的重要原因［12］。因此，提高不同病理亞型腫瘤細(xì)胞的分選和培養(yǎng)水平對(duì)于提高靶向藥物的篩選精度至關(guān)重要。本研究選擇當(dāng)前在肺腺癌中惡性度最高，患者預(yù)后最差的病理亞型—微乳頭型肺腺癌為研究對(duì)象，成功建立了1 例微乳頭型肺腺癌類器官，并就其常見(jiàn)癌變基因表型進(jìn)行檢測(cè)和分析，篩選出3 種潛在的靶向治療藥物，分別進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)凡德他尼的體外抑瘤效果最佳，為臨床患者的精準(zhǔn)治療提供了重要實(shí)驗(yàn)參考。

實(shí)驗(yàn)中，筆者選擇了4 個(gè)基因TTF-1、CK7、Napsin A 和Ki67 進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)，以檢測(cè)腫瘤類器官與腫瘤親本組織間基因表達(dá)的一致性。TTF-1在非小細(xì)胞肺癌中的陽(yáng)性表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，可作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，其在肺腺癌具有較高的敏感度和特異度［13］。CK7 為堿性細(xì)胞角蛋白，可作為肺腺癌分化的客觀指標(biāo)，用于鑒別腫瘤類型及判斷轉(zhuǎn)移部位腫瘤細(xì)胞的來(lái)源［14］。Napsin A是一種肺泡上皮細(xì)胞特異性的酸性蛋白酶，有助于肺腺癌的分類和診斷［15］。Ki67 作為一種細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志物，其表達(dá)的高低直接預(yù)示著腫瘤的生長(zhǎng)速度和病情的發(fā)展進(jìn)程［16］。但由于腫瘤類器官主要源于增殖指數(shù)Ki67較大的腫瘤干細(xì)胞，而腫瘤組織中僅存在少數(shù)腫瘤干細(xì)胞。因此，本研究中肺腺癌類器官的Ki67陽(yáng)性率高于其親本組織。總之，本研究中微乳頭型肺腺癌類器官與親本組織間各基因的蛋白表達(dá)基本一致，表明微乳頭型肺腺癌類器官很好地保留了腫瘤親本組織的遺傳特征。

基因突變結(jié)果顯示，微乳頭型肺腺癌組織親本樣本和類器官的突變基因結(jié)果一致，均體現(xiàn)為RET融合。RET 原癌基因是一種受體酪氨酸激酶（RTK）。現(xiàn)有文獻(xiàn)已證實(shí)RET原癌基因主要通過(guò)基因的突變和融合參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［17］。RET原癌基因發(fā)生融合后可導(dǎo)致自我磷酸化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能增強(qiáng)，使得RET基因表達(dá)失控，引起激酶活化，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［17］。RET 在人類正常肺組織中表達(dá)極低，但當(dāng)肺上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變時(shí)，RET基因可能發(fā)生融合，進(jìn)而在非小細(xì)胞型肺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，參與非小細(xì)胞型肺癌的發(fā)生和發(fā)展［18］。Tan等［19］對(duì)在新加坡國(guó)家癌癥中心接受治療的肺癌患者進(jìn)行回顧性分析，其中77%患者為華裔，他們中有95%為腺癌，結(jié)果在88%的腺癌病例中檢測(cè)到RET 重排。潘放等［20］研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶ALK、ROS1、RET這3種基因在肺癌中的表達(dá)相互排斥。另有研究表明非小細(xì)胞型肺癌患者中RET基因融合一般聚集在年齡偏低、非吸煙的腺癌患者中［21］。由此可見(jiàn)RET基因融合的發(fā)生與非小細(xì)胞型肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，其發(fā)生率受年齡、是否吸煙、組織類型等因素影響，且與其他基因相斥。以上研究提示RET基因融合可能成為非小細(xì)胞型肺癌患者行靶向治療的新靶點(diǎn)。

由于本例患者存在RET 基因融合，筆者選擇了3 種靶向RET 基因融合的藥物塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼。其中，塞爾帕替尼是一種強(qiáng)效、口服、高度選擇性轉(zhuǎn)染期間重排RET激酶抑制劑，它通過(guò)干擾癌細(xì)胞代謝途徑，限制轉(zhuǎn)移和侵襲，同時(shí)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增殖，可在一定程度上改善患者的生存質(zhì)量［22］。目前已經(jīng)被美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)上市，用于晚期或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、甲狀腺癌和非小細(xì)胞肺癌中腫瘤細(xì)胞發(fā)生RET基因融合的患者的治療［22］?？ú┨婺釋儆诙喟悬c(diǎn)RTK抑制劑，對(duì)酪氨酸激酶受體RET、ROS1、KIT、ALK 等均有抑制作用。Nokihara等［23］報(bào)道了一項(xiàng)關(guān)于卡博替尼的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，在劑量遞增組中的9 例非小細(xì)胞型肺癌患者中4 例腫瘤病灶縮?。ㄆ渲蠥LK 融合2 例，EGFR 突變1 例，RET 融合1 例）。Wang 等［24］對(duì)1 例KIF5BRET 基因融合的患者行卡博替尼治療，劑量為140 mg/d，1 次/d，在治療約9 個(gè)月時(shí)，患者達(dá)到疾病穩(wěn)定；治療期間除發(fā)生Ⅱ級(jí)皮疹的不良反應(yīng)外，未發(fā)生嚴(yán)重不良事件。但是該研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)卡博替尼對(duì)RET基因融合的特異性不強(qiáng)。凡德他尼能通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、RET等發(fā)揮抗腫瘤的作用。Yoh 等［25］通過(guò)對(duì)19 例RET基因融合的非小細(xì)胞型肺癌患者行凡德他尼治療，300 mg/d，1 次/d，結(jié)果顯示17 例患者符合臨床療效評(píng)估，9例患者達(dá)到總體客觀緩解，總體客觀緩解率為53%，無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間為4.7 個(gè)月，未見(jiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生。這些結(jié)果提示凡德他尼可延長(zhǎng)RET基因融合的非小細(xì)胞型肺癌患者的生存期，且無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)，為晚期非小細(xì)胞型肺癌的治療提供了新的治療方案。

本研究基于本例患者源性的微乳頭型肺腺癌類器官藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果表明，3 種靶向RET 基因融合的藥物塞爾帕替尼、卡博替尼和凡德他尼均能夠有效殺傷微乳頭型肺腺癌細(xì)胞，但以凡德他尼的抑瘤效果最為明顯。遺憾的是，本例患者在術(shù)后因轉(zhuǎn)院并未接受本研究基于微乳頭型肺腺癌類器官的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)治療。

目前，臨床上關(guān)于針對(duì)RET 基因融合為陽(yáng)性的靶向藥物尚未應(yīng)用于臨床，但關(guān)于多靶點(diǎn)RTK 抑制劑的藥物已應(yīng)用于臨床，且被證實(shí)有效。此外，艾樂(lè)替尼、莫特塞尼、索拉菲尼、AUY922 等多靶點(diǎn)RTK抑制劑被嘗試作為RET基因融合的非小細(xì)胞型肺癌患者的治療，但目前仍缺乏臨床研究，證據(jù)多來(lái)自于臨床前研究［26］。