徐桂穎，李玉，李雪，劉怡萌，陳懷永，△

支氣管哮喘是一種常見的慢性呼吸道疾病，其主要病理特征包括氣道炎癥反應(yīng)、杯狀細胞增多、氣道上皮損傷、平滑肌增生等［1-2］。其中，氣道上皮損傷是哮喘最重要的病理特征，表現(xiàn)為呼吸道上皮細胞間連接結(jié)構(gòu)受損、氣道上皮細胞大量死亡，從而導(dǎo)致氣道的屏障功能被破壞［3-4］。氣道上皮大量損傷后依賴于氣道祖細胞再生來修復(fù)受損的氣道結(jié)構(gòu)。Club細胞是一種氣道祖細胞，大量分布于氣道上皮，可增殖并分化為杯狀細胞和纖毛細胞［5］。氣道上皮受到損傷后，Club 細胞通過其增殖和分化功能對其進行修復(fù)［6-7］，在氣道上皮修復(fù)再生中發(fā)揮重要作用。許多呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生與氣道祖細胞的功能異常密切相關(guān)，因此，氣道祖細胞再生功能必須受到嚴格調(diào)控。肝激酶B1（liver kinase B1，Lkb1）參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控，如組織穩(wěn)態(tài)［8］、干細胞功能［9］、能量代謝［10］等，是細胞中與代謝反應(yīng)相關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子。既往研究表明，在成年小鼠中敲除Lkb1后，小鼠體內(nèi)的造血干細胞的再生能力顯著降低且數(shù)量明顯減少［11］。Lkb1還參與調(diào)控肝細胞增殖以控制肝臟再生［12］。小鼠的衛(wèi)星細胞缺失Lkb1基因?qū)е略摷毎偕芰κ軗p［13］。小鼠胚胎干細胞中敲除Lkb1會導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中氣道上皮化生受到抑制、小鼠體質(zhì)量下降和胚胎死亡［14］。然而，肺損傷中Lkb1對成年小鼠氣道祖細胞增殖分化功能的調(diào)控作用目前尚不清楚。本研究旨在通過體外類器官培養(yǎng)的方法探究Lkb1對成年小鼠氣道祖細胞再生功能的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物L(fēng)kb1f/f小鼠來源于中科院上海生化細胞研究所。Scgb1a1CreER小鼠購自The Jackson Laboratory（美國）。Lkb1f/f小鼠與Scgb1a1CreER小鼠雜交數(shù)代后獲得Club細胞中條件性敲除Lkb1基因的純合Scgb1a1CreER;Lkb1f/f小鼠。所有小鼠飼養(yǎng)在天津市海河醫(yī)院SPF 級動物房中，動物使用許可證號：SYXK（津）2021-0002。小鼠飼養(yǎng)嚴格遵循以下條件：溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，光照每12 h 循環(huán)1 次，鼠糧經(jīng)60Co 輻射滅菌，小鼠飲用水和墊料經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌。選取8～12 周齡，體質(zhì)量25～30 g 的Lkb1f/f小鼠（對照組）10只和Scgb1a1CreER;Lkb1f/f小鼠（Lkb1敲除組）9只用于實驗研究。

1.1.2 實驗儀器 熒光倒置顯微鏡（Olympus），自動組織脫水處理機、組織包埋機、病理切片機（萊卡），全波長讀數(shù)儀（Thermo），PCR 儀（Bio-Rad），實時熒光定量PCR（RT-PCR）儀（Roche），分選型流式細胞儀（BD Biosciences）。

1.1.3 實驗試劑 他莫昔芬（Tamoxifen）、玉米油、雞卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）、氫氧化鋁佐劑、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma 公司，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液粉劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，正常山羊血清（normal goat serum，NGS）、Hanks 緩沖液購自索萊寶公司，DAPI、SYBR Green PCR 試劑盒購自Roche 公司，鼠源CYP2F2 一抗購自Santa Cruz Biotechnology 生物科技有限公司，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）激活劑AICAR、兔源鈣激活氯離子通道蛋白3（CLCA3）一抗購自Abcam 公司，山羊抗鼠二抗（Alexa Fluor 594?Goat anti-Mouse IgG）、驢抗兔二抗（Alexa Fluor 488?Donkey anti-Rabbit IgG）、Trizol 試劑、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青/鏈霉素溶液購自Invitrogen公司，熒光封片劑購自Vectorlabs 公司，彈性蛋白酶（Elastase）購自Worthington Biochemical 公司，DMEM/F12 培養(yǎng)基、24 孔Transwell 小室購自Corning 公司，脫氧核糖核酸酶Ⅰ（Deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）、HEPES 緩沖液購自Sigma-Aldrich 公司，Matrigel基質(zhì)膠購自BD Pharmingen，流式抗體PE-CD24、PE-Cy7-EpCAM、APC-Sca-1、CD31、CD34、CD45、Streptavidin 購自eBioscience 公司，小鼠肺成纖維細胞系MLg2908購自美國模式培養(yǎng)物細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 條件性誘導(dǎo)Lkb1基因敲除 2 組小鼠腹腔注射200 mg/kg的他莫昔芬（溶劑為玉米油）誘導(dǎo)Club細胞中Lkb1基因敲除，隔1 d 注射1 次，共注射3 次。在注射完成后讓小鼠休息1周使藥物充分代謝。

1.2.2 小鼠過敏性哮喘模型的建立 第0 天（D0）和第7 天（D7）腹腔注射100μL OVA（10μg/g，PBS 為溶劑，氫氧化鋁為佐劑，配制成質(zhì)量濃度為100 g/L 的溶液）致敏小鼠；第14—18天連續(xù)5 d用2%OVA霧化劑（溶劑為PBS）霧化小鼠，每次30 min，保證霧化過程氣霧均勻；于第19天回收小鼠，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）及肺組織。

1.2.3 三色染色法計數(shù)BALF中炎性細胞數(shù)量 將方法1.2.2中獲得的BALF 離心（1 000 r/min，15 min），去除上清液后用PBS重懸細胞沉淀，取10μL細胞懸液加臺盼藍溶液按1∶5稀釋，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞。剩余細胞懸液涂片晾干用Hema 3染色劑染色，經(jīng)乙醇脫色后顯微鏡下觀察細胞數(shù)量、形態(tài)，將細胞分類并計數(shù)。

1.2.4 肺組織切片免疫熒光染色 肺組織石蠟切片置于55～60 ℃烤片機上45 min，依次經(jīng)過二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水中脫蠟，在煮沸的檸檬酸抗原修復(fù)液中修復(fù)抗原2 min，冷卻至室溫；PBS 浸洗，加0.2%Triton X-100/PBS打孔1 h；PBS浸洗后加5%NGS室溫封閉1 h，濾紙吸干封閉液后加一抗（CLCA3 和CYP2F2，1∶200稀釋于5%NGS）于4 ℃條件下避光孵育過夜；PBS 浸洗后加二抗（驢抗兔二抗和山羊抗鼠二抗，1∶200稀釋于5%NGS中）避光室溫孵育2 h，PBS 浸洗后加DAPI（1∶1 000 稀釋于5%NGS 中）室溫避光孵育20 min，PBS 浸洗后加防猝滅封片劑封片。用熒光顯微鏡對氣道區(qū)域拍照。

1.2.5 流式細胞術(shù)分選原代Club細胞 7.5%水合氯醛麻醉小鼠，打開腹腔，剪斷腹主動脈處死小鼠，PBS經(jīng)心臟灌洗肺臟，取下肺組織，經(jīng)氣管插管灌入彈性蛋白酶消化肺組織，將肺葉剪下切碎，加入DNase Ⅰ消化后獲得單個細胞。將細胞重懸于含有2%FBS、1%HEPES 緩沖液、1%青/鏈霉素溶液的Hanks 緩沖液中，加入熒光標記抗體PE-CD24、PE-Cy7-EpCAM、APC-Sca-1、CD31、CD34、CD45于4 ℃條件下避光孵育45 min，洗去未結(jié)合的一抗，加入Streptavidin于4 ℃條件下避光孵育30 min；洗去未結(jié)合的二抗，Hanks 緩沖液重懸細胞，使用 BD Ario Ⅲ流式細胞儀分選出表型CD31-CD34-CD45-PE-Cy7-EpCAM+APC-Sca-1+CD24+小鼠原代Club細胞。

1.2.6 體外類器官模型的建立 將分選出來的Club 細胞（3 000個/孔）與MLg2980細胞（3×104個/孔）在干細胞培養(yǎng)基（DMEM/F12，10%FBS，1%青/鏈霉素溶液）和Matrigel基質(zhì)膠中混合均勻（干細胞培養(yǎng)基：50 μL/孔；Matrigel 基質(zhì)膠：50 μL/孔）種到小室中。對照組和Lkb1敲除組各種5個孔，沿小室外側(cè)每孔加入410μL干細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，隔天換液，培養(yǎng)至第7 天時拍照記錄細胞的生長情況，統(tǒng)計直徑大于50μm 的類器官數(shù)量及直徑，計算類器官形成率。類器官形成率=直徑大于50μm的類器官數(shù)量/接種的Club 細胞數(shù)量×100%。藥物刺激實驗中類器官建立方法與上文相同，分別設(shè)置藥物（AICAR）刺激組和溶劑（DMSO）對照組，藥物刺激組使用含有AICAR 藥物的干細胞培養(yǎng)基（DMEM/F12，10%FBS，1%青/鏈霉素溶液，1 mmol/L AICAR）培養(yǎng)，溶劑對照組使用含有等體積DMSO 的干細胞培養(yǎng)基（DMEM/F12，10%FBS，1%青/鏈霉素溶液，DMSO）培養(yǎng)，隔天換液，第7天時拍照記錄。

1.2.7 RNA 提取及RT-PCR Trizol 裂解細胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進行SYBR Green RT-PCR檢測。擴增程序：95 ℃3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)45 次，分析熔解曲線。檢測高腳杯細胞標志物CLCA3，纖毛細胞標志物叉頭框蛋白J1（FOXJ1），AMP 依賴的蛋白激酶基因AMPKα、β、γ的表達情況，以β-actin作為內(nèi)參，各基因的引物序列見表1。目的基因的相對表達量用2-ΔCt法計算，ΔCt=目的基因Ct－內(nèi)參基因Ct。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 27.0 進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Lkb1對OVA引起的肺部炎癥的影響 BLAF細胞計數(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，Lkb1敲除組BLAF中炎性細胞總數(shù)無明顯變化，巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Comparison of the number of different types of cells in BALF between the two groups表2 2組BALF中不同種類細胞數(shù)比較［×104個，M（P25，P75）］

2.2Lkb1缺失對OVA 引起的杯狀細胞分化的影響 CLCA3 是杯狀細胞的標志物，Lkb1敲除組肺組織免疫熒光染色CLCA3陽性區(qū)域明顯少于對照組，見圖1。

2.3Lkb1缺失對氣道祖細胞Club 增殖和分化的影響 對照組Club 細胞和Lkb1敲除組Club 細胞來源的體外類器官模型培養(yǎng)至第7天的代表性圖像如圖2所示。Lkb1敲除組和對照組的類器官直徑分別為（146.200±13.580）μm 和（175.591±11.076）μm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=5，t=3.750，P＜0.01）。Lkb1敲除組的類器官形成率為（3.960±0.779）%，顯著低于對照組的（10.873±3.261）%（n=5，t=4.611，P＜0.01）。RT-PCR 結(jié)果顯示，Lkb1敲除組FOXJ1 mRNA 表達水平低于對照組（0.001±0.000vs.0.003±0.002，n=5，t=3.603，P＜0.05），LKB1敲除組CLCA3 mRNA 表達水平（0.001±0.000）與對照組（0.001±0.001）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n=5，t=1.202，P＞0.05）。

Fig.2 Growth of organoids圖2 類器官的生長情況

2.4Lkb1通過AMPK 通路對Club 細胞增殖發(fā)揮促進作用 AMPK 是Lkb1的下游信號通路。RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，Lkb1敲除組AMPKα mRNA 表達水平下降（0.005±0.001vs.0.012±0.004，n=5，t=3.103，P＜0.05）；AMPKβ（0.003±0.001vs.0.005±0.002，n=5，t=2.378，P＞0.05）和 AMPKγ（0.008±0.001vs.0.015±0.006，n=5，t=2.566，P＞0.05）mRNA 表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。藥物體外刺激實驗中類器官培養(yǎng)至第7天代表性圖像如圖3 所示，從圖中可以看出Lkb1缺失抑制了Club 細胞增殖，加入AMPK 的激活劑AICAR 后可以緩解Lkb1缺失對Club細胞增殖功能的抑制。

Fig.3 Effects of AMPK signaling pathway on the proliferation function of Club cells圖3 AMPK信號通路對Club細胞增殖功能的影響

3 討論

Club 細胞是主要的氣道上皮祖細胞，具有很強的自我更新能力，肺氣道上皮穩(wěn)態(tài)維持以及損傷后的再生修復(fù)都依賴于Club 細胞［15］。肺是生物體重要的呼吸器官，肺上皮直接與大氣中的顆粒物、微生物等有害物質(zhì)接觸很容易使上皮細胞受損。當損傷發(fā)生時，Club細胞可迅速增殖補充缺失，同時向纖毛細胞和杯狀細胞分化以修復(fù)氣道上皮的正常結(jié)構(gòu)和功能。因此，Club 細胞在穩(wěn)態(tài)維持和氣道上皮損傷后的再生修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用，其功能必須受到嚴格調(diào)控。

Lkb1是一種腫瘤抑制基因，其功能異常改變或發(fā)生基因突變會導(dǎo)致疾病的出現(xiàn)，有研究表明肺腺癌的發(fā)生與Lkb1基因異常高度相關(guān)［16-17］。本研究利用OVA 誘導(dǎo)小鼠發(fā)生支氣管哮喘，BALF 細胞計數(shù)結(jié)果顯示Lkb1敲除組巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數(shù)量與對照組相比無明顯變化，說明Lkb1對OVA 誘導(dǎo)的肺部炎癥無顯著影響。免疫熒光染色結(jié)果顯示Lkb1缺失可減弱OVA 所致的杯狀細胞分化，說明Lkb1對杯狀細胞分化有促進作用，在一定程度上促進哮喘的進程。氣道上皮損傷是支氣管哮喘的主要病理特征［3-4］，上皮損傷后修復(fù)不完全導(dǎo)致炎性細胞進一步浸潤從而加重哮喘［18-19］，所以氣道祖細胞Club 及時增殖修復(fù)氣道上皮非常關(guān)鍵。為了研究Lkb1基因?qū)lub 細胞增殖分化的調(diào)控作用，本研究構(gòu)建了體外類器官培養(yǎng)模型。類器官是來源于組織干細胞的可以模仿組織或器官再生能力的體外3D 結(jié)構(gòu)［20-21］。肺上皮祖細胞來源的類器官已經(jīng)被成功用于肺癌、肺纖維化、肺炎等多種呼吸系統(tǒng)相關(guān)的疾病研究中［22-23］。在本研究成功建立了Club細胞來源的類器官，結(jié)果顯示，Lkb1基因敲除后類器官平均直徑減小，形成效率降低，Club 細胞分化減弱。提示Lkb1缺失可能導(dǎo)致Club細胞增殖和分化都受到抑制。既往研究表明，在胚胎和成人肺中，Lkb1可促進纖毛細胞分化［24］，并可介導(dǎo)巨噬細胞與氣道祖細胞相互作用調(diào)控氣道杯狀細胞化生［14］。維持組織穩(wěn)態(tài)和干細胞再生都離不開Lkb1穩(wěn)定表達［25-27］。本研究結(jié)果與此一致。

AMPK 作為一種重要調(diào)節(jié)因子，參與真核生物的細胞以及組織代謝，在代謝重編程與生長調(diào)節(jié)中具有重要作用。研究表明，AMPK 可介導(dǎo)Lkb1相關(guān)的許多進化保守功能［13］。機體缺乏能量時，AMPK抑制mTORC1 靶點以達到控制細胞生長的目的［28］。本研究中類器官培養(yǎng)結(jié)果顯示，Lkb1敲除后Club細胞來源的類器官形成數(shù)量減少，說明Lkb1缺失會抑制Club 細胞增殖，而AMPK 激活劑AICAR 可緩解Lkb1缺失對Club細胞增殖功能的抑制，提示Lkb1可能通過激活A(yù)MPK信號通路調(diào)控Club細胞生長。

綜上，本研究通過體外類器官模型發(fā)現(xiàn)Lkb1與Club 細胞增殖分化密切相關(guān)，Lkb1通過AMPK 信號通路介導(dǎo)Club細胞增殖，這給哮喘以及其他與氣道祖細胞增殖有關(guān)的疾病提供了新的治療思路。