黃嘉家,肖雅松,葉金鑫,林 青,張榮華

(1.暨南大學(xué),廣東 廣州510632;2.廣東省中醫(yī)藥信息化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510632)

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis,DGP)是一組以胃排空延遲和上消化道癥狀為特征的綜合征,為糖尿病主要并發(fā)癥之一,臨床表現(xiàn)為腹脹、惡心、嘔吐等。目前糖尿病患者中DGP發(fā)病率已高達(dá)60%,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-3]。中醫(yī)認(rèn)為,DGP屬“消渴”“痞滿”“嘔吐”范疇,病機(jī)多為脾胃虛弱、氣機(jī)阻滯、痰濕水飲停聚,故多治以健脾和胃、行氣化痰[4]。理氣化痰類中藥具有理氣止嘔、化痰消痞等功效,為治療DGP的重要切入點(diǎn)。

半夏為天南星科植物半夏[PinelliaeRhizoma(Thunb.)Breit.]的干燥塊莖,具有燥濕化痰、散結(jié)消痞、降逆止嘔之效。半夏是半夏瀉心湯、小半夏湯與半夏厚樸湯等諸多治療DGP常用方劑的君藥,眾多學(xué)者采用系統(tǒng)聚類分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則、因子分析等方法研究古今臨床治療DGP的用藥規(guī)律,發(fā)現(xiàn)半夏為臨床治療DGP應(yīng)用較多的藥物之一[5-8]?？梢?jiàn),半夏是中藥治療DGP的重要組成藥物?，F(xiàn)代研究顯示,半夏具有止嘔、抗?jié)?、抗炎、調(diào)節(jié)胃腸功能等作用,既可通過(guò)中樞性抑制和激活迷走神經(jīng)以止嘔,還可通過(guò)抑制胃酸分泌和胃蛋白酶活性以減緩胃腸道反應(yīng)[9-12]。然而,半夏治療DGP的具體作用機(jī)制尚未深入探討,有待進(jìn)一步研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是預(yù)測(cè)、評(píng)估藥物治療疾病作用機(jī)制的有效方法,分子對(duì)接技術(shù)可進(jìn)一步為藥物靶點(diǎn)研究提供技術(shù)支持。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討半夏治療DGP的物質(zhì)基礎(chǔ)及網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 半夏活性成分的篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索半夏的化學(xué)成分,以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為參數(shù),篩選半夏的活性成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因;利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分SDF格式文件,輸入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)基因。整合TCMSP與SwissTargetPrediction預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)基因,去重,獲得半夏活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.2 DGP相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在Genecards(https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)及NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中分別以“Diabetic gastroparesis”或“Delayed gastric emptying”為關(guān)鍵詞,篩選DPG相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 半夏活性成分-DGP交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Venny 2.1在線軟件獲取半夏活性成分靶點(diǎn)與DGP相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn);借助Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“半夏活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。計(jì)算各節(jié)點(diǎn)連接數(shù),評(píng)估網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的相互聯(lián)系程度。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)浞治?基于Cytoscape 3.8.0的BisoGenet 3.0插件中的DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、NINT、BIND數(shù)據(jù)庫(kù),定義參數(shù)為“Homosapiens”,對(duì)1.3獲得的交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。借助Cytoscape 3.8.0的CytoNCA插件,對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?以節(jié)點(diǎn)的度中心性(DC)、介數(shù)中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、局部平均中心性(LAC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)6個(gè)參數(shù)作為參考標(biāo)準(zhǔn),篩選DC值排名前50的靶點(diǎn),再依據(jù)DC、BC、CC、EC、NC、LAC參數(shù)篩選PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)。

1.5 GO和KEGG富集分析 將1.4得到的核心靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.8.0中的ClueGO插件中,進(jìn)行基因本體(GO)功能富集和京都基因組與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析(P<0.05,FDR<0.05),構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-KEGG信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接 選取高DC值的核心靶點(diǎn)和活性成分,分別作為對(duì)接蛋白和對(duì)接配體,同時(shí)以臨床上常用于治療DGP的藥物西沙必利作為陽(yáng)性對(duì)照配體。其中,對(duì)接蛋白3D結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)中下載,去除原配體;活性成分和陽(yáng)性對(duì)照配體的mol2文件從ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://zinc15.docking.org/)下載,利用Autodock 4.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接,并用PyMOL 2.4軟件將對(duì)接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 半夏有效成分與DGP相關(guān)靶點(diǎn)篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得半夏的13個(gè)活性成分,見(jiàn)表1。整合TCMSP與SwissTargetPrediction獲得半夏活性成分靶點(diǎn)基因共461個(gè)。從Genecards、TTD、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到與DGP相關(guān)靶點(diǎn)429、5、19個(gè),合并與刪除重復(fù)項(xiàng)后得到388個(gè)。將半夏活性成分靶點(diǎn)與DGP相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集,獲得68個(gè)交集靶點(diǎn),見(jiàn)圖1。

圖1 半夏-糖尿病胃輕癱潛在靶點(diǎn)韋恩圖

表1 半夏活性成分

2.2 “半夏活性成分-交集靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 “半夏活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖如圖2所示,相互作用關(guān)系包括81個(gè)節(jié)點(diǎn)和165條邊。13個(gè)活性成分的DC值中位數(shù)為11,預(yù)示半夏多數(shù)活性成分可作用于多個(gè)DGP相關(guān)靶點(diǎn)。其中DC值較高的活性成分為MOL002714(黃芩素)、MOL006957[環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)]和MOL000358(β-谷甾醇)。

圖2 “半夏活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)浞治?交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖如圖3A所示,PPI網(wǎng)絡(luò)包含4 711個(gè)節(jié)點(diǎn)和115 417條邊。利用Cytoscape 3.8.0的插件CytoNCA,對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)DC、BC、CC、EC、NC、LAC值進(jìn)行計(jì)算,篩選獲得327個(gè)節(jié)點(diǎn)構(gòu)成的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖3B、3C)(圖3見(jiàn)本期第125頁(yè))。

注：A為交集靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖;B為經(jīng)度中心性(DC)>7初步篩選后的PPI網(wǎng)絡(luò)圖;C為核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,其中紅色部分為半夏與DGP的交集靶點(diǎn)。

2.4 GO和KEGG富集結(jié)果 對(duì)PPI核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析共得到2 324個(gè)條目,其中細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)、生物途徑(BP)分別有239、224、1 861個(gè)條目。如圖4所示,核心靶點(diǎn)的CC主要與黏著斑、細(xì)胞-基質(zhì)黏附連接、細(xì)胞-基質(zhì)連接等作用相關(guān),MF主要與泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素-類蛋白連接酶結(jié)合、細(xì)胞黏附分子結(jié)合等作用相關(guān),BP主要有mRNA分解代謝過(guò)程、RNA分解代謝過(guò)程、細(xì)胞周期調(diào)控等。核心靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析得到148條信號(hào)通路,包括細(xì)胞周期、甲狀腺激素信號(hào)通路和低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號(hào)通路等,見(jiàn)圖4。KEGG通路富集分析結(jié)果中排名前20條通路的核心靶點(diǎn)有157個(gè),其中12個(gè)是半夏活性成分靶點(diǎn)和DGP疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn),根據(jù)其在KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中的DC值排序?yàn)榻z裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、蛋白激酶1(AKT1)、JUN原癌基因(JUN)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT3)、絲裂原活化酶2(CDK2)、非受體酪氨酸激酶(SRC)、人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、缺氧誘導(dǎo)因子-1A(HIF1A)、雌激素受體(AR)、環(huán)狀素受體1(ESR1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶6(AURKA),見(jiàn)圖5。

注：圖A、B、C分別為基因本體(GO)功能富集分析的生物途徑(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)結(jié)果;圖D為京都基因組與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析結(jié)果。

注：三角形代表京都基因組與基因組百科全書(KEGG)通路富集信號(hào)通路;方形代表核心靶點(diǎn)。

2.5 分子對(duì)接結(jié)果 選擇MAPK1、AKT1為對(duì)接蛋白,黃芩素和環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)為對(duì)接配體,另外選擇西沙必利為陽(yáng)性對(duì)照配體。對(duì)接蛋白與對(duì)接配體的結(jié)合能越低,代表形成的分子對(duì)接結(jié)構(gòu)結(jié)合活性越強(qiáng)。分子對(duì)接結(jié)果模式如圖6所示,兩個(gè)活性成分和陽(yáng)性對(duì)照配體與核心蛋白MAPK1、AKT1均有良好的親和力,除環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與AKT1外,其他結(jié)合模式均能通過(guò)氫鍵結(jié)合。

注：圖A、B、C分別代表黃芩素、環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)、西沙必利與絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的對(duì)接情況;圖D、E、F分別代表黃芩素、環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)、西沙必利與蛋白激酶1(AKT1)的對(duì)接情況。

黃芩素和環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與MAPK1的結(jié)合能均低于陽(yáng)性對(duì)照配體西沙必利,其中環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與MAPK1結(jié)合能更低,提示環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與MAPK1有更強(qiáng)的結(jié)合活性;黃芩素和環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)與AKT1的結(jié)合能均低于陽(yáng)性對(duì)照配體西沙必利,其中黃芩素和AKT1的結(jié)合能更低,提示黃芩素與AKT1有更強(qiáng)的結(jié)合活性。分子對(duì)接結(jié)合能見(jiàn)表2。

表2 半夏關(guān)鍵有效成分和核心靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接結(jié)合能(kcal/mol)

3 討論

DGP癥見(jiàn)嘔吐、腹脹、噯氣、惡心等,屬中醫(yī)“消渴”“痞滿”“嘔吐”等范疇,病機(jī)為消渴日久,氣血虧虛,使脾胃運(yùn)化無(wú)力,氣機(jī)升降失調(diào),以致胃氣上逆,氣滯痰阻。臨床治療DGP多采用調(diào)和脾胃、消痞化痰、健脾益氣之和、消、補(bǔ)法[6]。半夏具有化痰止嘔、散結(jié)消痞之功,兼具和、消、補(bǔ)之效,為臨床治療DGP的常用中藥[5-6]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)從多成分、多靶點(diǎn)、多通路的網(wǎng)絡(luò)角度探究半夏治療DGP的作用機(jī)制。

本研究共篩選出與DGP相關(guān)的活性成分13個(gè),其中黃芩素、β-谷甾醇、環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)的靶點(diǎn)連接度較高,在半夏治療DGP中發(fā)揮主要作用。研究發(fā)現(xiàn),黃芩素對(duì)糖尿病有一定治療作用。LI Y K等[13]應(yīng)用黃芩素干預(yù)鏈脲霉素誘導(dǎo)的胰島素缺乏糖尿病大鼠,發(fā)現(xiàn)黃芩素能降低糖尿病大鼠空腹血糖、隨機(jī)血糖和血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量;黃芩素還可通過(guò)降低皮質(zhì)中脂氧合酶的表達(dá),影響p38 MAPK及其磷酸化酶的合成,抑制p38 MAPK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用,減少部分糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。黃芩素還具有類固醇激素作用,可通過(guò)介導(dǎo)α2-腎上腺素受體、前列腺素和三磷酸腺苷(ATP)敏感性鉀通道,減少Cajal間質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng),激活Cajal間質(zhì)細(xì)胞的抗氧化過(guò)程,增加黏液分泌,發(fā)揮胃保護(hù)作用[14-15]。環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)為半夏特有成分,是一種哌嗪二酮類化合物,是治療糖尿病胃輕癱的潛在化合物,然其相關(guān)研究甚少,值得進(jìn)一步探究。β-谷甾醇可通過(guò)提高血清中一氧化氮含量,提高受損胃黏膜的修復(fù)能力;通過(guò)降低內(nèi)皮素1水平,發(fā)揮抗胃潰瘍作用[16-17]。因此,半夏發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)與黃芩素、β-谷甾醇等有效成分密切相關(guān)。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,MAPK1、AKT1及JUN等是半夏治療DGP的重要靶點(diǎn)。MAPK1是一種線粒體活化蛋白激酶,是胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵因子之一,與葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝密切相關(guān),在胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用[18-19]。MAPK是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)下游的關(guān)鍵激酶,可通過(guò)磷酸化靶蛋白抑制肝臟對(duì)糖的輸出,增加飽腹感并抑制糖分?jǐn)z入,起控制血糖的作用[20-21]。研究顯示,p38/MAPK的激活可促進(jìn)雌激素受體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,并與雌激素反應(yīng)元件結(jié)合,維持機(jī)體胃排空功能[22]。AKT參與細(xì)胞的凋亡、周期進(jìn)展及葡萄糖和脂質(zhì)代謝等過(guò)程,與DGP的發(fā)生密切相關(guān)。研究顯示,AKT可通過(guò)抑制叉頭框蛋白O1(FoxO1)的表達(dá),刺激己糖激酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸鈉鹽,從而降低血糖水平[23]。AKT與p-AKT蛋白含量的高低影響胃排空率和小腸推進(jìn)率,與胃腸激素的調(diào)節(jié)、胃腸動(dòng)力密切相關(guān)[24-25]。研究顯示,AKT的磷酸化可降低鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞的丟失,抑制Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9的表達(dá)及胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞的凋亡[26-27]。因此,MAPK1、AKT1等靶點(diǎn)與DGP密切相關(guān),為半夏發(fā)揮抗DGP的重要靶點(diǎn)。

KEGG通路富集分析結(jié)果亦顯示,甲狀腺激素信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路可能為半夏治療DGP的關(guān)鍵通路。研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺激素可激活胰島素信號(hào)通路的上游因子胰島素受體底物-1(IRS-1),降低2型糖尿病模型小鼠血糖水平,提高糖尿病小鼠胰島素敏感性和血漿胰島素水平[28]。此外,甲狀腺激素可通過(guò)直接作用于胃腸道平滑肌及兒茶酚胺刺激胃腸道運(yùn)動(dòng)[29]。鐘鳳等[30]研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺內(nèi)有胃動(dòng)素免疫陽(yáng)性細(xì)胞,胃動(dòng)素與降鈣素共存并表達(dá)于甲狀腺C細(xì)胞。HIF可通過(guò)控制糖酵解限速步驟誘導(dǎo)細(xì)胞糖酵解[31]。研究顯示,HIF-1α在DGP大鼠胃黏膜中表達(dá)增加,可提高1型糖尿病大鼠胃黏膜血管的通透性,是調(diào)控DGP胃排空延遲的關(guān)鍵因子[32]。因此,半夏可能通過(guò)甲狀腺激素和HIF-1等信號(hào)通路,調(diào)控血糖、促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)、逆轉(zhuǎn)胃排空延遲、增加胃黏膜血管的通透性等發(fā)揮抗DGP的作用。

本研究初步推測(cè)半夏主要通過(guò)黃芩素、β-谷甾醇、環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)等活性成分發(fā)揮調(diào)控血糖、促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)、逆轉(zhuǎn)胃排空延遲等作用,從而達(dá)到治療DGP的目的。分子對(duì)接結(jié)果提示,黃芩素、環(huán)(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)可與MAPK1和AKT1結(jié)合,調(diào)控HIF-1信號(hào)通路和甲狀腺激素信號(hào)通路,這可能為半夏防治DGP的重要機(jī)制,值得進(jìn)一步探索。

中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是一個(gè)由多種成分構(gòu)成的藥效組分群,可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)交叉產(chǎn)生整體的藥效作用,與以整體性、系統(tǒng)性為研究特色的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不謀而合。在廣泛的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中,中藥活性成分主要按OB≥30%、DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,并驗(yàn)證了許多具有藥效作用的成分及其相關(guān)作用機(jī)制。然而,該篩選方法也存在弊端,如不同性狀的中藥在機(jī)體不同的生理病理狀態(tài)下,吸收、分布、代謝及排泄的過(guò)程是不完全相同的。因此,基于血清代謝組學(xué)等方法研究中藥在患者或疾病模型動(dòng)物中的有效成分及代謝產(chǎn)物,并基于這些吸收、代謝成分開(kāi)展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究更符合藥理學(xué)研究。半夏的主要成分包括生物堿類、有機(jī)酸類、蛋白質(zhì)類、核苷類、氨基酸類、揮發(fā)油類、甾醇類及蛋白質(zhì)類等,但其相關(guān)特異性藥效成分在體內(nèi)的代謝過(guò)程,以及相關(guān)作用機(jī)制研究甚少,以單味中藥治療DGP的研究尚未見(jiàn)報(bào)道[33]。半夏是臨床防治DGP的重要中藥,但其作用機(jī)制仍未具體研究。因此,本研究仍基于廣泛應(yīng)用的活性成分篩選方法,基于現(xiàn)有的半夏化學(xué)成分進(jìn)行初步篩選,以期初步探索半夏治療DGP的潛在作用機(jī)制,為進(jìn)一步的研究提供參考。