李孟 李丹 謝芝勛 羅思思 張民秀 謝麗基 華俊 粟永春 翟國(guó)勝 黃嬌玲 陳智武

摘要? ［目的］了解廣西水禽中分離到的H3N8亞型禽流感病毒的分子遺傳進(jìn)化特征。［方法］將從活禽市場(chǎng)采集的水禽棉拭子樣品經(jīng)處理后接種SPF雞胚，應(yīng)用血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)對(duì)收取尿囊液進(jìn)行血清學(xué)鑒定，然后對(duì)分離到的禽流感病毒進(jìn)行全基因序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析。［結(jié)果］血清學(xué)及HA和NA基因測(cè)序結(jié)果顯示，該分離毒株為H3N8亞型禽流感病毒，命名為A/duck/Guangxi/446D28/2021（H3N8）。全基因遺傳進(jìn)化分析顯示，其HA蛋白無連續(xù)堿性氨基酸插入，符合典型低致病性禽流感病毒的特征；NA蛋白出現(xiàn)耐藥性氨基酸位點(diǎn)突變；該毒株8個(gè)基因片段在GenBank中比對(duì)分析結(jié)果顯示，其同源性最高的毒株基本主要來自越南和位于我國(guó)候鳥遷徙路線上的寧夏及江西等省（區(qū)）。［結(jié)論］該分離株可能是不同亞型禽流感病毒通過相互基因交換所形成的基因重組體。

關(guān)鍵詞? 禽流感病毒；H3N8；水禽；基因重組

中圖分類號(hào)? S852.65? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? 文章編號(hào)? 0517-6611（2024）01-0072-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.01.016

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation， Identification and Genetic Evolution Analysis of Avian Influenza Virus H3N8 from Ducks in Guangxi

LI Meng， LI Dan， XIE Zhi-xun et al

（Guangxi Veterinary Research Institute， Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， Key Laboratory of China（Guangxi）-ASEAN Cross-border Animal Disease Prevention and Control， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning， Guangxi 530001）

Abstract? ［Objective］ To understand the molecular genetic evolution characteristics of H3N8 subtype avian influenza virus isolated from waterfowl in Guangxi. ［Method］ The cotton swab samples collected from live poultry market were treated and inoculated into SPF chicken embryos. The collected allantoic fluid was serologically identified by hemagglutination test and hemagglutination inhibition test， and then the whole gene sequence and genetic evolution analysis of the isolated avian influenza virus were carried out. ［Result］ Serological HA and NA gene sequencing results showed that the isolated strain was H3N8 subtype avian influenza virus， named A/duck/Guangxi/446D28/2021 （H3N8）. Genetic evolution analysis of the whole gene showed that there was no continuous basic amino acid insertion in HA protein， which accorded with the characteristics of typical low pathogenic avian influenza virus. NA protein appeared drug-resistant amino acid site mutation;The results of comparative analysis of eight gene fragments of this strain in GenBank showed that the strains with the highest homology mainly came from Vietnam， Ningxia and Jiangxi provinces， which are located on the migratory route of migratory birds in China. ［Conclusion］ The isolated strain may be a gene recombinant formed by gene exchange among different subtypes of avian influenza viruses.

Key words? Avian influenza virus;H3N8;Waterfowl;Gene recombination

基金項(xiàng)目? 廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB21076004））；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022GXNSFAA035445，2021GXNSFBA196031）；“廣西八桂學(xué)者”專項(xiàng)（桂科專項(xiàng)21-1）。

作者簡(jiǎn)介? 李孟（1981—），男，河南南陽人，正高級(jí)獸醫(yī)師，博士，從事病原分子生物學(xué)研究。

*通信作者，研究員，從事動(dòng)物疫病防控研究工作。

收稿日期? 2023-01-13

流感病毒（influenza virus）屬于正黏病毒科流感病毒屬［1］。根據(jù)流感病毒表面的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）2種蛋白可分為多個(gè)不同的亞型，目前已知HA亞型有18種，NA亞型有11種［2-3］。H3亞型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于低致病性AIV（LPAIV），是LPAIV中的主要亞型之一。H3亞型AIV不僅引發(fā)犬流感、豬流感和馬流感等疾病，還可以通過基因重組跨越種屬屏障感染人類［4-5］。1968年香港流感病毒（H3N2）大流行引發(fā)人們對(duì)H3亞型流感禽源重配毒株的重視［6］。研究表明，H3亞型AIV在LPAIV流行病學(xué)調(diào)查中具有較高的分離率，H3亞型AIV主要亞型組合包括H3N2、H3N3、H3N6和H3N8［7-8］。

H3N8亞型AIV主要存在于野生水禽體內(nèi)，通常分為禽源與馬源，不僅可以感染禽類，還可能感染一些哺乳動(dòng)物。Scholtens等在1963年首次報(bào)道了馬感染H3N8亞型AIV，而且禽源A/Equine /Jilin /1963（H3N8）流感病毒曾引起我國(guó)黑龍江省馬流感的暴發(fā)，并造成馬匹死亡［9］。研究表明，馬源H3N8亞型AIV不僅感染馬、騾和驢，還能夠引起犬和豬感染發(fā)?。?0］。Anthony等報(bào)道了H3N8亞型AIV引起海豹死亡的事件［11］。近年來，H3N8亞型AIV在我國(guó)野鳥和活禽市場(chǎng)中被分離到，2021年起引起雞群發(fā)病的新型H3N8亞型AIV也在我國(guó)南方雞群中被監(jiān)測(cè)到［12-13］。2022年4月，我國(guó)河南省報(bào)道了全球首例人感染H3N8亞型AIV［14］事件。2022年5月，我國(guó)湖南省發(fā)現(xiàn)全球第二例人感染H3N8亞型AIV病例，即一名兒童與禽類同時(shí)感染H3N8亞型AIV的病例［15］。上述研究表明，H3N8亞型AIV的宿主范圍在不斷地?cái)U(kuò)大，可以跨越種屬屏障感染哺乳動(dòng)物和人類，嚴(yán)重威脅人類公共衛(wèi)生安全。

廣西地處熱帶和亞熱帶，毗鄰流感疫情復(fù)雜的越南，還位于候鳥路線上，同時(shí)具備流感病毒生存與傳播的天然條件，被國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者描述為“流感起源中心”之一［16］。每年大量的候鳥攜帶流感病毒經(jīng)過廣西遷徙，對(duì)廣西流感的流行及防控帶來巨大影響［17］。近年發(fā)生的人感染H3N8亞型AIV事件及H3N8亞型AIV引起雞群發(fā)病的報(bào)道引發(fā)人們對(duì)H3亞型AIV的廣泛關(guān)注。為進(jìn)一步了解廣西H3亞型AIV的遺傳進(jìn)化情況，筆者對(duì)從健康鴨中分離到的一株H3N8亞型AIV進(jìn)行了全基因序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析，以期為廣西H3N8亞型AIV的防控提供理論支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣品與雞胚。

2021年從廣西南寧地區(qū)不同活禽交易市場(chǎng)采集鴨和鵝的口咽及泄殖腔棉拭子樣品，所有樣品存放在含有4種抗生素的保存液中。樣品經(jīng)低溫運(yùn)輸至廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室存放于-80 ℃冰箱備用。1齡SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，自行孵化至9～11日齡用于病毒分離鑒定。

1.1.2? 主要試劑。

RNA核酸提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DH5α大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞和平末端連接載體試劑盒pEASY-Blunt Cloning Kit均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker 1 000 bp、高保真PCR Mix、Uni-12隨機(jī)引物、dNTP、cDNA第一鏈合成用的MLV反轉(zhuǎn)錄酶及RNA酶抑制劑購自寶生物工程（北京）有限公司；唾液酸酶6’-Sialyllactose-PAA-biotin（6’SL-PAA）和3’-Sialyllactose-PAA-biotin（3’SL-PAA）均購自GlycoTech公司；TMB 過氧化物酶（HRP）底物的即用型溶液購自北京天根生物科技有限公司；Streptavidin-HRP過氧化物酶購自美國(guó)R&D systems公司；其余試劑購自商業(yè)公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3? 引物設(shè)計(jì)及合成。

參照相關(guān)文獻(xiàn)［18］及GenBank中已發(fā)表的H3亞型AIV全基因序列，利用Premier 7.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)H3亞型AIV基因組8個(gè)節(jié)段的特異性引物用于擴(kuò)增A/duck/Guangxi/446D28/2021（H3N8）的全基因，引物由華大基因科技有限公司合成。

1.2? 方法

1.2.1? 病毒的分離鑒定及純化。

將南寧市活禽交易市場(chǎng)采集到的家禽棉拭子樣品放置在低溫保藏箱中快速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，處理后的樣品上清液接種10日胚齡SPF雞胚，每個(gè)樣品0.2 mL/枚分別接種2枚雞胚，在35 ℃條件下孵化96 h；采集24～96 h死亡和未死亡雞胚尿囊液，用血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）對(duì)其進(jìn)行血清學(xué)鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果初步確定樣品中所含禽流感病毒的HA亞型。將確定為H3亞型AIV病毒株尿囊液接種于雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），參照通過空斑純化進(jìn)行連續(xù)3輪的克隆純化，再接種SPF雞胚對(duì)純化后的H3亞型毒株進(jìn)行增殖并用HA試驗(yàn)驗(yàn)證，將收獲的尿囊液置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 病毒RNA的提取與RT-PCR擴(kuò)增。

使用RNA抽提試劑盒按照說明書提取收獲的病毒尿囊液總RNA，利用流感病毒Uni-12通用引物按照試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)不同目的基因引物特異性設(shè)計(jì)不同的PCR擴(kuò)增程序，分別對(duì)8個(gè)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)目的片段進(jìn)行檢測(cè)和純化。

1.2.3? PCR產(chǎn)物的回收純化及克隆測(cè)序。

將目的片段按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收純化，然后將回收產(chǎn)物與快速克隆載體進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，涂板經(jīng)抗生素篩選培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，每個(gè)基因挑選3個(gè)不同陽性克隆菌液送華大基因（廣州）公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4? 分離株遺傳進(jìn)化及耐藥性分析。

用DNASTAR軟件對(duì)毒株各個(gè)基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和整理，將整理結(jié)果與NCBI中的相關(guān)參考毒株進(jìn)行分析和確認(rèn)。同時(shí)應(yīng)用MEGA6.0軟件對(duì)選擇的有代表性參考毒株和分離株的各個(gè)基因進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建其遺傳進(jìn)化樹，進(jìn)而分析分離毒株的遺傳演化情況。使用DNASTAR5.0生物軟件對(duì)分離株NA基因氨基酸序列進(jìn)行分析，并與NAI類藥物敏感參考株A/California/07/2009（登錄號(hào)FJ98386）的NA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.5? 分離株受體親和特性的測(cè)定。

用包被緩沖液將446D28毒株尿囊液稀釋至HA效價(jià)為1∶128，按100 μL/孔將稀釋好的病毒液加入96孔ELISA板中，將上述樣品板放置在4 ℃冰箱包被過夜，設(shè)空白對(duì)照；將6’SL-PAA及3’SL-PAA唾液酸酶分別稀釋至4個(gè)不同的梯度，每個(gè)稀釋梯度設(shè)3次重復(fù)，按照操作說明進(jìn)行加樣和洗板，病毒和受體反應(yīng)終止后加入終止液，將反應(yīng)板放入酶標(biāo)儀讀取樣品在450 nm波長(zhǎng)下的吸光值并分析結(jié)果。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病毒的鑒定及純化結(jié)果

筆者從收集HA試驗(yàn)效價(jià)大于1∶16的樣品雞胚尿囊液進(jìn)行HI試驗(yàn)。446D28樣品HI試驗(yàn)結(jié)果表明，該樣品僅與H3亞型AIV血清發(fā)生血凝抑制作用，而與其他HA亞型AIV和NDV抗血清沒有任何交叉反應(yīng)，初步確定該分離株為H3亞型AIV。毒株尿囊液接種于CEF細(xì)胞上經(jīng)過3輪蝕斑純化后并用SPF雞胚增殖的雞胚尿囊液HA效價(jià)為26。

2.2? 病毒全基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序

RT-PCR擴(kuò)增均得到與引物設(shè)計(jì)預(yù)期大小相符合的目的基因條帶。各目的基因經(jīng)克隆和PCR鑒定陽性后送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行比對(duì)，將拼接后的基因序列進(jìn)行同源性的BLAST比對(duì)分析。比對(duì)的結(jié)果表明，HA和NA基因與H3及N8亞型AIV的核苷酸同源性最高。因此，將該分離毒株命名為A/duck/Guangxi/446D28/2021（H3N8）。

2.3? 分離株各基因片段的序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析

各個(gè)基因經(jīng)過拼接形成全長(zhǎng)基因序列，各個(gè)片段與GenBank中核苷酸同源性最高的病毒株進(jìn)行BLAST分析，分析結(jié)果見表1。A/duck/Guangxi/446D28/2021（H3N8）HA基因比對(duì)分析結(jié)果表明，樣品與越南鴨源分離株A/duck/Vietnam/HN5687/2019（H3N2）相似性最高，核苷酸同源性為97.30%。 序列分析的結(jié)果表明：其HA基因開放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)為1 701 bp；HA1和HA2蛋白裂解位點(diǎn)沒有出現(xiàn)3個(gè)以上連續(xù)性的堿性氨基酸（高致病性禽流感病毒的分子特征），符合低致病性AIV的分子特征。另外，HA受體結(jié)合位點(diǎn)未發(fā)生可感染人的Q226L突變。HA基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該毒株與感染人及對(duì)雞有致病性雞源H3亞型AIV毒株分別處于不同的分支，同時(shí)與北美分支H3亞型AIV毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖1）。NA基因的ORF全長(zhǎng)為1 413 bp，與A/duck/Guangxi/446D28/2021（H3N8）的NA基因相似性最高的毒株是越南鴨源分離株A/Muscovy duck/Vietnam/HN5257/2019（H4N8）（98.63%）。NA基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該毒株與2022年感染人及流行的對(duì)雞有致病性的雞源N8亞型毒株分別處于不同的分支（圖2）。PB2基因的ORF全長(zhǎng)為2 280 bp，與 A/duck/Guangxi/446D28/2021（H3N8）的PB2基因核苷酸相似性最高的毒株為越南分離株 A/duck/Vietnam/HN6479/2020（H3N2）（99.06%）。PB1基因的ORF全長(zhǎng)為2 274 bp，與該基因核苷酸相似性最高的毒株是越南分離株A/Muscovy duck/Vietnam/HN5901/2019（H4N6）（98.93%）。PA基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為2 151 bp，同源性最高的毒株為A/duck/Vietnam/HN6105/2020（H4N2），相似性為98.56%。NP基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 497 bp，與其相似性最高的毒株是A/duck/Vietnam/HN6038/2019（H11N2），核苷酸同源性為 99.11%。M基因編碼區(qū)全長(zhǎng)982 bp，與該基因相似性最高的毒株為A/spot-billed duck/Ningxia/YG83/2017（H5N6），核苷酸同源性為99.71%。NS基因編碼區(qū)全長(zhǎng)838 bp，與該基因相似性最高的毒株為A/chicken/Ganzhou/GZ43/2016（H3N2），核苷酸同源性為97.64%。

2.4? NA基因耐藥性位點(diǎn)分析結(jié)果

通過與參考株A/California/07/2009進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（按NI編碼序號(hào)），446D28株NA基因的酶活性中心的第118R、119E、151D、152R、156R、179W、180S、199D、223I、225R、228E、275H、277E、278E、293R、295N、368R、402Y和425E位點(diǎn)均保守，未出現(xiàn)氨基酸位點(diǎn)替換；僅在S247A位點(diǎn)出現(xiàn)了氨基酸位點(diǎn)的替換（表2）。該位點(diǎn)的替換可能會(huì)影響酶的活性，但是否會(huì)對(duì)NAI類藥物產(chǎn)生耐藥性需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.5? 受體親和性的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)AIV結(jié)合不同唾液酸受體能力的差異，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)按照說明對(duì)純化后的H3N8亞型AIV 446D28毒株進(jìn)行了唾液酸受體結(jié)合特異性的測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，分離毒株446D28優(yōu)先選擇與SAα2，3受體結(jié)合，同時(shí)也具有與SAα2，6受體結(jié)合的特性，但與α-2，3唾液酸受體結(jié)合能力稍強(qiáng)（圖3），表明該H3N8亞型AIV分離株具備結(jié)合感染人受體的特性，存在跨種屬屏障感染哺乳動(dòng)物和人的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

3? 討論

流感病毒的多樣性及其跨越種屬障礙的能力一直令人擔(dān)憂，需要對(duì)人類和動(dòng)物流感病毒進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)。H3N8亞型AIV經(jīng)常在動(dòng)物中檢測(cè)到，也是野生鳥類中最常見的亞型之一［19］。曾有H3N8亞型AIV在多種哺乳動(dòng)物宿主中跨越種屬傳播的報(bào)道，包括H3N8亞型AIV分別在馬和犬中暴發(fā)的疫情［20-21］。在人類中，直到2022年5月我國(guó)2個(gè)省份分別報(bào)道了1例人感染H3N8亞型AIV的病例。雖然沒有資料表明這種病毒有能力持續(xù)在人體內(nèi)傳播，但需要進(jìn)行更多的流行病學(xué)和病毒學(xué)研究，以便更好地評(píng)估該病毒在人體細(xì)胞中的復(fù)制能力以及對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成的風(fēng)險(xiǎn)。雖然當(dāng)前H3N8亞型AIV為零星散發(fā)，鑒于H3亞型禽流感病毒曾引起1968年香港流感大流行，因此需要高度重視H3N8亞型禽流感病毒的公共衛(wèi)生威脅。

該研究中，A/duck/Guangxi/446D28/2021（H3N8）的8個(gè)基因片段中HA、NA、PB1、PB2、PA和NP均與來自越南的鴨源分離株同源性最高，M和NS基因則分別與位于候鳥遷徙路線上的寧夏和江西分離株同源性最高。由此可見，分離的鴨源H3N8亞型AIV毒株就是由不同亞型毒株經(jīng)過一系列基因重排產(chǎn)生的重組毒株。攜帶有不同亞型流感病毒的候鳥經(jīng)長(zhǎng)距離遷徙到達(dá)廣西越冬或停息，然后在來年從熱帶地區(qū)經(jīng)過廣西向北，在此期間候鳥可以通過不同方式將病毒釋放到周圍環(huán)境中，同時(shí)廣西多數(shù)水禽養(yǎng)殖戶為開放式養(yǎng)殖，普遍的活禽交易習(xí)慣以及與流感疫情復(fù)雜的越南頻繁邊境貿(mào)易往來，這都為AIV在野生鳥類及家禽中的混合感染和傳播創(chuàng)造了條件［22］?；旌细腥静煌瑏喰虯IV在禽類體內(nèi)增殖過程中很容易形成“新的亞型毒株”。NAI類藥物是治療人感染禽流感的首選藥物，但近年來有不少關(guān)于流感病毒對(duì)NAI類藥物耐藥的報(bào)道［23-24］。對(duì)分離株耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，NA蛋白中出現(xiàn)S247A位點(diǎn)氨基酸替換，該改變可能會(huì)降低病毒對(duì)NAI類藥物的敏感性，尤其是奧司他韋［25］。及時(shí)發(fā)現(xiàn)AIV流行毒株中耐藥毒株的出現(xiàn)，可為抗AIV新藥開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，H3N8亞型AIV在國(guó)內(nèi)水禽和野鳥中不斷被分離到［26-30］。直到2021年12月首先在廣東省某三黃雞群發(fā)現(xiàn)由H3和H9N2亞型AIV內(nèi)部基因重排組成的對(duì)雞致病的新型H3N8亞型AIV。新型AIV隨后陸續(xù)在福建、安徽、江蘇和河南等多個(gè)省份雞群中被發(fā)現(xiàn)。感染人的新型H3N8亞型AIV出現(xiàn)后，通過對(duì)河南和湖南2省家禽相關(guān)從業(yè)人員

的血清學(xué)監(jiān)測(cè)顯示，感染人的新型H3N8病毒尚不具備持續(xù)人際間傳播能力。遷徙候鳥攜帶流感病毒與家禽流感病毒之間的基因重排成為產(chǎn)生新型流感病毒的重要方式。2013年以來新出現(xiàn)的H7N9、H10N8、H10N3、部分H5N6及H3N8等一系列可感染人的新型禽流感病毒均含有H9N2病毒內(nèi)部基因，表明H9N2病毒是通過提供內(nèi)部基因產(chǎn)生新型流感病毒的“母病毒”［31］。該研究分離的鴨源H3N8亞型AIV雖然其內(nèi)部未含H9N2病毒內(nèi)部基因，但是其經(jīng)歷了鴨源H3亞型AIV與遷徙候鳥攜帶的其他亞型流感病毒的基因重排，產(chǎn)生了新的變異株。因此，改變目前廣西家禽散養(yǎng)的養(yǎng)殖方式以及減少活禽交易是防控新型H3N8亞型AIV的重要措施。

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