郭春敏,張 紅,田付港,于 昕

(煙臺大學藥學院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協同創(chuàng)新中心,山東 煙臺,264005)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是世界第二大神經退行性疾病,其臨床表現包括震顫、行動遲緩、姿勢不穩(wěn)等運動癥狀及嗅覺損傷、認知減退、抑郁等非運動癥狀,其中嗅覺障礙作為PD典型的非運動癥狀在PD患者中的發(fā)病率高達90%[1-2],但其發(fā)病機制尚不清楚,研究表明其可能涉及神經遞質系統紊亂、α-syn異常聚集、神經免疫炎性反應等[3]。目前臨床上對PD嗅覺障礙的治療尚無明確的指導藥物,僅局限于嗅覺訓練、深部腦刺激等物理方法[4]。有文獻報道,多巴胺(Dopamine,DA)受體激動劑可以改善PD大鼠的嗅覺障礙,但其具體作用機制均未被探討[5-6]。羅替戈汀(Rotigotine)作為D3D2D1受體激動劑,是治療原發(fā)性帕金森病運動癥狀的一線藥物。Rotigotine長鏈酯(Rotigotine long chain ester,RLCE)是一種長效微晶制劑,進入體內可實現28～30 d持續(xù)穩(wěn)定釋放Rotigotine。因此,本實驗通過腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6,-四氫吡啶(1-methy1-4-pheny1-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)制作PD小鼠模型,評價RLCE對PD嗅覺障礙的改善作用,同時在α-syn的聚集和神經炎癥等方面探討其可能的作用機制,為PD嗅覺障礙的治療提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

雄性SPF級C57BL/6小鼠,50只,8～10周齡,質量20～25 g,濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,動物許可證號:SCXK(魯)20190003,質量合格證流水號:370726211101063435。小鼠飼養(yǎng)在山東綠葉實驗動物中心SPF級屏障飼養(yǎng)環(huán)境,室溫保持(23 ± 2)℃,墊料每周更換一次,自由飲水及采食,人工照明12 h/12 h明暗交替。本研究經過煙臺大學動物倫理委員會批準。

1.2 藥品與試劑

RLCE,山東綠葉制藥有限公司生產;MPTP,批號:L2031451(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);GTVision TMIII 型免疫組化檢測試劑盒(含DAB),(上海基因科技股份有限公司);TH抗體、GFAP抗體、IBA1抗體、iNOS 抗體(CST); β-actin 抗體(小鼠單抗)、BCA 濃度測定試劑盒(增強型)、酶標山羊抗兔 IgG、山羊抗鼠 IgG (碧云天生物技術公司)。

1.3 儀器

離心機(上海貝克曼庫爾特有限公司); 酶標儀(美國伯騰儀器有限公司); 全自動化學發(fā)光成像凝膠成像系統(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司); 石蠟切片機(上海賽默飛世爾科技有限公司); Vectra3定量病理成像分析系統(上海珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司)。

2 方 法

2.1 實驗分組與造模

C57(每組10只,全雄)小鼠隨機分為正常組,模型組,RLCE低(11.2 mg·kg-1)、中(22.4 mg·kg-1)、高(44.8 mg·kg-1)劑量組。根據文獻報道的劑量和方法[7],結合預試驗結果,模型組及給藥組小鼠以0.1 mL/10 g的給藥體積連續(xù)腹腔注射MPTP(25 mg·kg-1) 28 d,正常組小鼠給予等體積的生理鹽水。于MPTP造模前48 h對給藥組小鼠以0.05 mL/10 g的給藥體積單次肌肉注射RLCE,正常組與模型組小鼠給予等劑量的1% CMC-Na,并于給藥后26～30 d進行行為學觀察。

2.2 行為學實驗

2.2.1 埋丸實驗 埋丸實驗檢測小鼠的嗅覺識別能力[8]。將食物顆粒埋藏在干凈的玉米墊料下0.5 cm處,小鼠進入鼠盒時開始計時。記錄小鼠尋找食物顆粒的時間,若5 min找不到即記為300 s,允許小鼠找到食物顆粒后吃完作為獎勵。實驗連續(xù)進行3 d,取三次平均值進行統計;第四天將食物顆粒放在墊料表面,記錄各組小鼠尋找食物顆粒的時間,以排除各組小鼠因缺乏動機造成的差異。

2.2.2 木塊實驗 以木塊實驗檢測小鼠嗅覺辨別能力[8]。準備實驗木塊2 cm×2 cm×2 cm,放入裝有雌鼠籠墊料的袋子內,室溫放置24 h。實驗時,試驗區(qū)域分別放置帶有雌性小鼠的氣味的木塊和不作任何處理的空白木塊。在實驗區(qū)域的正中央放入實驗鼠,錄像5 min,統計小鼠嗅聞目標木塊(帶有雌性小鼠氣味)的時間與空白木塊的時間。計算小鼠的識別指數:

2.3 Western Blot 實驗

每組隨機取3只小鼠,斷頸,心臟灌流,分離嗅球。RIPA裂解,超聲,15 000 r·min-1離心15 min,BCA法配置蛋白,以每孔50 μg的上樣量進行蛋白電泳,轉膜,常溫牛奶孵育2 h,一抗4 ℃過夜處理,次日二抗常溫孵育2 h,采用ECL顯影液顯影。Image J 2.0軟件進行分析,相對積分光密度(IDO)比值表示結果。

2.4 免疫組化法檢測小鼠黑質及嗅球TH的表達

每組隨機取3只小鼠,斷頸,采用4 %多聚甲醛進行心臟灌注,取腦,4 ℃固定24 h。腦組織脫水固定,按照免疫組化試劑盒中的步驟進行染色并封片。Vectra3定量病理成像系統拍攝圖片,Image J 2.0軟件進行分析。

2.5 統計學方法

3 實驗結果

3.1 小鼠的狀態(tài)和數量觀察

給予MPTP 30 min后小鼠均出現震顫、行動遲緩、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、弓背、豎毛等情況。且在造模后期進行的行為學試驗中,模型組表現出明顯的嗅覺障礙,造模期間小鼠無死亡情況發(fā)生。RLCE治療后PD小鼠的震顫、行動遲緩、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、弓背、豎毛現象得到改善。

3.2 RLCE對PD小鼠嗅覺障礙的影響

如圖1所示,第1～3天的實驗中,與正常組相比,模型組小鼠尋找食物顆粒的時間顯著延長(###P<0.001),提示模型組小鼠出現了嗅覺察覺功能障礙;與模型組相比,RLCE各給藥組小鼠尋找食物顆粒的時間顯著降低(**P<0.01),結果表現出劑量依賴,提示RLCE改善了PD小鼠的嗅覺察覺功能障礙。第4天的實驗中各組小鼠尋找食物顆粒的時間無顯著性差異,因此排除小鼠因缺乏動機造成的實驗結果的差異。

圖1 埋丸實驗結果

如圖2所示,與正常組相比,模型組小鼠對目標木塊的識別指數顯著降低(##P<0.01),說明模型組小鼠嗅覺辨別功能發(fā)生障礙;與模型組相比,RLCE各給藥組小鼠對目標木塊的識別指數顯著提高(*P<0.05,**P<0.01),結果表現出劑量依賴性,提示RLCE改善了PD小鼠的嗅覺辨別能力。

圖2 木塊實驗結果

3.3 RLCE對PD小鼠嗅球及黑質 TH 表達的影響

如圖3所示,與正常組比較,模型組黑質TH神經元的表達量顯著降低(##P<0.01),與模型組相比,RLCE各給藥組黑質TH神經元的表達量均顯著增多(**P<0.01),結果表現出劑量依賴,說明RLCE對PD小鼠黑質的TH神經元具有保護作用。

圖3 各組小鼠黑質TH神經元的表達情況

如圖4所示,與正常組比較,模型組嗅球的TH神經元的表達量顯著升高(##P<0.01),與模型組相比,RLCE各給藥組嗅球TH神經元的表達量均顯著下降(**P<0.01),結果表現出劑量依賴,說明RLCE可抑制PD小鼠的TH神經元在嗅球內的異常增多。

圖4 小鼠嗅球TH神經元的表達情況

3.4 RLCE對PD小鼠嗅球蛋白表達的影響

3.4.1 RLCE對PD小鼠嗅球α-syn及P-α-syn表達的影響 如圖5所示,Western Blot 實驗結果顯示,與正常組相比,模型組小鼠嗅球α-syn、P-α-syn的表達量顯著提高(##P< 0.01);與模型組相比,各給藥組小鼠α-syn、P-α-syn的表達量顯著降低(**P<0.01)。圖6的免疫組化結果表明,模型組嗅球α-syn、P-α-syn的表達量顯著提高,RLCE給藥顯著降低了嗅球α-syn、P-α-syn的表達,結果提示RLCE可以顯著抑制PD小鼠嗅球α-syn的聚集及磷酸化。

圖5 小鼠嗅球α-syn及P-α-syn蛋白表達情況

圖6 小鼠嗅球α-syn及P-α-syn蛋白表達情況

3.4.2 RLCE對PD小鼠嗅球炎癥相關蛋白表達的影響 如圖7所示,與正常組相比,模型組小鼠嗅球IBA1、GFAP、iNOS的表達量顯著提高(##P<0.01),與模型組相比,各給藥組IBA1、GFAP、iNOS的表達量顯著降低(**P<0.01),表現出劑量依賴,說明RLCE可顯著降低PD小鼠嗅球內的炎癥反應。

圖7 小鼠嗅球IBA1、GFAP和iNOS蛋白的表達情況

4 討 論

PD是一種好發(fā)于老年人的神經退行性疾病,主要病理表現為黑質DA神經元缺失以及紋狀體神經末梢退行性變,但PD的病理改變并不局限于黑質-紋狀體系統,BRAAK等提出PD的標志性蛋白α-syn在PD早期首先出現在嗅球以及前嗅核[9],因此嗅覺功能障礙是PD 疾病進展中最早發(fā)生的非運動癥狀之一。Rotigotine是典型的DR受體激動劑,能有效改善PD運動癥狀,但其在PD嗅覺障礙中的應用未被明確探討。本研究評價RLCE對PD小鼠嗅覺障礙的改善作用,同時在α-syn的聚集和神經炎癥等方面探討其可能的作用機制,為PD嗅覺障礙的治療提供實驗依據。

MPTP及其代謝產物通過損害線粒體電子傳遞鏈,導致活性氧的產生,誘導DA神經元凋亡,從而產生類PD樣癥狀和病理特征[10],研究證實,MPTP可以誘導C57小鼠出現嗅覺障礙[11]。行為學觀察發(fā)現,與正常組比較,模型組小鼠尋找食物顆粒的時間顯著延長,對目標木塊的識別指數顯著下降,表明模型小鼠的嗅覺功能明顯降低,證實動物模型已成功構建。此外,給予RLCE可以明顯改善PD小鼠的嗅覺功能,且具有劑量依賴性,表明RLCE對PD嗅覺障礙具有治療作用。

TH是DA合成的限速酶,黑質內DA神經元丟失、TH神經元活性下降是PD的病理標志[12]。黑質的DA神經元可直接投射到嗅球的球周細胞層(GL),介導嗅覺感知。有研究發(fā)現,PD患者嗅球內TH可增加到原來的兩倍,認為可能是對黑質DA能神經元丟失的代償反應[13],且該過程可能與嗅覺障礙有關。本研究對黑質和嗅球進行了TH神經元的免疫組化染色,結果表明RLCE可增加黑質內TH神經元數量,降低嗅球GL內TH神經元的表達,說明RLCE可通過增加PD小鼠中腦黑質TH神經元的數量,來抑制嗅球內TH神經元的代償性增加。該結果可以解釋RLCE對PD嗅覺障礙的改善作用。

神經炎癥反應在PD的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。研究表明,嗅覺神經系統對炎癥因素存在易感性,而α-syn在神經元中的異常聚集是神經炎癥的主要刺激因素,一方面表現為小膠質細胞和星形膠質細胞的異?；罨?導致固有免疫系統異常,增加對受損神經元的攻擊;另一方面活化的小膠質細胞對α-syn降解效率顯著下降,進一步促進α-syn的聚集[14],加重嗅覺障礙病理。IBA1是一種小膠質細胞特異性鈣結合蛋白,是小膠質細胞活化的標記[15]。GFAP是星形膠質細胞活性的標志,活化的星形膠質細胞會激活誘導型一氧化氮合酶(iNOS)產生NO,從而激活炎癥反應[16]。實驗結果表明,RLCE給藥可降低嗅球α-syn、P-α-syn以及IBA1、GFAP、iNOS的表達,說明RLCE可抑制嗅球內膠質細胞及小膠質細胞的激活,降低炎癥反應,且該過程可能與其降低α-syn的聚集及磷酸化互為因果。

5 結 論

本研究結果表明,RLCE可以改善PD小鼠的嗅覺障礙,該過程可能與RLCE抑制PD小鼠嗅球內膠質細胞及小膠質細胞的激活,降低嗅球內的炎癥反應,減少α-syn的聚集及磷酸化,并降低嗅球內TH的代償性增加有關。