王美玲,韓建瑋,陳方軍,尹海波,張 俠

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264005)

蘆葦(Phragmiesaustralis),禾本科,蘆葦屬,具有較強(qiáng)的繁殖能力和環(huán)境適應(yīng)能力[1],在濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)中屬于優(yōu)勢物種[2]。蘆葦可以通過調(diào)整形態(tài)和生理特征來應(yīng)對水淹、鹽漬和極端氣候等不同類型的非生物脅迫[2],具有較高的生態(tài)價(jià)值。蘆葦在鹽脅迫下可以將體內(nèi)過多的Na+排出體外以減少離子的毒害[3],并通過調(diào)節(jié)體內(nèi)Na+和K+平衡,將Na+從地下組織轉(zhuǎn)運(yùn)到地上組織,因此對濕地有一定除Na+的作用[4]。蘆葦作為研究耐鹽脅迫的模式植物,已建立多個(gè)EST文庫并鑒定了大量功能基因。國內(nèi)外針對蘆葦?shù)倪z傳轉(zhuǎn)化報(bào)道甚少且大多使用下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織[5-6],研究并優(yōu)化蘆葦遺傳轉(zhuǎn)化體系,將有助于蘆葦重要基因功能的鑒定,更好地挖掘抗逆相關(guān)基因。

本研究利用山東東營濱海濕地的耐鹽蘆葦種子誘導(dǎo)愈傷組織,就愈傷組織分化、抗性篩選的條件進(jìn)行優(yōu)化探討,建立高頻轉(zhuǎn)化體系,同時(shí)利用沉默載體驗(yàn)證該體系的轉(zhuǎn)化效率,為進(jìn)一步鑒定抗逆相關(guān)基因提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

蘆葦種子采自山東東營濱海濕地,侵染用根瘤農(nóng)桿菌EHA105、沉默載體pFGC1008-GRPi(潮霉素hyp作為抗性標(biāo)記)由煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物發(fā)育分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 方法

1.2.1 光照對誘導(dǎo)愈傷組織的影響 挑選顆粒飽滿、大小相近的成熟蘆葦種子,75%乙醇振蕩消毒1 min;再用0.1%安替福民浸泡20 min,不間斷地輕輕振蕩;最后用無菌水振蕩清洗3 min,重復(fù)5～7次,放在無菌濾紙上吸干水份。

將消毒后的種子均勻放至誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,pH 5.8)上,每個(gè)培養(yǎng)皿接種30粒,4 ℃低溫處理36～48 h打破種子熱休眠,轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)室(25±2) ℃,光照強(qiáng)度2000 lx,分為以下3組進(jìn)行處理:(1)暗培養(yǎng)8 d;(2)光照培養(yǎng)8 d;(3)先進(jìn)行暗培養(yǎng)96 h,觀察到種子出現(xiàn)萌動(dòng)跡象再放于光下培養(yǎng)96 h。每個(gè)處理含10個(gè)培養(yǎng)皿。

待愈傷組織長到直徑0.3 cm左右,在超凈工作臺內(nèi)將褐化的芽切除,將愈傷組織轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),待愈傷組織生長到黃豆大小,挑選黃色致密的塊狀愈傷組織在繼代培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 2,4-D,pH 5.8)上培養(yǎng),每3周繼代一次,繼代3次,觀察其增殖情況,統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出愈傷組織數(shù)和出愈率。

出愈率=(誘導(dǎo)出愈傷組織數(shù)/接種的蘆葦種子數(shù))×100%。

1.2.2 根瘤農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和共培養(yǎng) 將pFGC1008-GRPi載體利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中,然后將構(gòu)建好的重組根瘤農(nóng)桿菌接種于含12.5 mg/L氯霉素(Chl)的甘露醇培養(yǎng)基(YEP)中,于28 ℃暗培養(yǎng)2 d,調(diào)整侵染液的吸光度值為0.07左右,培養(yǎng)得到的單菌落刮下后轉(zhuǎn)至30 mL AAM侵染液中,并輕輕搖晃。從誘導(dǎo)后的愈傷組織中挑選表面干燥、生長旺盛的在預(yù)/共培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 2,4-D+100 μmol/L AS,pH5.2)中預(yù)活化3 d,將活化后的愈傷組織切成直徑1 cm左右的組織塊置于侵染液中浸泡2～3 min,期間不斷晃動(dòng)以保證愈傷組織可以充分接觸侵染液。侵染完成后倒出懸浮液,取愈傷組織吸干水份,轉(zhuǎn)移至蓋有濾紙的預(yù)/共培養(yǎng)基中于23 ℃暗培養(yǎng)2～3 d。無菌水振蕩沖洗6～7次直至溶液完全澄清,然后用含250 μg/L頭孢的水振蕩3～5 min脫菌。

1.2.3 不同濃度潮霉素(Hyp)對轉(zhuǎn)化的影響 將上述脫菌后的愈傷組織用無菌濾紙吸干水份,置于不同濃度Hyp抗性的篩選培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 2,4-D+300 mg/L頭孢+12.5 mg/L Chl+30 mg/L蔗糖,pH 5.8)中。Hyp濃度梯度設(shè)置為40、45、50、55、60 mg/L,每個(gè)培養(yǎng)皿接入30塊愈傷組織,每個(gè)濃度處理含3個(gè)培養(yǎng)皿,培養(yǎng)兩周后,更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),重復(fù)篩選兩次后,統(tǒng)計(jì)抗性愈傷率。

抗性愈傷率=(抗性愈傷組織數(shù)/侵染的愈傷組織總數(shù))×100%。

1.2.4 不同濃度6-BA對分化的影響 挑選侵染后的黃色顆粒狀、疏松的抗性愈傷組織,分割成0.5 cm大小,接種在不同濃度6-BA的分化培養(yǎng)基(MS+0.08 mg/L IAA+50 mg/L Hyp+12.5 mg/L Chl,pH 5.8)上,6-BA濃度梯度設(shè)置為0.6、0.8、1.0 mg/L,每個(gè)培養(yǎng)皿接入22～25塊愈傷組織,每個(gè)處理含3個(gè)培養(yǎng)皿,等到長出綠色組織后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率。

不定芽分化率=(分化出不定芽的外植體數(shù)量/外植體總數(shù))×100%。

1.2.5 馴化與移栽 將出芽的愈傷組織于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩代(2周/代)后,將整株苗移入生根壯苗培養(yǎng)基(1/2MS+20 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA,pH 5.8),23 ℃光照誘導(dǎo)生根兩周,等到再生苗的根長到8～10 cm時(shí),將瓶苗移出,輕輕洗去根基部培養(yǎng)基,移栽到蛭石∶黑土=1∶1的移栽基質(zhì)中于溫室培養(yǎng)。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的檢測與鑒定 采用CTAB法提取候選轉(zhuǎn)基因植株葉片的基因組DNA,PCR擴(kuò)增hyp基因片段,以野生型蘆葦葉片DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性對照,重組載體擴(kuò)增產(chǎn)物為陽性對照。確定陽性轉(zhuǎn)基因株系,并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率=(PCR檢測均為陽性植株數(shù)/以最佳組合轉(zhuǎn)化的總愈傷組織數(shù))×100%。

提取陽性轉(zhuǎn)基因株系的RNA,根據(jù)蘆葦GPR基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照對誘導(dǎo)愈傷組織的影響

本研究分析了光照對外植體的生長狀態(tài)、顏色以及愈傷組織出現(xiàn)的時(shí)間等方面的影響,并統(tǒng)計(jì)不同光照培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織的數(shù)量和出愈率(表1)。與單一的光照或黑暗培養(yǎng)相比,暗培養(yǎng)96 h+光培養(yǎng)96 h條件下愈傷組織成長狀態(tài)最好,呈淺黃色,表面緊致,出愈率更高,且達(dá)91.0%。

表1 不同光照條件對蘆葦誘導(dǎo)愈傷組織的影響

2.2 Hyp篩選濃度的確定

蘆葦愈傷組織與根瘤農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后,被轉(zhuǎn)入含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上,以篩選出抗性轉(zhuǎn)基因組織?？股貪舛忍邥寡堪谆踔了劳?太低易出現(xiàn)假陽性植株。為了確定最佳的抗生素篩選濃度,設(shè)置培養(yǎng)基中Hyp分別為40、45、50、55、60 mg/L,分化率結(jié)果如表2所示。50 mg/L Hyp得到最優(yōu)分化效果,不定芽的個(gè)數(shù)最多,可作為蘆葦愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的篩選壓力。

表2 Hyp對不定芽生長及分化的影響

2.3 分化培養(yǎng)基中6-BA濃度對不定芽發(fā)生的影響

6-BA作為一種強(qiáng)分裂素,其濃度也會影響愈傷組織的分化[7],若濃度太低會使不定芽分化太慢,濃度太高則易出現(xiàn)褐化。在愈傷組織兩次繼代分化出芽的過程中,設(shè)置不同6-BA濃度,分析其對分化的影響,結(jié)果如表3所示,當(dāng)6-BA為0.8 mg/L時(shí),分化出不定芽個(gè)數(shù)最多,平均出芽率達(dá)97.1%,由此確定最適分化培養(yǎng)基為:MS+0.8 mg/L IAA+50 mg/L Hyp+12.5 mg/L Chl+0.8 mg/L 6-BA。

表3 6-BA濃度對不定芽發(fā)生的影響

2.4 蘆葦遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

蘆葦遺傳轉(zhuǎn)化體系如圖1所示。消毒后的耐鹽蘆葦種子放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,4～5 d后開始出現(xiàn)白色幼芽,10 d左右芽的基部開始誘導(dǎo)出黃色愈傷組織(圖1(a)),三周左右形成淡黃色的胚性愈傷組織(圖1 (b))。將褐化的愈傷組織切除后進(jìn)行繼代培養(yǎng),繼代后胚性愈傷組織呈不均一的淡黃色、緊密顆粒狀,生長速度快。將愈傷組織切成1 cm左右塊狀進(jìn)行根瘤農(nóng)桿菌侵染,在預(yù)/共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2～3 d(圖1(c))后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基篩選3代,形成抗性愈傷組織(圖1(d)),抗性愈傷組織分化5～8 d后開始變綠,15 d后不定芽長到0.3～0.5 cm(圖1(e)),待芽長到3～5 cm時(shí)轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中,5 d左右長出須根(圖1(f)),在溫室煉苗2～3周后移栽到蛭石∶黑土=1∶1的基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)(圖1(g))。

圖1 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘆葦遺傳轉(zhuǎn)化體系

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的檢測

利用表達(dá)載體上篩選標(biāo)記基因hyp對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示,目的基因hyp大小約500 bp,陰性對照組無擴(kuò)增產(chǎn)物,轉(zhuǎn)基因株系T0-1、T0-2、T0-3、T0-4、T0-5、T0-6、T0-7、T0-8均得到預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 蘆葦轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR鑒定

分別提取以上T0代轉(zhuǎn)基因株系的RNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測植株GPR基因的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3所示,目的基因GPR在各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)都呈現(xiàn)出降低趨勢,其中轉(zhuǎn)基因株系T0-1的表達(dá)量降至對照植株的73.5%,達(dá)到顯著差異;轉(zhuǎn)基因株系T0-4、T0-5、T0-6、T0-7和T0-8的表達(dá)量與對照相比降幅均超過40%,達(dá)到極顯著差異。但T0-2、T0-3中目的基因表達(dá)量下降水平與對照相比差異不明顯?？傮w來看,轉(zhuǎn)基因抗性株系中,獲得較強(qiáng)沉默干擾效果的株系達(dá)75%。

圖3 轉(zhuǎn)基因株系GPR基因相對表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

本研究采用山東東營濱海濕地的耐鹽蘆葦進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。通過改變愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件發(fā)現(xiàn),與單一的光照或暗培養(yǎng)相比,在光培養(yǎng)與暗培養(yǎng)的組合條件下愈傷組織生長更快、狀態(tài)更佳。在最適分化培養(yǎng)基中共得到203塊抗性愈傷組織,愈傷誘導(dǎo)率達(dá)91.0%,與其他研究報(bào)道[8-11]相比,誘導(dǎo)效率較高,有利于后期芽的分化。

選擇標(biāo)記基因早在1989年由MCHUGHEN于亞麻植物中成功應(yīng)用[11],為基因轉(zhuǎn)化開辟了一條捷徑。根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中潮霉素hyp是較為常用的抗性基因[12-13],故本研究沿用hyp作為轉(zhuǎn)基因植株的篩選標(biāo)記。潮霉素的篩選濃度對轉(zhuǎn)化有重要影響[14],本研究條件下蘆葦愈傷組織對潮霉素的耐受濃度為50 mg/L,篩選兩代后抗性愈傷率為44%。

分裂素是大多數(shù)禾本科植物分化出芽的必要條件,在本研究中,6-BA為0.8 mg/L時(shí)愈傷組織分化率可達(dá)97.1%,這與周曉燕等[6]的研究結(jié)果相似,與同屬的禾本科植物水稻和大麥相比[8-9],6-BA濃度相近。

本研究建立了根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐鹽蘆葦遺傳轉(zhuǎn)化體系,經(jīng)過根瘤農(nóng)桿菌侵染、篩選、PCR鑒定后,T0代陽性轉(zhuǎn)基因株系的轉(zhuǎn)化率為13.8%。高鴻等[5]同樣利用根瘤農(nóng)桿菌侵染的方式對蘆葦愈傷組織進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化,平均轉(zhuǎn)化率僅為7%左右。此外,本研究利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株,其中具有較強(qiáng)沉默干擾能力的株系比例高達(dá)75%,也高于同類研究結(jié)果[15-16]?？梢?本研究中建立的蘆葦遺傳轉(zhuǎn)化體系較為成熟,遺傳轉(zhuǎn)化率較高,可為后續(xù)耐鹽蘆葦?shù)幕蚬δ苎芯考翱鼓鏅C(jī)制分析提供基礎(chǔ)。