劉婧雯，宋昊昕，朱 蕾

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)表觀遺傳研究中心 藥理學(xué)系，北京 100005

FIP1L1-PDGFRA(fip1-like 1-platelet-derived growth factor receptor alpha, F/P)是一種融合基因,其形成是由于染色體4q12的間隙性缺失,使其上游短缺的FIP1L1基因融合至斷裂的PDGFRA基因上。該融合基因首先在高嗜酸性粒細(xì)胞綜合征(hypereosinophilic syndrome, HES)中被鑒定,后續(xù)研究證實(shí)它是慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病(chronic eosinophilic leukemia, CEL)的主要病因[1-3]。來(lái)源于CEL患者的人急性髓細(xì)胞(嗜酸粒細(xì)胞)白血病細(xì)胞[human acute myeloid cells (eosinophils) leukemia cells, EOL-1]細(xì)胞系表達(dá)該基因,因此被作為研究F/P融合基因以及CEL的體外細(xì)胞模型[4]。此外,在系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥、急性髓系白血病以及T淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤等血液疾病中亦可出現(xiàn)該融合基因[5-6]。

F/P融合基因編碼的F/P融合蛋白具有組成性酪氨酸激酶活性,可促嗜酸性粒細(xì)胞克隆性增殖,造成組織器官損害。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)伊馬替尼(imatinib)可以靶向PDGFR,對(duì)CEL等存在F/P融合基因的疾病具有較好療效[7-8],但使用后出現(xiàn)的T674I和D842V突變致伊馬替尼耐藥問(wèn)題較為突出。索拉非尼(sorafenib)和尼洛替尼(nilotinib)被報(bào)道對(duì)伊馬替尼耐藥的T674I突變有效,但D842V突變則對(duì)多種TKIs完全耐藥,僅對(duì)阿法替尼(avapritinib)敏感[9-10]。另外,TKIs在使用中產(chǎn)生的毒副作用亦不容忽視。鑒于此,發(fā)現(xiàn)安全和高活性的靶向F/P融合蛋白及其突變體的新藥是臨床上迫切需要解決的難題。

本研究擬構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)F/P及其突變體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株BaF3-F/P、BaF3-F/P-T674I和BaF3-F/P-D842V,并通過(guò)檢測(cè)它們對(duì)伊馬替尼、索拉非尼和阿法替尼等TKIs陽(yáng)性藥的響應(yīng)以評(píng)價(jià)其活性,以期為開(kāi)發(fā)以F/P及其T674I、D842V突變?yōu)榘悬c(diǎn)的化合物提供良好的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系與細(xì)胞株:小鼠原B淋巴細(xì)胞系(BaF3中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心);BaF3-F/P、BaF3-F/P-T674I和BaF3-F/P-D842V穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(穩(wěn)轉(zhuǎn))細(xì)胞株(賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建)。

1.1.2 主要試劑: IMDM培養(yǎng)基和雙抗(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心);胎牛血清(FBS,Gibco公司);小鼠IL-3(CST公司);CCK8(蘭杰柯科技有限公司);伊馬替尼、索拉非尼和阿法替尼(MedChemexpress公司);其余試劑由賽業(yè)生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng):將BaF3細(xì)胞用含10% FBS和1 ng/mL IL-3的IMDM培養(yǎng)基(含雙抗)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);BaF3-F/P、BaF3-F/P-T674I和BaF3-F/P-D842V細(xì)胞用含10% FBS的IMDM培養(yǎng)基(含雙抗)培養(yǎng),取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞做研究。

1.2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建:構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體(LV-EFS>FIP1L1-PDGFRA-CMV>EGFP/T2A/Puro;LV-EFS>FIP1L1-PDGFRA-T674I-CMV>GFP/T2A/Puro;LV-EFS>FIP1L1-PDGFRA-D842V-CMV>EGFP/T2A/Puro;空載體為L(zhǎng)V-CMV>EGFP/T2A/Puro),酶切并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,經(jīng)測(cè)序(圖1)比對(duì),驗(yàn)證正確無(wú)誤后,與包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行慢病毒包裝并進(jìn)行滴度檢測(cè)。以重組慢病毒感染BaF3細(xì)胞,用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞。在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光(圖2),熒光率在80%以上。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)鑒定后分別命名為BaF3-F/P、BaF3-F/P-T674I、BaF3-F/P-D842V和BaF3-empty vector細(xì)胞。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)mRNA:RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR均按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,基因定量表達(dá)采用2-ΔΔCt法。引物見(jiàn)表1。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖:收集細(xì)胞并制備細(xì)胞懸液,以3×105個(gè)/孔密度接種于96孔板中,加入不同濃度伊馬替尼、索拉非尼或阿法替尼,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24 h和48 h后,加入CCK-8試劑。繼續(xù)孵育1 h后,用酶標(biāo)儀在450 mm處測(cè)定吸光度,并計(jì)算增殖抑制率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中FIP1L1和PDGFRA mRNA的表達(dá)

3組細(xì)胞均表達(dá)FIP1L1和PDGFRA mRNA,而B(niǎo)aF3-empty vector細(xì)胞無(wú)表達(dá)(圖3)。

#P<0.05,##P<0.01 compare with BaF3-empty vector;*P<0.05,**P<0.01 compare with BaF3-F/P.圖3 QPCR檢測(cè)FIP1L1和PDGFRA的mRNA表達(dá)Fig 3 The mRNA expressions of FIP1L1 and PDGFRA were detected by n=3)

2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株對(duì)TKIs的敏感性

BaF3細(xì)胞的增殖需要依賴(lài)IL-3,而B(niǎo)aF3-F/P、BaF3-F/P-T674I和BaF3-F/P-D842V細(xì)胞在無(wú)IL-3培養(yǎng)條件下仍具有較強(qiáng)增殖能力。伊馬替尼和索拉非尼在較低的濃度即可抑制BaF3-F/P細(xì)胞的增殖,伊馬替尼作用24 h和48 h的IC50分別為0.3624 nmol/L和0.129 8 nmol/L,索拉非尼在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IC50均低于0.01 nmol/L;索拉非尼和阿法替尼可抑制BaF3-F/P-T674I細(xì)胞增殖,索拉非尼作用24 h和48 h的IC50分別為24.7 nmol/L和476.3 nmol/L,阿法替尼作用24 h和48 h的IC50分別為4 376 nmol/L和434.8 nmol/L;而B(niǎo)aF3-F/P-D842V細(xì)胞僅對(duì)高濃度阿法替尼敏感,24 h和48 h的IC50分別為474.1 nmol/L和1 867 nmol/L(圖4)。

圖4 TKIs對(duì)BaF3-F/P、BaF3-F/P-T674I和BaF3-F/P-D842V 細(xì)胞的增殖抑制作用Fig 4 Inhibitory effects of TKIs on the proliferation of BaF3-F/P, BaF3-F/P-T674I and BaF3-F/P-D842V

3 討論

在F/P融合基因中,FIP1L1基因斷裂點(diǎn)多變,而PDGFRA基因的斷裂點(diǎn)主要集中在第12號(hào)外顯子,使跨膜決定區(qū)的第一個(gè)W(色氨酸)殘基缺失,導(dǎo)致負(fù)性調(diào)控體的WW結(jié)構(gòu)域被破壞,PDGFRA酪氨酸激酶的自我抑制作用消失而持續(xù)活化,進(jìn)一步異常激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,包括RAS-RAF-ERK、PI3K-AKT以及JAK-STAT等,致使細(xì)胞增殖失控和腫瘤生成[11]。尤其在CEL中,F/P融合基因是其特征性基因,可以驅(qū)動(dòng)外周血、骨髓和周?chē)M織中嗜酸性粒細(xì)胞持續(xù)增多,釋放細(xì)胞因子、酶或其他蛋白,導(dǎo)致靶器官損害,其中心、肺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚和胃腸道最常受累,心肺功能衰竭是患者的主要死因。因此,F/P已成為CEL的藥物探索靶標(biāo)[8]。

鑒于F/P融合蛋白具有受體酪氨酸激酶活性,TKI伊馬替尼是目前治療F/P相關(guān)疾病的首選藥物,但長(zhǎng)期使用可引起骨髓造血紊亂,且不能緩解F/P融合蛋白過(guò)度活化引起的心臟損害,而靶細(xì)胞壞死釋放大量毒素會(huì)加重心臟毒性并引起致死性心臟衰竭[7]。此外,T674I和D842V等位于ATP結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的點(diǎn)突變是造成伊馬替尼獲得性耐藥的主要機(jī)制[11]。P/F-T674I屬于gatekeeper突變,gatekeeper位置的蘇氨酸(T)被替換為更大更親脂的異亮氨酸(I),阻止伊馬替尼進(jìn)入ATP結(jié)合位點(diǎn)的疏水口袋[12]。索拉非尼和尼洛替尼在體外實(shí)驗(yàn)中顯示對(duì)T674I突變的有效性[9],但臨床效果有限[13]。P/F-D842V突變則影響ATP結(jié)合口袋中活化環(huán)的調(diào)控功能,不利于伊馬替尼、索拉非尼等傳統(tǒng)Ⅱ型TKIs的結(jié)合[14],阿法替尼是目前唯一針對(duì)PDGFRA D842V突變的靶向藥物[8]。

針對(duì)上述臨床治療中面臨的困境和挑戰(zhàn),構(gòu)建合適的細(xì)胞篩選模型并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)高活性、高選擇性且毒副作用小的新型藥物具有重要意義。本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)F/P及其突變體的BaF3-F/P、BaF3-F/P-T674I和BaF3-F/P-D842V細(xì)胞系。選用的靶細(xì)胞是BaF3,其增殖是依賴(lài)細(xì)胞因子IL-3的,而轉(zhuǎn)化F/P以及T674I、D842V突變體的BaF3細(xì)胞則能表現(xiàn)出不依賴(lài)IL-3增殖的惡性表型特征。進(jìn)一步,檢測(cè)3株細(xì)胞對(duì)相應(yīng)TKIs的敏感性以評(píng)價(jià)其活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BaF3-F/P細(xì)胞對(duì)伊馬替尼和索拉非尼敏感;BaF3-F/P-T674I細(xì)胞對(duì)伊馬替尼耐藥,對(duì)索拉非尼敏感;而B(niǎo)aF3-F/P-T674I細(xì)胞對(duì)伊馬替尼和索拉均耐藥,僅較高濃度的阿法替尼能抑制其增殖;上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的F/P以及T674I、D842V突變對(duì)TKIs的響應(yīng)是一致的。綜上,本研究成功構(gòu)建了靶向F/P及其T674I、D842V突變的化合物篩選細(xì)胞模型,為后續(xù)篩選和評(píng)價(jià)新型靶向藥物奠定基礎(chǔ)。