王 燕,楊宇軒,彭 玥,郭忠琴

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高,高尿酸血癥(HUA)的發(fā)病率也呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì),且與動(dòng)脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、冠心病和糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展及死亡密切相關(guān),已然成為危害人類健康的主要疾病之一。因此,構(gòu)建高尿酸血癥模型是疾病研究及高效安全的降尿酸藥物研發(fā)的基礎(chǔ)。

近年來,高果糖飲食已被證實(shí)與痛風(fēng)發(fā)病呈正相關(guān)[1],長(zhǎng)期的高果糖攝入正在影響著人類的健康[2-4]。對(duì)于年輕群體來說,由于現(xiàn)代食品技術(shù)的改進(jìn),添加糖[高果糖玉米糖漿(HFCS)]代替了傳統(tǒng)的蔗糖糖漿,廣泛應(yīng)用于食品加工,已經(jīng)成為乳制品、軟飲料、面包和糕點(diǎn)等加工食品中的主要甜味劑[5]。含糖飲料、烘焙糕點(diǎn)以及高糖水果的大量攝入都是尿酸升高的潛在影響因素。已有研究表明,果糖是唯一能通過長(zhǎng)期攝入使血清尿酸升高的糖類[6]。為了模擬人類因高糖飲食而引起的高尿酸血癥,建立長(zhǎng)期、穩(wěn)定、肝腎損傷小的高尿酸血癥動(dòng)物模型,本研究以SD大鼠為研究對(duì)象,利用氧嗪酸鉀競(jìng)爭(zhēng)性地與大鼠體內(nèi)尿酸酶結(jié)合,抑制尿酸分解的特性[7-9]聯(lián)合果糖,根據(jù)三因素兩水平的正交設(shè)計(jì)探索給藥劑量與給藥途徑的最佳配伍。

1 資料與方法

1.1 一般資料:用到的試劑和儀器有果糖[(D-(-)-Fructose,美國SIGMA公司)];氧嗪酸鉀(OAPS,美國SIGMA公司);尿酸、尿素氮、肌酐測(cè)定試劑盒[貝克曼庫爾特(愛爾蘭)股份有限公司];AU400全自動(dòng)生化分析儀(Olympus)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠20只,體重(180±20)g。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案通過寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心審批,符合寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(動(dòng)物許可證IACUC-NYLAC-2022-030)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立:按照完全隨機(jī)設(shè)計(jì)將20只大鼠分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組,共5組,再根據(jù)三因素兩水平正交設(shè)計(jì)表按照相應(yīng)實(shí)驗(yàn)安排將實(shí)驗(yàn)組分為4組[A1B1C1組采用5%果糖水+100 mg/(kg·d)OAPS灌胃;A1B2C2組采用5%果糖水+200 mg/(kg·d)OAPS腹腔注射;A2B1C2組采用10%果糖水+100 mg/(kg·d)OAPS腹腔注射;A2B2C1組采用10%果糖水+200 mg/(kg·d)OAPS灌胃],其中,灌胃組每日8:00給藥,腹腔注射組每日8:00和18:00給藥,連續(xù)給藥8周。

1.3.2 樣本的收集及血清生化指標(biāo)測(cè)定:各組大鼠于實(shí)驗(yàn)開始前、實(shí)驗(yàn)開始后第2、4、6周進(jìn)行眼眶靜脈竇采血,第8周末進(jìn)行心尖取血,取血前禁食并禁水12 h。血液靜置2 h后以轉(zhuǎn)速2 000 r/min離心15 min,取上層血清,于-80 ℃冰箱保存。將冷凍保存的血清常溫解凍,使用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行尿酸、尿素氮、肌酐水平的測(cè)定。心臟血收集結(jié)束后,取右葉肝臟、右側(cè)腎臟制作HE染色切片,光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間各組大鼠生長(zhǎng)情況及血清學(xué)變化比較

2.1.1 不同時(shí)間各組大鼠體重比較:整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠活動(dòng)正常、毛色正常、精神狀態(tài)良好、體重增長(zhǎng)均勻、未出現(xiàn)死亡,見表1。

表1 不同時(shí)間各組大鼠體重比較

2.1.2 不同時(shí)間各組大鼠飲水量比較:第0周為大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)階段,從實(shí)驗(yàn)第1周開始各實(shí)驗(yàn)組大鼠自由飲用果糖水,從實(shí)驗(yàn)第2周開始,除A1B2C2組第3周、第8周、A2B1C2組第7周,A2B2C1組第8周外,各組間飲水量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 不同時(shí)間各組大鼠飲水量比較

2.1.3 不同時(shí)間各組大鼠尿酸水平比較:實(shí)驗(yàn)第8周時(shí),各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察各組尿酸變化趨勢(shì),僅有A1B1C1組大鼠尿酸出現(xiàn)明顯升高趨勢(shì),其余各組大鼠尿酸水平變化比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 不同時(shí)間各組大鼠尿酸水平比較

2.1.4 不同時(shí)間各組大鼠血清尿素氮水平比較:僅在實(shí)驗(yàn)第2周時(shí),各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余各時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4。

表4 不同時(shí)間各組大鼠血清尿素氮水平比較

2.1.5 不同時(shí)間各組大鼠血清肌酐水平比較:空白對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清肌酐水平均呈上升趨勢(shì),實(shí)驗(yàn)第8周時(shí),各組大鼠血清肌酐比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A1B1C1組、A2B2C1組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表5。

表5 不同時(shí)間各組大鼠血清肌酐水平比較

2.2 各組大鼠組織病理切片觀察

2.2.1 肝臟組織病理切片觀察:肉眼觀察空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟外觀,發(fā)現(xiàn)其呈紅褐色,表面光滑,質(zhì)軟有彈性;實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟個(gè)別出現(xiàn)水腫、體積增大。鏡下觀察空白對(duì)照組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心于小葉周圍呈放射狀排列,大小均勻,肝細(xì)胞間界限清晰。實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。實(shí)驗(yàn)組均有不同程度的肝細(xì)胞萎縮、肝竇擴(kuò)張及肝細(xì)胞脂肪變性,整體損傷較輕,A2B2C1組出現(xiàn)一處點(diǎn)狀壞死,見圖1(封2)。

2.2.2 腎臟組織病理切片觀察:肉眼觀察空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟外觀,發(fā)現(xiàn)其呈紅褐色,蠶豆?fàn)?質(zhì)地柔軟,表面光滑無腫塊,切面腎皮質(zhì)與腎髓質(zhì)分界清晰。鏡下觀察空白對(duì)照組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)完整,腎小球、腎小管形態(tài)正常,分布均勻,未見明顯萎縮或增生,無明顯炎癥浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)完整,腎小球未見損傷,均以腎小管損傷為主,可見輕微擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。腎小管管壁無增厚,管腔內(nèi)無結(jié)晶、沉淀,各實(shí)驗(yàn)組可見不同程度的刷狀緣脫落,少見腎小管水腫,A2B2C1組可見明顯小灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn),無明顯纖維化,見圖2(封2)。

2.3 正交設(shè)計(jì)分析:正交設(shè)計(jì)分析以三因素兩水平的果糖水濃度、OAPS給藥濃度、OAPS給藥途徑對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠尿酸影響的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算及方差分析。使用Minitab 19軟件對(duì)各因子進(jìn)行極差分析。可從均值響應(yīng)表中得出果糖濃度對(duì)大鼠尿酸影響最大,取值為水平1(5%);其次為OAPS給藥途徑,取值為水平1(灌胃);OAPS給藥濃度對(duì)大鼠尿酸影響相對(duì)較小,為次要因素,取值為水平1 100 mg/(kg·d)。說明3個(gè)因素的影響排序?yàn)楣撬疂舛?OAPS給藥途徑>OAPS給藥劑量。綜合分析正交最優(yōu)組合為A1B1C1,見表6。

表6 大鼠尿酸水平極差分析

3 討論

本研究選用果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀使大鼠體內(nèi)尿酸水平升高,從而構(gòu)建大鼠高尿酸血癥模型。劉杰[10]采用濃度為5%和10%的果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀100 mg/(kg·d)造模,發(fā)現(xiàn)濃度為5%的果糖引起的大鼠肝腎損傷較小,更適合應(yīng)用于控制和治療高尿酸血癥的藥物篩選。Dhouibi等[11]連續(xù)15 d 對(duì)大鼠進(jìn)行250 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀腹腔注射,建立慢性高尿酸血癥模型,而15 d 后停止腹腔注射,大鼠尿酸逐漸恢復(fù)至正常水平。Patil等[12]比較了幾種已經(jīng)報(bào)道的高尿酸血癥模型,發(fā)現(xiàn)同種藥物在不同給藥途徑下(如灌胃、腹腔注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射)可能導(dǎo)致不同的結(jié)果。本課題采用正交設(shè)計(jì)開展實(shí)驗(yàn),實(shí)現(xiàn)了不同給藥途徑和給藥濃度構(gòu)建高尿酸血癥大鼠模型的探究。

在正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)下,4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中僅有A1B1C1組大鼠尿酸水平持續(xù)上升,上升程度不高但整體呈現(xiàn)緩慢穩(wěn)定上升趨勢(shì),且第8周大鼠尿酸水平與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余組別大鼠尿酸水平上升均不明顯,這可能是由于該組果糖水?dāng)z入量遠(yuǎn)高于其他各組,過量果糖水的攝入引起了尿酸代謝異常,很好地模擬了長(zhǎng)期高果糖攝入導(dǎo)致的高尿酸血癥。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間血清肌酐整體呈上升趨勢(shì),第8周A1B1C1組與A2B2C1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)合2組腎臟病理切片,發(fā)現(xiàn)確有輕微腎臟損傷;血清尿素氮水平無明顯變化,僅在第2周出現(xiàn)組間差異(P<0.05),這些結(jié)果表明各組大鼠腎臟組織均出現(xiàn)了不同程度的損傷。大鼠肝臟組織病理切片結(jié)果顯示,各組大鼠肝臟組織出現(xiàn)輕微損傷,少見肝細(xì)胞脂肪變性,可能與高果糖的攝入有關(guān)。有研究[13-15]證實(shí)長(zhǎng)期攝入果糖會(huì)引起大鼠產(chǎn)生脂肪肝的病理改變,這種改變通常出現(xiàn)在高果糖攝入的第8周,這與本實(shí)驗(yàn)觀察的結(jié)果相符。

正交設(shè)計(jì)結(jié)果分析顯示,果糖水濃度對(duì)模型尿酸水平升高影響最大,其次為OAPS給藥途徑,給藥濃度影響相對(duì)較弱。5%果糖水對(duì)于該模型的影響最大,OAPS灌胃次之。本實(shí)驗(yàn)周期較短,腹腔注射未出現(xiàn)不良反應(yīng),但基于氧嗪酸鉀不溶于水的特性,腹腔注射極易引起腹腔積水等不良反應(yīng)。出于建立長(zhǎng)期穩(wěn)定的高尿酸血癥模型考慮,選取灌胃的給藥方式對(duì)大鼠的刺激較輕,構(gòu)建的高尿酸血癥模型也更好[16]。此外,高濃度的氧嗪酸鉀造模對(duì)腎臟損傷較大[17-18],且尿酸升高極不穩(wěn)定。故結(jié)合本實(shí)驗(yàn)正交分析各因子效應(yīng)程度,初步推斷最優(yōu)組合為A1B1C1組。

結(jié)合基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析、正交設(shè)計(jì)結(jié)果與肝、腎組織HE染色病理改變,本研究認(rèn)為在不同果糖濃度、不同OAPS劑量及不同給藥方式下探索的最優(yōu)高尿酸血癥大鼠模型配伍為5%果糖聯(lián)合100 mg/(kg·d)OAPS灌胃。