唐杰夫 ，楊德興 ，劉圣哲 ，王 強(qiáng) ，付 凱 ，王振方 ，欒 英 ，李 敏 ，劉 榮

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年ICU，云南 昆明 650032;2）云南省第一人民醫(yī)院急診內(nèi)科，云南 昆明 650034）

新型冠狀病毒感染（COVID-19，以下簡(jiǎn)稱新冠感染）是由新型冠狀病毒（SARS CoV-2，以下簡(jiǎn)稱新冠病毒）感染導(dǎo)致的疾病，自2019 年爆發(fā)以來(lái)已在全球造成約7 億人感染[1]，對(duì)人類健康和生命安全造成巨大威脅。根據(jù)中國(guó)疾控中心報(bào)道[2]，全國(guó)住院新冠重癥感染者數(shù)量于2023 年1月5 日達(dá)到12.8 萬(wàn)，2022 年12 月至2023 年2 月國(guó)內(nèi)流行的變異株均為奧密克戎變異株及其亞種，主要流行株BA.5.2.4、BF.7.14 和DY.1 占比分別為45.6%、23.8%和8.4%。研究顯示[3-5]，高齡、有基礎(chǔ)疾病是新冠感染者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，60 歲以上重癥感染者死亡率高達(dá)55.7%。高齡重癥患者因其基礎(chǔ)疾病的復(fù)雜、免疫系統(tǒng)功能不佳更容易出現(xiàn)宿主免疫失調(diào)，將導(dǎo)致繼發(fā)感染、發(fā)展為危重癥等不良預(yù)后。由于奧密克戎變異株傳播能力和免疫逃逸能力較先前變異株有顯著增強(qiáng)[6-8]，存在二次感染和再次大規(guī)模流行導(dǎo)致高齡重癥感染者增加的風(fēng)險(xiǎn)。但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于奧密克戎變異株老年重癥感染者細(xì)胞免疫學(xué)臨床檢查特點(diǎn)的報(bào)道，因此，有必要探討奧密克戎變異株老年重癥感染者免疫反應(yīng)特點(diǎn)及其與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

納入標(biāo)準(zhǔn)：2022 年12 月至2023 年2 月于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年ICU 且年齡≥60 周歲住院治療的根據(jù)《新型冠狀病毒感染診療方案（試行第10 版）》[9]（以下簡(jiǎn)稱《診療方案》）確診新型冠狀病毒感染者，患者呼吸道標(biāo)本經(jīng)過(guò)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)為陽(yáng)性（CT 值 ＜ 35），入住ICU 完善12 項(xiàng)細(xì)胞因子、T 淋巴細(xì)胞亞群和感染相關(guān)免疫細(xì)胞檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院前已使用過(guò)免疫調(diào)節(jié)藥物；（2）入院前已使用抗新型冠狀病毒藥物（如奈瑪特韋片/利托那韋、莫諾拉韋或阿茲夫定等新型冠狀病毒特效藥）。

本研究共納入53 例新型冠狀病毒感染者。隨訪患者入ICU28d 預(yù)后，根據(jù)《診療方案》[9]將患者病情分為重型和危重型，根據(jù)ICU 28 d 預(yù)后分為存活組及死亡組。本研究為回顧性分析，按照倫理委員會(huì)政策標(biāo)準(zhǔn)，可在不泄露患者信息的前提下進(jìn)行臨床資料的分析和使用。

1.2 收集臨床數(shù)據(jù)

收集基礎(chǔ)信息包括：性別、年齡、合并的基礎(chǔ)疾病、SOFA 評(píng)分、GCS 評(píng)分、APACHE-II 評(píng)分；收集一般臨床檢查數(shù)據(jù)包括：血常規(guī)、血?dú)夥治?、肝腎功能、凝血功能；收集免疫學(xué)檢查指標(biāo)包括：12 項(xiàng)細(xì)胞因子、T 淋巴細(xì)胞亞群和感染相關(guān)免疫細(xì)胞檢測(cè)；收集臨床治療措施包括：血管活性藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑、機(jī)械通氣和俯臥位通氣的使用。SOFA 評(píng)分、GCS 評(píng)分和APACHE-II 評(píng)分采用患者入ICU 24 h 內(nèi)最差值，所有實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)均采用患者入ICU 首次檢查結(jié)果，記錄治療措施根據(jù)患者ICU 住院期間是否使用相應(yīng)治療記錄，PEEP 值根據(jù)患者入ICU 28 d 內(nèi)呼吸機(jī)參數(shù)平均值記錄。

1.3 病情分級(jí)依據(jù)

根據(jù)《診療方案》[9]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。

1.3.1 重型符合下列任何1 條且不能以新冠病毒感染以外其他原因解釋:（1）出現(xiàn)氣促，RR≥30 次/min；（2）靜息狀態(tài)下，吸空氣時(shí)指氧飽和度≤93%；（3）氧合指數(shù)≤300 mmHg；（4）臨床癥狀進(jìn)行性加重，肺部影像學(xué)顯示 24～48 h 內(nèi)病灶進(jìn)展 ＞ 50%。

1.3.2 危重型符合以下情況之一者:（1）出現(xiàn)呼吸衰竭，且需要機(jī)械通氣；（2）出現(xiàn)休克；（3）合并其他器官功能衰竭需ICU 監(jiān)護(hù)治療。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩獨(dú)立樣本之間采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]進(jìn)行表示，兩獨(dú)立樣本之間采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。二分類變量，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確概率檢驗(yàn)。使用多因素Logistic 回歸篩選影響因素并繪制ROC 曲線。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料特征

本研究共納入53 例診斷為新型冠病毒感染的患者，其中存活組22 例、死亡組31 例；平均年齡存活組78.5 歲、死亡組77 歲；存活組男性15 例、女性7 例，死亡組男性26 例、女性5 例；重型感染者存活組8 例、死亡組2 例；危重型感染者存活組14 例、死亡組29 例；高血壓患者存活組10 例、死亡組19 例；糖尿病患者存活組9 例、死亡組13 例；慢性腎病存活組0 例、死亡組2 例；冠心病患者存活組3 例、死亡組3 例；腦血管意外患者存活組1 例、死亡組6 例；慢性阻塞性肺病患者存活組0 例、死亡組3 例。所有患者均在入ICU 時(shí)記錄APACHE-II 評(píng)分、SOFA評(píng)分和GCS 評(píng)分。其中存活組與死亡組病情嚴(yán)重程度分級(jí)、SOFA 評(píng)分和GCS 評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。死亡組危重型患者更多、SOFA評(píng)分更高、GCS 評(píng)分更低。存活組與死亡組之間在年齡、性別、基礎(chǔ)疾病之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見(jiàn)表1。

表1 2 組患者基線資料比較[M（P25，P75）/n（%）/ ]Tab.1 Comparison of baseline data between the two groups [M（P25，P75）/n（%）/ ]

表1 2 組患者基線資料比較[M（P25，P75）/n（%）/ ]Tab.1 Comparison of baseline data between the two groups [M（P25，P75）/n（%）/ ]

APACHE-II評(píng)分：急性生理與慢性健康評(píng)分；SOFA評(píng)分：序貫器官衰竭評(píng)估評(píng)分；GCS評(píng)分：格拉斯哥昏迷評(píng)分；存活組與死亡組組間比較，*P ＜ 0.05。

2.2 患者一般實(shí)驗(yàn)室檢查特征

收集患者入ICU 后第1 次一般實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，其中死亡組與存活組之間在血乳酸、pH 值、OI 值、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值、PCT、ALB 和BNP 之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。死亡組OI 值、血常規(guī)淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、pH 值、ALB 更低，血乳酸、中性粒細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值、PCT、BNP 更高，見(jiàn)表2。

表2 2 組患者一般實(shí)驗(yàn)室檢查比較[M（P25，P75）/]Tab.2 Comparison of laboratory test results between the two groups [M（P25，P75）/ ]

表2 2 組患者一般實(shí)驗(yàn)室檢查比較[M（P25，P75）/]Tab.2 Comparison of laboratory test results between the two groups [M（P25，P75）/ ]

OI：氧合指數(shù)；PCT：降鈣素原；HS-CRP：超敏C反應(yīng)蛋白；PT：凝血酶原時(shí)間；APTT:活化部分凝血活酶時(shí)間；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALB：白蛋白；cTnI：肌鈣蛋白I；BNP：腦鈉肽;存活組與死亡組組間比較，*P ＜ 0.05。

2.3 患者12 項(xiàng)細(xì)胞因子檢測(cè)特征

收集的53 名患者入ICU 第1 次12 項(xiàng)細(xì)胞因子檢測(cè)分析，在死亡組及存活組之間IL-2、IL-10、IL-6 和IL-12P70 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。其中死亡組IL-2、IL-10、IL-6 和IL-12P70 均高于存活組。死亡組IL-4、IL-5、IL-8 和IFN-γ低于存活組，但組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見(jiàn)表3。

表3 2 組患者12 項(xiàng)細(xì)胞因子檢測(cè)比較[M（P25，P75）]Tab.3 Comparison of 12 cytokines between the two groups[M（P25，P75）]

2.4 患者T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)特征

收集患者T 淋巴細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)提示，死亡組與存活組之間淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、細(xì)胞毒/抑制性T 細(xì)胞絕對(duì)值和Th 輔助性T細(xì)胞絕對(duì)值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）且均明顯下降，見(jiàn)表4。

表4 2 組患者T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)比較[M（P25，P75）/ ]Tab.4 Comparison of T lymphocyte subsets examination data between the two groups[M（P25，P75）/ ]

表4 2 組患者T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)比較[M（P25，P75）/ ]Tab.4 Comparison of T lymphocyte subsets examination data between the two groups[M（P25，P75）/ ]

存活組與死亡組組間比較，*P ＜ 0.05。

2.5 患者感染相關(guān)免疫細(xì)胞特征

在納入的病例中，存活組與死亡組在CD64感染指數(shù)和HLA-DR%之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。其中死亡組的CD64 感染指數(shù)高于存活組、HLA-DR%低于存活組，見(jiàn)表5。

表5 2 組患者感染相關(guān)免疫細(xì)胞比較[]Tab.5 Comparison of infection-related immune cells data between the two groups[]

表5 2 組患者感染相關(guān)免疫細(xì)胞比較[]Tab.5 Comparison of infection-related immune cells data between the two groups[]

HLA-DR:人類白細(xì)胞抗原DR;Treg：調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞;存活組與死亡組組間比較，*P ＜ 0.05。

2.6 患者治療措施特征

所有新冠感染者均按照《診療方案》[9]進(jìn)行治療，在收集的患者數(shù)據(jù)中，使用血管活性藥物的存活組為9 例、死亡組有30 例，使用俯臥位通氣的患者，存活組10 例、死亡組6 例。上述2 種治療方式在死亡組和存活組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。但2 組間糖皮質(zhì)激素激素、免疫調(diào)節(jié)劑、抗凝藥物、機(jī)械通氣的使用和PEEP 值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見(jiàn)表6。

表6 2 組患者治療措施比較[n（%），M（P25，P75）]Tab.6 Comparison of treatment measures data between the two groups[n（%），M（P25，P75）]

2.7 患者細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)Logistic 回歸分析和ROC 曲線構(gòu)建

2.7.1 多因素Logistic 回歸分析通過(guò)上述臨床數(shù)據(jù)分析，得出死亡組與存活組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量，為進(jìn)一步分析影響患者預(yù)后的免疫學(xué)指標(biāo)高危因素，將單因素分析結(jié)果使用多因素Logistic 回歸篩選影響因素，結(jié)果顯示IL-6 升高和T 淋巴細(xì)胞降低是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表7。

表7 免疫指標(biāo)多因素Logistic 回歸分析Tab.7 The multivariate Logistic regression analysis of immune indicators

2.7.2 ROC 曲線構(gòu)建使用IL-6、T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和二者聯(lián)合進(jìn)行Logistic 回歸分析所得到的值分別構(gòu)建ROC 曲線，得到的曲線下面積分別為0.818、0.796 和0.887，見(jiàn)圖1、表8。

圖1 IL-6、T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值預(yù)測(cè)奧密克戎變異株老年重癥感染者28 d 預(yù)后ROC 曲線Fig.1 The ROC curves of IL-6 and absolute T lymphocyte count in prediction of 28 d prognosis of Omicron variant infected elderly severe patients

表8 IL-6、T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值預(yù)測(cè)奧密克戎變異株老年重癥感染者28 d 預(yù)后ROC 曲線Tab.8 The ROC curves of IL-6 and absolute T lymphocyte count in prediction of 28 d prognosis of Omicron variant infected elderly severe patients

3 討論

人體T 淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)在對(duì)抗病毒感染時(shí)至關(guān)重要[10]，新冠感染者淋巴細(xì)胞數(shù)量下降會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥。有研究指出[11-12]，新冠感染者早期便出現(xiàn)T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值下降，并且重癥患者的下降更為明顯。本研究也發(fā)現(xiàn)，大部分奧密克戎變異株重癥感染者淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、T 淋巴細(xì)胞（CD3+T cell）絕對(duì)值、細(xì)胞毒/抑制性T 細(xì)胞（CD8+T cell）絕對(duì)值、Th 輔助T 細(xì)胞（CD4+T cell）絕對(duì)值下降，且死亡組較存活組下降更為明顯。Chen 等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)新冠感染者的淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、CD4+T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和CD8+T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值下降，并且重型/危重型病例下降較輕/中型患者更為明顯，重癥患者的淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、CD4+T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和CD8+T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值與本研究結(jié)果基本吻合。除上述淋巴細(xì)胞數(shù)值下降外，Zheng 等[14]報(bào)道發(fā)現(xiàn)患者的自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell）也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其指出由于自然殺傷細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞對(duì)于控制病毒感染是必要的，這兩者下降與感染者疾病進(jìn)展密切相關(guān)。但本研究并未發(fā)現(xiàn)奧密克戎感染者存活組與死亡組之間自然殺傷細(xì)胞存在明顯差異。He 等[15]研究發(fā)現(xiàn)輕癥奧密克戎變異株感染者淋巴細(xì)胞減少，而且康復(fù)時(shí)間長(zhǎng)的感染者較康復(fù)時(shí)間短的感染者CD3+T 細(xì)胞絕對(duì)值、CD8+T 細(xì)胞絕對(duì)值、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值下降更明顯，這也證實(shí)了淋巴細(xì)胞減少與預(yù)后相關(guān)。

新冠病毒導(dǎo)致人體淋巴細(xì)胞減少的原因仍有待進(jìn)一步研究。已經(jīng)確認(rèn)新冠病毒是通過(guò)與人呼吸道黏膜細(xì)胞表面表達(dá)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2 受體（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）及跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）結(jié)合進(jìn)而感染人體。因此，有學(xué)說(shuō)[12，16]認(rèn)為新冠病毒可通過(guò)ACE2 受體直接感染人體免疫細(xì)胞并導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少。新冠感染者的淋巴細(xì)胞內(nèi)可找到新冠病毒RNA，這一證據(jù)看似支持上述觀點(diǎn)，但實(shí)際上含有新冠病毒RNA 的免疫細(xì)胞并不共表達(dá)ACE2 和TMPRSS2[17-18]。Shen 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，新冠病毒感染免疫細(xì)胞并不依賴ACE2 受體，其主要感染CD4+T 細(xì)胞且能誘發(fā)明顯的T 細(xì)胞死亡，因此新冠病毒可能是通過(guò)其他途徑感染淋巴細(xì)胞并導(dǎo)致淋巴細(xì)胞下降。雖然奧密克戎毒株在免疫監(jiān)視、免疫逃避及感染方式上較早前變異株有眾多不同[7，20-21]，但本研究證實(shí)奧密克戎毒株感染者的淋巴細(xì)胞絕對(duì)值也出現(xiàn)下降，且依舊以T 淋巴細(xì)胞下降為主。因此，有必要進(jìn)一步研究新冠病毒、特別是奧密克戎變異株導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少的原因。

許多研究表明CD64 感染指數(shù)是1 種有效判斷感染狀況的生物標(biāo)志物[22-23]，它可以幫助早期診斷膿毒血癥，并有助于區(qū)分細(xì)菌/病毒感染，本研究發(fā)現(xiàn)新冠感染者存活組與死亡組之間CD64差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且死亡組升高更明顯。有研究[24]指出在新冠重癥感染者中CD64 意味更嚴(yán)重的病情和不良預(yù)后，這一結(jié)論與本研究得出的結(jié)果相似。人類白細(xì)胞抗原-DR（HLA-DR）可反應(yīng)人體免疫系統(tǒng)情況，在膿毒癥患者中，HLADR%下降可反應(yīng)機(jī)體免疫系統(tǒng)抑制，目前研究認(rèn)為HLA-DR%可以幫助判斷患者繼發(fā)感染和臨床預(yù)后[25-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，奧密克戎變異株重癥感染者的預(yù)后情況與HLA-DR%下降有關(guān)，死亡組HLA-DR%明顯低于存活組，這項(xiàng)結(jié)果與國(guó)外1項(xiàng)研究一致[25]，HLA-DR 可以作為新冠重癥感染者預(yù)后的早期標(biāo)志物之一。

炎癥因子釋放綜合癥（cytokine release syndrome，CRS）是新冠感染者病情危重的一大表現(xiàn)[29]，新冠病毒感染導(dǎo)致的炎癥因子釋放引發(fā)了免疫系統(tǒng)過(guò)度激活，容易引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能衰竭，最終導(dǎo)致患者死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，奧密克戎毒株重癥感染者IL-2、IL-6、IL-10 和IL-12P70 在死亡組和存活組之間存在差異，其中死亡組指標(biāo)IL-6 升高明顯，這一結(jié)果與其他研究相似[15，30]。其中IL-6 在CRS 病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用，IL-6 可導(dǎo)致許多CRS 的關(guān)鍵癥狀，例如誘發(fā)彌漫性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）[31]。有研究提示IL-6 升高與新冠感染者預(yù)后不良相關(guān)[32-34]，與存活組比較，死亡組的IL-6 水平明顯升高，且IL-6 升高是死亡的預(yù)測(cè)因素[33]。由于IL-6 升高與不良預(yù)后相關(guān)，對(duì)于重癥患者可嘗試使用IL-6 抑制劑，如托珠單抗以改善患者病情[9，35]。

最后本研究使用多因素Logistic 分析篩選變量，得出IL-6 升高和T 淋巴細(xì)胞亞群降低為奧密克戎變異株老年重癥感染者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由上述2 項(xiàng)指標(biāo)分別建立ROC 曲線，IL-6 曲線下面積為0.818，T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值曲線下面積為0.796，二者聯(lián)合后曲線下面積為0.887。IL-6和T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值對(duì)判斷患者病情、了解預(yù)后情況和指導(dǎo)治療有重要意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)奧密克戎變異株可導(dǎo)致重癥感染者出現(xiàn)淋巴細(xì)胞減少癥，并可誘發(fā)機(jī)體炎癥因子釋放綜合癥，早期使用免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、減少炎性因子對(duì)機(jī)體破壞可以幫助降低患者死亡率。本研究還支持使用俯臥位通氣幫助重癥患者康復(fù)，俯臥位通氣是新冠病毒重癥感染者預(yù)后的保護(hù)因素，建議遵循《診療方案》[9]為合適的患者實(shí)施俯臥位通氣。同時(shí)，本研究納入了12 項(xiàng)細(xì)胞因子、T 淋巴細(xì)胞亞群和感染相關(guān)免疫細(xì)胞檢測(cè)，其中除已被廣泛研究的T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、IL2、IL-6 外，還包含CD64 感染指數(shù)、HLA-DR%等檢查，對(duì)幫助臨床早期判斷患者預(yù)后提供了新思路。本研究納入的患者均為奧密克戎變異株重癥感染者，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于奧密克戎變異株感染者免疫學(xué)特點(diǎn)的類似研究。