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        正中神經(jīng)電刺激對缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的影響

        2024-01-13 13:29:40張成才彭藝晨楊晰宸盧靜怡張彭躍
        關(guān)鍵詞:可塑性缺血性染色

        張成才 ,寧 蓉 ,陳 娜 ,彭藝晨 ,周 麗 ,楊晰宸 ,盧靜怡 ,張彭躍 ,李 蕊

        (1)云南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650500;2)昆明市第二人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,云南 昆明 650032)

        腦卒中是一種由于腦出血或腦梗塞導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損的急性腦血管病,其中缺血性腦卒中約占總腦卒中的四分之三以上[1]。缺血性腦卒中發(fā)生后會(huì)觸發(fā)一系列的神經(jīng)功能障礙,包括炎癥反應(yīng)、能量衰竭、興奮毒性以及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、自噬及壞死等[2],是導(dǎo)致殘疾和死亡的主要原因,給患者、家庭、社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此,找到促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)修復(fù)的方法至關(guān)重要。正中神經(jīng)電刺激(median nerve electrical stimulation,MNES)是一種具有廣泛應(yīng)用前景的神經(jīng)調(diào)制技術(shù)[3],正中神經(jīng)被認(rèn)為是聯(lián)系中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外周門戶,作用于正中神經(jīng)上的電刺激可沿著上行傳導(dǎo)通路誘發(fā)脊髓和大腦皮層的神經(jīng)可塑性,從而影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重塑和功能修復(fù)[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn),MNES 治療過程中腦雙側(cè)前額氧合血紅蛋白濃度升高,該部位神經(jīng)活動(dòng)發(fā)生變化,最終改善腦卒中后患者的認(rèn)知功能[5],但其作用機(jī)制仍尚不明確,且在治療劑量、頻率、療程的選擇上仍缺少臨床指南,尚無確切最佳的電刺激治療處方規(guī)范。因此,本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討正中神經(jīng)電刺激治療對腦卒中的作用機(jī)制,為臨床上正中神經(jīng)電刺激的優(yōu)化和推廣以及缺血性腦卒中的防治提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

        由湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2019-0004]提供的健康雄性SD 大鼠,體重(250±20)g,于云南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(滇)K2022-0004]適應(yīng)性喂養(yǎng),本研究通過昆明市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)2021(06)號(hào)批準(zhǔn),所有實(shí)驗(yàn)操作步驟都嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理和相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)要求規(guī)范執(zhí)行。將SD 大鼠隨機(jī)分成造模組和假手術(shù)組(Sham),在造模24 h 后對腦缺血大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分,剔除死亡及不合格者,然后將造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成中動(dòng)脈閉塞模型組(middle cerebral artery occlusion,MCAO)和正中神經(jīng)電刺激干預(yù)組(median nerve electrical stimulation,MNES),每組各6 只。

        1.2 主要試劑耗材

        異氟烷:瑞沃德生命科技有限公司(中國深圳);線栓:西濃科技有限公司(中國北京);抗體:艾博抗(Abcam)貿(mào)易有限公司(中國上海),BDNF:ab108319,TrkB:187041,synI:ab254349,PSD95:ab238315。

        1.3 主要儀器

        外周神經(jīng)電刺激儀(SY-708A,中國江蘇);氣體麻醉機(jī):眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司(中國北京);轉(zhuǎn)棒疲勞儀:移數(shù)信息科技有限公司(中國上海);高速冷凍離心機(jī):Hettich 公司(德國);電泳儀:BIO-RAD;全自動(dòng)研磨儀:賽維爾生物科技有限公司(中國武漢);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng):勤翔科學(xué)儀器有限公司(中國上海);冷凍切片機(jī):賽默飛世爾儀器有限公司(中國上海)。

        1.4 實(shí)驗(yàn)方法

        1.4.1 缺血性腦卒中大鼠模型的建立采用線栓法建立大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈腦梗塞模型,假手術(shù)組動(dòng)物除不插入和拔出線栓,其余各步驟均相同。缺血60 min 后取出線栓,縫合好傷口,置于30℃電熱毯上維持體溫,待大鼠蘇醒后,放回鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)。

        1.4.2 干預(yù)方法造模成功后第3 天對 MCAO 大鼠進(jìn)行損傷側(cè)前肢 MNES 干預(yù)。異氟烷氣體麻醉大鼠,使用外周神經(jīng)電刺激儀(SY-708A,中國,江蘇)在前肢距腕關(guān)節(jié)上5 mm 處兩肌腱之間,以45°傾斜角度插入一根毫針,插入深度為 1 mm,接入電極見圖1。刺激參數(shù)為:刺激參數(shù)為:0.6 mA,5 min;1 mA,10 min;1.5 mA,5 min;總刺激時(shí)間為 20 min,隔天干預(yù),連續(xù) 7 次。干預(yù)結(jié)束后消毒并放入飼養(yǎng)籠中。MCAO 組在相同位置插入刺激針,但不予與電流,其余操作同干預(yù)組。Sham 組不作任何處理。

        圖1 大鼠腦卒中后正中神經(jīng)電刺激示意圖Fig.1 Median nerve electrical stimulation after stroke in rats

        1.5 檢測指標(biāo)

        1.5.1 HE 染色干預(yù)結(jié)束后取干預(yù)側(cè)和假手術(shù)組右側(cè)正中神經(jīng),固定于4%多聚甲醛,OCT 包埋,冰凍切片(10 μm),用蘇木精-伊紅染色法進(jìn)行染色,置于顯微鏡下觀察病理變化。

        1.5.2 神經(jīng)功能缺損評分(neurological severity score,NSS)采用7 分制評分法測試動(dòng)物整體神經(jīng)功能缺失狀況,用于評估神經(jīng)功能恢復(fù)情況,見表1。

        表1 神經(jīng)功能缺損評分Tab.1 Neurological severity score

        1.5.3 踏錯(cuò)實(shí)驗(yàn)(Foot-fault test)采用踏錯(cuò)實(shí)驗(yàn)評估大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力,用錄像機(jī)記錄大鼠損傷側(cè)前肢抓住橫梯的狀態(tài),然后進(jìn)行評分,見表2。

        表2 踏錯(cuò)實(shí)驗(yàn)評分Tab.2 Foot-fault test scores

        1.5.4 轉(zhuǎn)棒測試(Rota-rod test)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)評估缺血性腦卒中大鼠患側(cè)運(yùn)動(dòng)功能以及運(yùn)動(dòng)耐力的恢復(fù)情況,將大鼠放置在運(yùn)轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)棒上,共測試3 輪,每2 輪之間間隔5 min,將轉(zhuǎn)棒設(shè)置為10 s后勻速增加至10 r/min,持續(xù)5 min;記錄跑動(dòng)時(shí)間,取3 輪的平均成績作為最終成績。

        1.5.5 尼式染色干預(yù)結(jié)束后將大鼠用 3%戊巴比妥鈉麻醉后,取出完整大腦,用4%多聚甲醛進(jìn)行固定后,蔗糖脫水,OCT 包埋,進(jìn)行冰凍切片(10 μm),根據(jù)硫堇染色法染色步驟進(jìn)行染色,光鏡下觀察缺血半影區(qū)神經(jīng)元的損傷修復(fù)情況。

        1.5.6 Western blot在干預(yù)結(jié)束后1 h,使用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,取出大腦,分離損傷側(cè)大腦皮層,立即于干冰中速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存至檢測。樣品收集完成后進(jìn)行總蛋白提取、定量,然后依次進(jìn)行80 V 電壓下 SDS-PAGE 凝膠電泳40 min 后換電壓為120 V 至溴酚藍(lán)即將跑出分離膠、電流300 mA 轉(zhuǎn)膜85 min、5%脫脂奶粉封閉2 h、一抗孵育(BDNF 1∶3 000、TrkB 1∶1 000、synI 1∶3 000、PSD95 1∶3 000)4℃冰箱過夜、二抗孵育(goat anti-rabbit IgG 1∶5 000)1 h 后進(jìn)行顯影和結(jié)果分析。

        1.5.7 透射電鏡大鼠深度麻醉后處死,取右側(cè)半球額頂區(qū)皮質(zhì)(缺血周邊區(qū)),大小約1 mm×1 mm×2 mm,經(jīng)2.5%戊二醛、1%鋨酸固定,用酒精和丙酮脫水,用環(huán)氧樹脂包埋后,進(jìn)行半薄切片定位,超薄切片(60 nm),以醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色后,置透射電鏡下觀察目標(biāo)區(qū)域軸突結(jié)構(gòu)、突觸連接狀況及突觸數(shù)量變化。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用GraphPad Prism 9 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”(Mean±SEM)表示,2 組間比較使用單因素方差分析(oneway ANOVA)后進(jìn)行事后多重比較(Followup tests),P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 正中神經(jīng)電刺激對腦卒中大鼠的正中神經(jīng)未造成損傷

        干預(yù)結(jié)束后,取干預(yù)組右側(cè)和假手術(shù)組右側(cè)正中神經(jīng)進(jìn)行HE 染色,見圖2。與假手術(shù)相比,正中神經(jīng)電刺激干預(yù)后,對正中神經(jīng)并未造成損傷,其神經(jīng)被膜結(jié)構(gòu)完整,無明顯炎性細(xì)胞浸潤。

        圖2 正中神經(jīng)電刺激對腦卒中大鼠的正中神經(jīng)未造成損傷Fig.2 Median nerve electrical stimulation did not cause damage to the median nerve in rats after stroke

        2.2 正中神經(jīng)電刺激改善缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)功能和患側(cè)前肢的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力

        干預(yù)結(jié)束后通過神經(jīng)功能缺損評分、Footfault test、Rota-rod test 對大鼠的神經(jīng)功能、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力及運(yùn)動(dòng)耐力進(jìn)行評估,見圖3。與Sham組相比,MCAO 組表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損(P<0.001);與MCAO 組相比,MNES 組的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)明顯改善(P< 0.05)。與Sham 組相比,MCAO 組大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能明顯下降(P< 0.05);與MCAO 組相比,MNES 組大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力明顯改善(P< 0.05)。Rota-rod test 的結(jié)果表明:與Sham 組MCAO 組大鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯減短(P<0.05);與MCAO 組相比,MNES 組大鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯增加(P< 0.05)。

        圖3 正中神經(jīng)電刺激改善缺血性腦卒中大鼠受損的神經(jīng)功能和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力Fig.3 Median nerve electrical stimulation improves nerve function and motor coordination in ischemic stroke rats

        2.3 正中神經(jīng)電刺激減輕缺血性腦卒中大鼠腦梗死體積

        干預(yù)結(jié)束后,取各組腦組織進(jìn)行冰凍切片尼式染色以評估腦缺血損傷情況,染色結(jié)果和梗死體積統(tǒng)計(jì)結(jié)果,見圖4。與Sham 組相比,MCAO組大鼠腦梗死明顯(P< 0.001),且尼式小體核固縮現(xiàn)象增多,染色較深;與MCAO 組相比,MNES組大鼠的梗死體積明顯減?。≒< 0.05),尼式小體核固縮現(xiàn)象減少,染色變淺。

        圖4 正中神經(jīng)電刺激減輕缺血性腦卒中大鼠的腦梗死體積Fig.4 Median nerve electrical stimulation reduced volume of cerebral infarction in ischemic stroke rats

        2.4 正中神經(jīng)電刺激上調(diào)缺血性腦卒中大鼠大腦皮層中與神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

        Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測損傷側(cè)大腦皮層中與神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白:腦源性神經(jīng)營養(yǎng)營養(yǎng)因子(BDNF)、絡(luò)氨酸激酶受體(TrkB)、突觸素相關(guān)蛋白I(synI)、突觸后致密蛋白(PSD95)的表達(dá)水平。與MCAO 組相比,MNES 組大鼠大腦皮層中BDNF、TrkB、synI、PSD95 的表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05),見圖5。

        圖5 正中神經(jīng)電刺激上調(diào)缺血性腦卒中大鼠大腦皮層中與神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig.5 Median nerve electrical stimulation up-regulated the expression level of neuroplasticity-related proteins in cerebral cortex of ischemic stroke rats

        2.5 正中神經(jīng)電刺激對缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的影響

        通過電鏡觀察損傷側(cè)大腦皮層突觸結(jié)構(gòu)的變化。與Sham 組相比,MCAO 組突觸數(shù)量變少(P<0.05),密度變低,與MCAO 組相比,MNES 組突觸數(shù)量增多(P< 0.01),密度增高,見圖6。

        圖6 正中神經(jīng)電刺激對缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的影響Fig.6 Effect of median nerve electrical stimulation on synaptic plasticity in ischemic stroke rats

        3 討論

        腦卒中是由于腦血管發(fā)生急性血流中斷或血管性病變引起的,盡管在腦卒中發(fā)作后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)通過靜脈溶栓或機(jī)械取栓可及時(shí)恢復(fù)血流,但許多患者因錯(cuò)過治療時(shí)間窗而導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[6]。由于神經(jīng)系統(tǒng)具有可塑性,大腦有能力在殘留的神經(jīng)元之間重組新的連接,以補(bǔ)償或修復(fù)受損的神經(jīng)元[7]。研究發(fā)現(xiàn),在腦卒中后3 個(gè)月內(nèi)對患者及時(shí)進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練可顯著增強(qiáng)神經(jīng)系統(tǒng)可塑性并促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)[8]。本研究在大鼠腦缺血再灌注損傷后第3 天開始進(jìn)行正中神經(jīng)電刺激治療,治療后腦卒中大鼠受損的神經(jīng)功能及運(yùn)動(dòng)功能顯著改善,由此可見,在早期制定有效的康復(fù)方案以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)可塑性對腦卒中患者的功能修復(fù)具有重要意義。同時(shí),筆者發(fā)現(xiàn)在治療7 次后即大鼠腦缺血損傷后第17 天,MCAO 組損傷側(cè)皮層中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)量與Sham 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05),這也提示,在缺血損傷后,神經(jīng)系統(tǒng)具有自我修復(fù)能力。

        突觸是神經(jīng)細(xì)胞間進(jìn)行電信號(hào)和化學(xué)信號(hào)傳遞的關(guān)鍵部位,是學(xué)習(xí)、記憶等高級神經(jīng)功能的生物學(xué)基礎(chǔ)。當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后,突觸會(huì)在結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生變化,從而維持神經(jīng)功能的相對穩(wěn)定,這些變化也被稱為突觸可塑性[9]。研究發(fā)現(xiàn),百會(huì)穴和神庭穴電針可通過調(diào)節(jié)海馬CA1區(qū)突觸-樹突可塑性,來改善缺血性腦卒中大鼠的認(rèn)知障礙,并控制樹突棘的數(shù)量、大小和形狀[10]。突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)異常與腦卒中后神經(jīng)功能的修復(fù)密切相關(guān),在分子水平研究突觸可塑性的改變,對深入了解腦卒中的發(fā)病機(jī)制以及探尋有效治療腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)具有重要意義。在興奮性突觸的成熟和突觸接觸的穩(wěn)定過程中,突觸素相關(guān)蛋白I(SynI)和突觸后致密蛋白(PSD95)發(fā)揮了關(guān)鍵作用,它們被認(rèn)為是突觸可塑性的重要指標(biāo)[11]。在本研究中,SynI 和PSD95的表達(dá)在給予腦卒中大鼠正中神經(jīng)電刺激治療后顯著上調(diào),同時(shí)半影區(qū)的突觸數(shù)量增多,提示缺血性腦卒中后正中神經(jīng)電刺激促進(jìn)了部分神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重新連接。

        正中神經(jīng)電刺激是一種在周圍神經(jīng)系統(tǒng)施加電流的物理因子治療技術(shù),具安全性高、簡便易操作、經(jīng)濟(jì)易推廣等的優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于臨床上顱腦外傷昏迷促醒、腦卒中認(rèn)知功能改善、帕金森病治療等[12]。眾所周知,手部特別是大拇指在大腦皮層運(yùn)動(dòng)代表區(qū)的面積遠(yuǎn)大于軀體其他部位,而支配大拇指的神經(jīng)就是正中神經(jīng),正中神經(jīng)也被認(rèn)為是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的外周門戶[13],因此對正中神經(jīng)進(jìn)行電刺激,可以在大腦皮層引發(fā)廣泛的神經(jīng)反應(yīng),進(jìn)一步產(chǎn)生明顯的治療效果。正中神經(jīng)電刺激在治療腦卒中上展現(xiàn)出巨大潛力,臨床研究發(fā)現(xiàn),對腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者進(jìn)行正中神經(jīng)電刺激治療后,患者的神經(jīng)功能和認(rèn)知功能顯著改善,患者的生活質(zhì)量顯著提高[14]。另有學(xué)者將正中神經(jīng)電刺激與中醫(yī)理論結(jié)合起來,從解剖位置上看,內(nèi)關(guān)穴在正中神經(jīng)的走形上,Lee 等[15]將內(nèi)關(guān)穴作為插入針灸針進(jìn)行正中神經(jīng)電刺激標(biāo)準(zhǔn)位置,建立了內(nèi)關(guān)穴正中神經(jīng)電刺激的動(dòng)物模型,并發(fā)現(xiàn)其治療神經(jīng)性疼痛方面的效果強(qiáng)于單獨(dú)內(nèi)關(guān)穴刺激組和通過內(nèi)關(guān)穴并未刺激正中神經(jīng)組。本課題組前期臨床研究也發(fā)現(xiàn),在B 超引導(dǎo)下直接對正中神經(jīng)進(jìn)行電刺激是安全有效的,可促進(jìn)腦卒中患者上肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),同時(shí)檢測到患者血清中的 BDNF 表達(dá)上調(diào)[16],但其作用機(jī)制仍不清楚,且在治療劑量、頻率、療程的選擇上仍有待探索。

        綜上所述,本研究通過大腦中動(dòng)脈閉塞動(dòng)物模型證明了正中神經(jīng)電刺激是改善腦卒中后受損神經(jīng)功能安全有效的治療措施,其作用機(jī)制與促進(jìn)突觸可塑性有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)主要從動(dòng)物行為學(xué)檢測及腦組織形態(tài)學(xué)檢測進(jìn)行驗(yàn)證,后續(xù)仍需深入探究正中神經(jīng)電刺激促進(jìn)缺血性腦卒中大鼠突觸可塑性的相關(guān)分子機(jī)制,以期為臨床上正中神經(jīng)電刺激改善腦卒中患者功能障礙及正中神經(jīng)電刺激的應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

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