林升祿,余慧玲,陳秋林,吳雪梅

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)主要表現(xiàn)為B系或T系淋巴細(xì)胞因增殖、分化、凋亡過程失調(diào)在骨髓等造血組織中惡性克隆增殖,抑制了正常造血功能,并可累積、浸潤其他非造血組織[1]。該病治療常用大劑量甲氨蝶呤(HD-MTX)配合亞葉酸鈣解救療法。MTX主要作用于細(xì)胞分裂S期,通過抑制二氫葉酸還原酶,阻止其轉(zhuǎn)化為四氫葉酸,抑制嘌呤和嘧啶的合成進(jìn)而干擾DNA合成從而減弱惡性細(xì)胞增殖,而HD-MTX指MTX給藥劑量>500 mg/m2,相較于常規(guī)劑量,其可滲透血腦、血睪及血眼屏障,極大降低腫瘤髓外復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),提高患者長期生存率;但其對(duì)細(xì)胞的抑制作用也是產(chǎn)生不良反應(yīng)的主要原因,其不良反應(yīng)包括骨髓抑制、肝腎損傷及消化系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)毒性等[2]。

人類谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一組主要參與體內(nèi)外毒素代謝或促排毒素的超基因蛋白酶家族,廣泛參與機(jī)體自我保護(hù)機(jī)制,對(duì)藥物不良反應(yīng)有較強(qiáng)的拮抗作用。GSTT1、GSTM1是GSTs家族的重要類型,已有研究表明GSTM1、GSTT1基因多態(tài)性與多種疾病的發(fā)生、藥物所致肝損傷有關(guān)[3-4]。本研究觀察GSTT1、GSTM1基因多態(tài)性與ALL易感性及HD-MTX血藥濃度、所致急性肝損傷的相關(guān)性,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選取2016年6月—2021年2月福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科收治的ALL患者92例為病例組,另選取體檢中心的健康體檢者185例為對(duì)照組。病例組男64例,女28例;年齡(12.9±11.9)歲;B淋巴細(xì)胞型71例,T淋巴細(xì)胞型21例,經(jīng)HD-MTX治療后發(fā)生急性肝損傷53例。對(duì)照組男71例,女114例;年齡(13.6±16.7)歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 病例組選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):均經(jīng)骨髓病理活檢及免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)確診為急性淋巴細(xì)胞白血病患者;化療前肝、腎功能均正常;排除標(biāo)準(zhǔn):腎功能異常,甚至死亡者。

1.3 治療方法 根據(jù)不同淋巴瘤分類及臨床危險(xiǎn)程度評(píng)分給予HD-MTX[澳大利亞Pfizer(Perth)Pty Limited生產(chǎn)]治療,劑量為2～5 g/m2,前30 min快速靜脈滴注總劑量的10～15%,余量23.5 h內(nèi)勻速滴注完畢。治療期間予5%碳酸氫鈉注射液充分堿化處理,予5%葡萄糖注射液或0.9%氯化鈉注射液充分水化處理。滴注結(jié)束12 h后采用注射用亞葉酸鈣進(jìn)行常規(guī)解救,常規(guī)監(jiān)測用藥第44小時(shí)的血藥濃度,根據(jù)MTX血藥濃度監(jiān)測結(jié)果調(diào)整亞葉酸鈣的解救次數(shù)與劑量。

1.4 DNA提取 采用EDTA抗凝管收集外周血2 ml,嚴(yán)格按EasyPrue血液基因組提取套件說明書用法執(zhí)行。

1.5 GSTT1、M1基因型測定 采用課題組前期研究結(jié)果[5],即課題組改良的多重PCR法測定。GSTT1上下游引物序列分別為5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′、5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′,GSTM1上下游引物序列分別為5′-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAGC-3′、5′-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTGG-3′,均采用β珠蛋白基因擴(kuò)增結(jié)果作為陽性對(duì)照,上下游引物序列分別為5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′、5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′;PCR反應(yīng)體系(20 μl):DNA模版2 μl,T1或M1上下游引物各0.5 μl(10 μmol/L),β珠蛋白基因上下游引物各0.5 μl(10 μmol/L),EasyTap DNA PCR擴(kuò)增混合液10 μl,d2H2O 6 μl。

1.6 不良反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)《急性藥物性肝損傷診治建議(草案)》[6],ALT或DBil值達(dá)正常值上限2倍以上或AST、ALP、DBil同時(shí)上升且至少1項(xiàng)達(dá)正常值上限2倍以上,判斷為肝損傷。

2 結(jié) 果

2.1 GSTT1、GSTM1基因分布情況及單基因多態(tài)性與ALL易感性分析 GSTM1基因多態(tài)性與ALL易感性相關(guān)(P=0.001),GSTM1(-)ALL患病風(fēng)險(xiǎn)較高,OR=2.451,95%CI(1.462～4.116);GSTT1基因型與ALL易感性無顯著相關(guān)性(P>0.05),見表1。

表1 GSTT1、GSTM1基因分布情況及單基因多態(tài)性與ALL的易感性分析 [例(%)]

2.2 GSTT1、M1聯(lián)合基因多態(tài)性與ALL的易感性分析 GSTT1、M1雙缺失型患病風(fēng)險(xiǎn)較高(P=0.038),OR=2.181,95%CI(1.037～4.587),見表2。

表2 GSTT1、M1聯(lián)合基因多態(tài)性與ALL的易感性分析 [例(%)]

2.3 GSTT1、GSTM1基因多態(tài)性與MTX血藥濃度的相關(guān)性 不同基因型C44 h/D組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 GSTT1、GSTM1基因多態(tài)性與C44 h/D的相關(guān)性

2.4 GSTT1、GSTM1基因多態(tài)性與HD-MTX所致肝損傷的相關(guān)性 GSTM1基因多態(tài)性與HD-MTX所致肝損傷顯著相關(guān)(P=0.004),GSTM1(-)肝損傷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高,OR=3.596,95%CI(1.464～8.836);未發(fā)現(xiàn)GSTT1基因多態(tài)性與肝損傷不良反應(yīng)的相關(guān)性,見表4。

表4 GSTT1、GSTM1基因多態(tài)性與HD-MTX所致肝損傷的相關(guān)性 [例(%)]

3 討 論

GSTs是重要的Ⅱ相代謝酶,其功能主要是催化親電性的內(nèi)、外源性毒物與GSH結(jié)合,增加疏水性以促其排出胞外、體外,起到解毒作用;部分GSTs具有過氧化物酶和異構(gòu)酶活性,可發(fā)揮抗氧化損傷作用[6]。根據(jù)GSTs亞基結(jié)構(gòu)、底物特異性及免疫原性等特征,人GSTs可分α、θ、μ、π、ω、σ、ζ、κ八大類,廣泛分布于肝、腎、肺、血液、皮膚等組織器官的胞質(zhì)中[7-8]。GSTM1、GSTT1分別是θ、μ類的GSTs,是GST蛋白家族重要成員,二者的基因多態(tài)性均表現(xiàn)為相應(yīng)功能基因片段的缺失,從而導(dǎo)致相應(yīng)GST蛋白缺失,失去對(duì)相應(yīng)毒物的解毒作用,也更易導(dǎo)致毒物蓄積產(chǎn)生長期危害。

ALL是一種常見血液循環(huán)系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,可能與環(huán)境因素、遺傳因素等相關(guān);ALL占急性白血病的30%～40%,兒童最為常見,占兒童白血病75%;但兒童ALL治愈率較高(可達(dá)90%),而成年人治療效果明顯低于兒童[8]。因此對(duì)發(fā)生ALL的高危因素進(jìn)行篩查研究,進(jìn)而對(duì)ALL實(shí)現(xiàn)早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療意義重大。GSTT1、M1基因多態(tài)性對(duì)ALL易感性研究傾向于GSTM1(-)增加ALL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),而GSTT1對(duì)ALL易感性的相關(guān)性存在較大爭議,僅在部分亞洲人群研究中發(fā)現(xiàn)GSTT1(-)增加ALL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[9]。這可能與地域環(huán)境及種族遺傳特征差異有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)GSTM1(-)顯著增加ALL患病風(fēng)險(xiǎn)(P=0.001,OR=2.451),GSTT1與ALL易感性不相關(guān),與李娟等[10]的研究結(jié)果基本一致,因本研究人群主要來源福建地區(qū)漢族人群,具有較好地域代表性。目前,基于中國人群相關(guān)研究相對(duì)較少,且受地域、樣本量限制,有必要進(jìn)一步增加樣本量擴(kuò)大人群研究以明確。

急性肝損傷是HD-MTX治療過程中最為常見的藥物不良反應(yīng),發(fā)生率高達(dá)60%[2]。藥物肝損傷發(fā)生因素眾多,包括肝內(nèi)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相代謝酶的種類及活性水平、肝細(xì)胞氧化損傷情況、藥物及其代謝物引發(fā)的機(jī)體免疫應(yīng)激水平(如各信號(hào)通路的交互作用等),以及在此基礎(chǔ)上融合藥物劑量和個(gè)體特異性的影響,復(fù)雜性較高[11]。本研究發(fā)現(xiàn)GSTM1(-)增加急性肝損傷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(P=0.004,OR=3.596),與多數(shù)研究結(jié)果一致;未發(fā)現(xiàn)GSTT1基因多態(tài)性與肝損傷不良反應(yīng)的相關(guān)性;同時(shí)也未發(fā)現(xiàn)GSTT1、M1基因多態(tài)性與血藥濃度C44 h的相關(guān)性,與劉俊閃[12]的研究結(jié)論不一致,可能與MTX主要經(jīng)腎排泄及MTX代謝機(jī)制(GSTs并非MTX代謝的主要參與者)有關(guān),也可能C44 h為消除相取值,且受亞葉酸鈣解救、水化、堿化處理的個(gè)體差異影響較大,有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述,GSTM1(-)顯著增加ALL及HD-MTX治療所致肝損傷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),提示GSTM1酶蛋白在血液疾病發(fā)生和機(jī)體抵抗藥物與環(huán)境毒物損傷方面的重要作用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。