趙若含 趙凈穎 柏毅承 張瑞芳 賈俊靜 豆騰飛

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

真核生物的核DNA 并不是裸露的，而是與組蛋白結(jié)合形成核小體，核小體再經(jīng)逐步的壓縮折疊最終形成染色體高級(jí)結(jié)構(gòu)［1］。DNA 的復(fù)制轉(zhuǎn)錄需要將DNA 緊密結(jié)構(gòu)打開(kāi)，再與轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控因子結(jié)合，打開(kāi)的染色質(zhì)就叫開(kāi)放染色質(zhì)。開(kāi)放染色質(zhì)允許其他調(diào)控因子結(jié)合的特性稱(chēng)為染色質(zhì)的可及性［2-3］。2013 年，Buenrostro 等［4］提出一種用于研究染色質(zhì)可及性的方法，該方法利用高度活躍的Tn5 轉(zhuǎn)座酶與開(kāi)放染色質(zhì)結(jié)合，對(duì)目標(biāo)DNA 進(jìn)行片段化處理和末端修復(fù)，并添加測(cè)序接頭。隨后對(duì)DNA 進(jìn)行測(cè)序，這種方法被稱(chēng)為染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測(cè)序（assay for transposase?accessible chromatin with high?throughput sequencing, ATAC?seq）［5］。但是，ATAC?seq 無(wú)法區(qū)分樣品中亞群的染色質(zhì)可及性或亞群之間染色質(zhì)可及性的差異。在此基礎(chǔ)上，2015 年Cusanovich 等［6］發(fā)表了關(guān)于單細(xì)胞的染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性的高通量測(cè)序（scATAC?seq），該技術(shù)使用Tn5 轉(zhuǎn)座酶檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中的全部開(kāi)放區(qū)域，將開(kāi)放的DNA 序列切割下來(lái)，再捕獲DNA 序列進(jìn)行測(cè)序，在單細(xì)胞層面提供全面的染色質(zhì)調(diào)控圖譜。

scATAC?seq 能在基因組水平上協(xié)助了解細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程，揭示不同基因組調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，從表觀遺傳學(xué)的角度來(lái)解析基因信息［7］。其中包括開(kāi)放染色質(zhì)基因附近的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及離啟動(dòng)子較遠(yuǎn)的調(diào)控元件如沉默子和絕緣子相關(guān)的開(kāi)放區(qū)域。這些開(kāi)放的染色質(zhì)元件在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演著至關(guān)重要的角色［8］。尤其真核生物中的細(xì)胞類(lèi)型特異性基因表達(dá)受數(shù)百萬(wàn)個(gè)順式作用元件和數(shù)千個(gè)反式作用因子（如轉(zhuǎn)錄因子）的調(diào)節(jié)［9］。scATAC?seq 技術(shù)可以解釋順式作用元件和反式作用因子之間的網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)還可了解到基因活性和對(duì)遺傳變異的可及性。因此，通過(guò)研究單細(xì)胞染色質(zhì)可及性信息的技術(shù)，了解其原理和應(yīng)用，明確這些技術(shù)在識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、鑒定基因組調(diào)控元件以及研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制等方面的重要意義。本文綜述了scATAC?seq 技術(shù)的發(fā)展歷程、7 種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)、數(shù)據(jù)分析和應(yīng)用，以期為表觀遺傳學(xué)研究提供參考。

1 scATAC-seq 技術(shù)的發(fā)展歷程

scATAC?seq 技術(shù)是基于單細(xì)胞和ATAC?seq 技術(shù)發(fā)展起來(lái)的，可在單細(xì)胞水平上高通量、高分辨率地檢測(cè)異質(zhì)性細(xì)胞群的染色質(zhì)可及性。該技術(shù)通過(guò)在Tn5 轉(zhuǎn)座酶結(jié)合的接頭序列中添加可區(qū)分細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞身份標(biāo)記序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)捕獲DNA 片段的細(xì)胞來(lái)源的標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)高通量的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性測(cè)序。scATAC?seq 技術(shù)為研究單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了新的見(jiàn)解［10］。其中包括多種技術(shù)，如組合細(xì)胞索引（sci?ATAC）、微流控技術(shù)（Fluidigm C1）、超敏位點(diǎn)測(cè)序（scTHS）、物理方法（uATAC）、平板技術(shù)（Plate）、液滴-微流控技術(shù)（dsci?ATAC）和10X 技術(shù)［11］。7 種技術(shù)的具體信息見(jiàn)表1。10X Genomics 技術(shù)與其他技術(shù)相比表現(xiàn)出更為簡(jiǎn)便和高效的優(yōu)勢(shì)，迅速被廣泛采用并成為scATAC?seq 領(lǐng)域的前沿技術(shù)。以下將對(duì)scATAC?seq技術(shù)的發(fā)展歷程、作用機(jī)理以及研究進(jìn)展進(jìn)行描述。

表1 七種scATAC-seq 技術(shù)介紹Table 1 Introduction to seven scATAC-seq technologies

1.1 sci?ATAC及其衍生技術(shù)

2015 年，Cusanovich 等［6］提出了單細(xì)胞組合索引分析染色質(zhì)可及性（single cell combinatorial indexing assay for transposase accessible chromatin, sci?ATAC?seq）方法，該方法利用組合索引將細(xì)胞核進(jìn)行分子條形碼標(biāo)記，無(wú)需特殊處理。該技術(shù)的流程包括裂解細(xì)胞并將細(xì)胞核分配到96 孔板中，添加經(jīng)過(guò)定制的、唯一索引的Tn5 轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行標(biāo)記，將細(xì)胞核稀釋并重新分配到第二個(gè)96 孔板中，引入第二個(gè)條形碼，最后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）和測(cè)序（圖1?A）。該方法簡(jiǎn)單易行，適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，但測(cè)序覆蓋范圍相對(duì)較低，數(shù)據(jù)質(zhì)量有待提高。

2018 年，Cusanovich 等［12］在前期方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，大幅增加了每個(gè)細(xì)胞獲得的數(shù)據(jù)量。他們利用這一方法繪制了果蠅胚胎發(fā)育過(guò)程中染色質(zhì)調(diào)控狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，并鑒定了超過(guò)3 萬(wàn)個(gè)具有組織特異性的遠(yuǎn)端調(diào)控元件。此外，他們使用相同的方法從13 只成年小鼠的17 個(gè)樣本中收集了10 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行scATAC?seq，獲得了40 萬(wàn)個(gè)染色質(zhì)可及性元件的信息，并成功區(qū)分了85 個(gè)細(xì)胞亞群，準(zhǔn)確識(shí)別了多種組織的大部分細(xì)胞類(lèi)型。這項(xiàng)研究為相關(guān)組織的研究提供了重要的參考和借鑒［18］。

1.2 Fluidigm C1

2015 年，Buenrostro 等［13］提出了一種利用物理方法進(jìn)行細(xì)胞分離和scATAC?seq 的技術(shù)。該技術(shù)基于納米級(jí)反應(yīng)槽，在可編程微流體系統(tǒng)（C1 single?cell auto prep system, Fluidigm C1）中捕獲和評(píng)估單個(gè)細(xì)胞的活力，然后在集成的微流控芯片（integrated fluidics circuit, IFC）上進(jìn)行細(xì)胞裂解和轉(zhuǎn)座，進(jìn)而獲得細(xì)胞核中的DNA 片段。接下來(lái)，通過(guò)PCR 擴(kuò)增、文庫(kù)收集和細(xì)胞識(shí)別條形碼引物的PCR 擴(kuò)增，將單個(gè)細(xì)胞文庫(kù)匯集，并在高通量測(cè)序儀器上進(jìn)行測(cè)序［19］（圖1?B）。盡管該方法依賴儀器，但其數(shù)據(jù)質(zhì)量相對(duì)于sci?ATAC 而言更好。然而，操作復(fù)雜，需要顯微鏡核實(shí)每個(gè)反應(yīng)槽的細(xì)胞數(shù)，且整體獲得的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少。

1.3 scTHS?seq

2017 年，Lake 等［14］開(kāi)發(fā)了一種名為單細(xì)胞轉(zhuǎn)座子超敏感位點(diǎn)測(cè)序（single?cell transposome hyper?sensitive?site sequencing, scTHS?seq）的方法。該方法結(jié)合了轉(zhuǎn)座子超敏位點(diǎn)測(cè)序（ransposome hypersensi?tive sites sequencing, THS?seq）［20］的分析技術(shù)和使用定制條形碼轉(zhuǎn)座體的組合細(xì)胞索引。scTHS?seq 利用改進(jìn)后的超級(jí)突變型Tn5 轉(zhuǎn)座酶（Tn5059），具有體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的線性優(yōu)勢(shì)，并比ATAC?seq 具有更高的靈敏度和細(xì)胞特異性的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子覆蓋度。該方法的步驟包括獲取細(xì)胞核并進(jìn)行計(jì)數(shù)，在384 孔板上合成帶有獨(dú)特條形碼的轉(zhuǎn)座體復(fù)合物，與細(xì)胞樣本反應(yīng)并進(jìn)行收集，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到96 孔板上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，最后進(jìn)行測(cè)序（圖1?C）。scTHS?seq 的優(yōu)勢(shì)在于克服了樣本限制，可處理新鮮或凍存的組織樣本，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模單細(xì)胞檢測(cè)，并且不受組織細(xì)胞解離的影響。

1.4 μATAC?seq

2018 年，Mezger 等［15］開(kāi)發(fā)了一種名為μATAC?seq 的技術(shù)，通過(guò)納米級(jí)液體沉積系統(tǒng)（ICELL8 單細(xì)胞系統(tǒng)）對(duì)整個(gè)細(xì)胞中的染色質(zhì)可及性進(jìn)行測(cè)序。該技術(shù)利用物理方法在小體積下實(shí)現(xiàn)了scATAC?seq。該方法通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色并將其加入具有可控溫度和濕度的5 184 個(gè)納米孔中，平均每個(gè)孔中包含一個(gè)細(xì)胞。隨后，利用熒光顯微鏡成像識(shí)別含有活細(xì)胞的孔。然后，在孔中加入帶有條形碼的轉(zhuǎn)座試劑，并與EDTA 一起進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)，隨后加入MgCl2，為后續(xù)的PCR 擴(kuò)增做準(zhǔn)備。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和構(gòu)建文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序（圖1?D）。該技術(shù)將熒光成像和定向試劑沉積應(yīng)用于大規(guī)模平行納米孔陣列中。與Fluidigm C1 技術(shù)相比，μATAC?seq 技術(shù)的測(cè)序量提高了近20 倍，并且降低了每個(gè)細(xì)胞分析的成本［13］。

1.5 Plate

2018 年，Chen 等［16］開(kāi)發(fā)了一種基于96 孔或384 孔板的scATAC?seq 方法，通過(guò)在整個(gè)細(xì)胞群中預(yù)先進(jìn)行Tn5 標(biāo)記，提供了一種簡(jiǎn)單快速的實(shí)驗(yàn)流程。該方法的步驟包括制備5 000-50 000 個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Tn5 標(biāo)記反應(yīng)。接著將單個(gè)細(xì)胞核分選到含有裂解緩沖液（十二烷基硫酸鈉和蛋白酶K）的板中，等待Tn5 片段釋放。隨后添加吐溫20 以滅活裂解緩沖液中的十二烷基硫酸鈉，然后使用PCR 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和擴(kuò)增。最后進(jìn)行匯集、純化和測(cè)序（圖1?E）。該方法無(wú)需純化和板轉(zhuǎn)移，具有快速和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)。相較于Fluidigm C1和μATAC?seq，無(wú)需昂貴的設(shè)備。與sci?ATAC 和scTHS?seq 方法相比，該方法不需要定制修改的Tn5轉(zhuǎn)座酶，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

1.6 dsci?ATAC

2019 年，Lareau 等［17］提出了一種名為基于液滴-微流控技術(shù)為基礎(chǔ)的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性分析（droplet?based combinatorial indexing for massive?scale single?cell chromatin accessibility, dsci?ATAC）的方法，結(jié)合了液滴-微流控技術(shù)和ATAC?seq 來(lái)進(jìn)行單細(xì)胞染色質(zhì)開(kāi)放性分析。該方法利用Tn5 轉(zhuǎn)座酶對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)座，并將測(cè)序接頭整合到開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域中。通過(guò)微流體轉(zhuǎn)置處理，將轉(zhuǎn)座的染色質(zhì)、PCR 試劑和條形碼封裝成單個(gè)液滴。細(xì)胞識(shí)別的DNA 條形碼添加到轉(zhuǎn)座的染色質(zhì)中進(jìn)行擴(kuò)增，最后進(jìn)行測(cè)序（圖1?F）。該技術(shù)成功解決了快速分離細(xì)胞的難題，顯著提高了單細(xì)胞分析的速度。通過(guò)創(chuàng)新的實(shí)驗(yàn)和算法，dsci?ATAC 能夠獲得高達(dá)95%的細(xì)胞數(shù)據(jù)。

1.7 10X Genomics

2018 年，10X Genomics 推出了scATAC?seq 技術(shù)方法，成為目前最常用的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性測(cè)序技術(shù)［9］。類(lèi)似于10X Genomics 的scRNA?seq 技術(shù)。該實(shí)驗(yàn)流程包括以下步驟：首先制備目標(biāo)組織樣本的細(xì)胞核懸液，然后使用帶有標(biāo)簽的Tn5 轉(zhuǎn)座酶切割開(kāi)放染色質(zhì)。接下來(lái)，利用10X Genomics 的儀器將帶有10X 條形碼的凝膠微珠用于捕獲和標(biāo)記每個(gè)細(xì)胞核。在每個(gè)液滴中，轉(zhuǎn)座后的DNA 片段帶有10X 條形碼的標(biāo)記，而每個(gè)條形碼序列代表一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞。最后，完成文庫(kù)構(gòu)建，并使用Illumina高通量測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，以獲取測(cè)序數(shù)據(jù)（圖2）。該方法能夠在短時(shí)間內(nèi)利用微量樣本獲得大量有效信息，具有高靈敏度和較好的試驗(yàn)重復(fù)性。

圖2 scATAC-seq 的技術(shù)流程Fig. 2 Technical flow of scATAC-seq（10X）

2 scATAC-seq 的數(shù)據(jù)分析

scATAC?seq 數(shù)據(jù)分析通常包括以下步驟：首先進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、去除低質(zhì)量讀長(zhǎng)（reads）和PCR 擴(kuò)增偏差等。常用的軟件工具包括Trimmomatic 和FastQC［21］。接下來(lái)，使用比對(duì)軟件如Bowtie2 和BWA 將scATAC?seq 的reads 比對(duì)到參考基因組上［22］。比對(duì)完成后，根據(jù)reads 的位置和大小信息生成信號(hào)矩陣（count matrix），用于后續(xù)的分析。常用的工具包括MACS2 和SAMtools［23］。然后，利用聚類(lèi)和降維方法，如PCA、t?SNE 和UMAP，對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)和降維，以識(shí)別不同類(lèi)型的細(xì)胞和細(xì)胞狀態(tài)［24］。接著，通過(guò)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞簇中某一基因區(qū)域的信號(hào)值（如peaks）出現(xiàn)的頻率，進(jìn)行基因共現(xiàn)分析，以確定不同細(xì)胞類(lèi)型的共同表達(dá)基因。常用的軟件包括Cicero［25］和ChromVAR［26］。此外，還可以進(jìn)行基于已知基因集（如Gene Ontology、KEGG 和Reactome）的基因功能富集分析，以了解不同細(xì)胞類(lèi)型和狀態(tài)的基因可能涉及的功能和通路。最后，使用Seurat、Loupe Cell Browser 和scater 等不同的軟件包對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的具體分析方法和工具可能因研究目的和數(shù)據(jù)特點(diǎn)而有所不同，因此在實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)需求進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整和擴(kuò)展［18］。

3 scATAC-seq 的應(yīng)用

3.1 染色體開(kāi)放性圖譜繪制

細(xì)胞的異質(zhì)性是廣泛存在的生物學(xué)現(xiàn)象，不同類(lèi)型的細(xì)胞有序地組合在一起形成特定功能的組織和器官［13］。scATAC?seq 技術(shù)通過(guò)比較不同細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞亞型在染色體可及性上的差異，從細(xì)胞層面揭示更多的表觀遺傳調(diào)控信息［27］。在人類(lèi)基因組染色質(zhì)可及性圖譜中的繪制，對(duì)成人的30 個(gè)不同解剖部位鑒定出了30 個(gè)細(xì)胞大簇和111 個(gè)細(xì)胞亞簇，并表現(xiàn)出高度組織特異性，并與scRNA?seq 鑒定的細(xì)胞類(lèi)型高度一致［7］。對(duì)于大腦研究而言，scATAC?seq 的優(yōu)勢(shì)在于其能夠在高度異質(zhì)的組織中揭示細(xì)胞的染色體可及性，幫助研究不同細(xì)胞類(lèi)型和狀態(tài)下的基因調(diào)控［28］。在對(duì)人類(lèi)前額葉皮層進(jìn)行的研究中，使用兩種單細(xì)胞測(cè)序方法，即單細(xì)胞核ATAC?seq（snATAC?seq）和單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（snRNA?seq），都成功鑒定出了6 種細(xì)胞類(lèi)型，并在整合的UMAP 圖譜中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類(lèi)型完全重疊，而且snATAC?seq 測(cè)序的細(xì)胞核數(shù)量約是snRNA?seq 的2倍［29］。這說(shuō)明scATAC?seq 在細(xì)胞核類(lèi)型鑒定上擁有更高的靈敏性和分辨率。另外，對(duì)妊娠中期人類(lèi)前腦的研究也證實(shí)了scATAC?seq 數(shù)據(jù)具有足夠的靈敏性，可以在高分辨率下區(qū)分細(xì)胞亞型［30］。而在成年小鼠垂體細(xì)胞核的研究中，通過(guò)分析染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域，成功鑒定出11 個(gè)細(xì)胞簇，包括垂體細(xì)胞、催乳素細(xì)胞、生長(zhǎng)激素細(xì)胞等，并發(fā)現(xiàn)了染色質(zhì)可及性的增殖細(xì)胞標(biāo)記物［31］。對(duì)于胰腺研究，scATAC?seq 技術(shù)針對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行研究，有望促進(jìn)整個(gè)組織的深入研究，包括胰腺的內(nèi)分泌腺和外分泌腺細(xì)胞類(lèi)型［32］。總的來(lái)說(shuō)，scATAC?seq 技術(shù)在繪制染色體開(kāi)放性圖譜方面具有單細(xì)胞分辨率、全基因組覆蓋、多維數(shù)據(jù)集成和發(fā)現(xiàn)新調(diào)控元件等優(yōu)勢(shì)。它為我們深入了解細(xì)胞的基因調(diào)控和組織的功能提供了有力的工具，尤其在復(fù)雜組織如大腦和胰腺中的應(yīng)用有望取得重要突破。

3.2 疾病潛在標(biāo)志物的預(yù)測(cè)

染色質(zhì)可及性在基因調(diào)控和基因組穩(wěn)定性中具有重要作用。改變?nèi)旧|(zhì)可及性模式可能會(huì)影響基因組調(diào)控區(qū)域?qū)﹃P(guān)鍵蛋白的可接近性，因此染色質(zhì)可及性模式已成為人類(lèi)疾病的重要組成部分［33］。scATAC?seq 可以清晰地發(fā)現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)志物，并有潛力預(yù)測(cè)疾病分子標(biāo)記物。全基因組分析（GWAS）能夠在全基因組水平上檢測(cè)遺傳變異并研究基因型與表型的關(guān)聯(lián)，從而幫助識(shí)別與性狀相關(guān)的變異［34］。scATAC?seq 可以結(jié)合GWAS 的結(jié)果，并鑒定與多種復(fù)雜性狀和疾病相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型特異性富集。例如，自身免疫性疾病在白細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞簇中顯示出顯著富集，神經(jīng)學(xué)特征如雙相情感障礙、受教育程度和精神分裂癥的富集發(fā)生在神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)型中，而阿爾茨海默病在小膠質(zhì)細(xì)胞中強(qiáng)烈富集［18,30］。此外，通過(guò)與基因精細(xì)定位、全基因組測(cè)序和細(xì)胞類(lèi)型特異性數(shù)據(jù)的結(jié)合，scATAC?seq 具有預(yù)測(cè)調(diào)控功能的變異位點(diǎn)，并檢測(cè)目標(biāo)基因可及性的調(diào)控區(qū)域。這種方法已在2 型糖尿病、強(qiáng)直性脊柱炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病研究中得到應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了與疾病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控元件和靶基因［32,35-36］。此外，snATAC?seq 在晚期阿爾茨海默病的研究中識(shí)別了候選的順式調(diào)節(jié)元件與候選靶基因的聯(lián)系，并揭示了固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（SREBF1）在疾病中的調(diào)控異常［29］。綜上所述，單細(xì)胞表觀基因組學(xué)在解釋復(fù)雜疾病遺傳學(xué)方面具有重要意義，能夠識(shí)別細(xì)胞類(lèi)型特異性的疾病生物學(xué)，并發(fā)現(xiàn)易受遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子影響的細(xì)胞類(lèi)型，為疾病的理解和治療提供基礎(chǔ)。

3.3 腫瘤發(fā)生表觀機(jī)制研究

癌癥的發(fā)生受到基因和環(huán)境之間相互作用的推動(dòng)。早期組織損傷可能促進(jìn)癌癥的發(fā)展，因此在腫瘤發(fā)展到難以控制的階段之前，制定合理的策略來(lái)預(yù)防、檢測(cè)和攔截腫瘤是可能的［37］。癌細(xì)胞通過(guò)重新調(diào)整人類(lèi)基因組中的調(diào)控元件來(lái)激活基因，加速腫瘤生長(zhǎng)，并產(chǎn)生對(duì)治療的耐受性［38］。比如在基底細(xì)胞癌中，通過(guò)腫瘤微環(huán)境的scATAC?seq 有助于表征免疫和基質(zhì)中的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以及惡性細(xì)胞，并幫助識(shí)別與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中T 細(xì)胞耗竭相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制［9］。此外，在結(jié)直腸癌中，scATAC?seq 研究發(fā)現(xiàn)癌前腺瘤性息肉發(fā)展為結(jié)直腸癌時(shí)，其表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄軌跡非常一致。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶2（GP?X2）的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)可作為判斷息肉惡性程度的標(biāo)志，有助于對(duì)息肉進(jìn)行分期和評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)［39］。此外，對(duì)胰腺癌小鼠模型的scATAC?seq 研究表明，在鼠類(lèi)肉瘤病毒癌（KRAS）基因突變的胰腺上皮細(xì)胞中，在組織損傷后48 h 內(nèi)出現(xiàn)了腺泡到腫瘤的染色質(zhì)開(kāi)關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，這一過(guò)程的關(guān)鍵靶標(biāo)是白介素33（IL?33），其細(xì)胞因子活性可以替代組織損傷，加速早期腫瘤病變的形成［40］。這些發(fā)現(xiàn)為合理設(shè)計(jì)早期檢測(cè)和治療策略提供了新機(jī)會(huì)，以在早期階段攔截炎癥和關(guān)鍵細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的惡性腫瘤。而在肺腺癌中，具有更高侵襲性的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了與人類(lèi)晚期肺癌相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX 家族轉(zhuǎn)錄因子2（RUN?X2）。這一發(fā)現(xiàn)表明RUNX2 可能作為一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況［41］?？傮w而言，scATAC?seq 技術(shù)在癌癥研究中展現(xiàn)出巨大的潛力，通過(guò)揭示調(diào)控元件、轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)狀態(tài)的變化，有助于深入了解癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療反應(yīng)。這為未來(lái)開(kāi)發(fā)更有效的預(yù)防、檢測(cè)和治療策略提供了新的機(jī)會(huì)。

3.4 轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵功能

染色質(zhì)可及性的改變?cè)诩?xì)胞分化和發(fā)育中扮演著關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)角色。scATAC?seq 技術(shù)為我們提供了可視化細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄程序準(zhǔn)備過(guò)程的能力，幫助我們深入了解細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變以及在不同分化狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄因子和增強(qiáng)子的變化和可能的決定因素［42］。以視網(wǎng)膜發(fā)育為例，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子視覺(jué)系統(tǒng)同源盒2（Vsx2）對(duì)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和雙極細(xì)胞的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，其突變會(huì)導(dǎo)致小眼癥［43］。同時(shí)，在骨骼肌中，通過(guò)scATAC?seq 分析發(fā)現(xiàn)癌癥中的高甲基化1（Hic1）在骨骼肌間充質(zhì)祖細(xì)胞中充當(dāng)標(biāo)志物，其缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增生［44］。此外，在真皮成纖維細(xì)胞中，研究顯示其穩(wěn)態(tài)和損傷時(shí)的反應(yīng)具有顯著的異質(zhì)性。研究發(fā)現(xiàn)，在傷口愈合過(guò)程中，維甲酸和RUNX 家族轉(zhuǎn)錄因子1（RUNX1）是活躍于再生大創(chuàng)面中心細(xì)胞上層真皮細(xì)胞中的重要轉(zhuǎn)錄因子［45］。在乳腺上皮細(xì)胞的研究中，腔祖細(xì)胞可以逐漸轉(zhuǎn)化為泌乳型祖細(xì)胞。在這個(gè)分化過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子的活性會(huì)隨著時(shí)間的推移而增強(qiáng)或減弱，其中包括SMAD 家族成員2（SMAD2）和GATA 結(jié)合蛋白1（GATA1）［46］。Smad 家族蛋白主要參與調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)，而GATA 則在成熟腔細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。這些發(fā)現(xiàn)表明不同的轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞分化過(guò)程的不同階段具有關(guān)鍵的功能。在免疫反應(yīng)研究方面，通過(guò)對(duì)LPS 刺激奶牛全血前后進(jìn)行scATAC?seq 分析，研究人員除了確認(rèn)已知的多效性轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（NF-κB）外，還發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NFKB1、NFKBIZ、IRF5、IRF7、IRF9 和STAT1 等，它們參與調(diào)控免疫反應(yīng)和促炎反應(yīng)的過(guò)程［47］。此外，雞胚胎體軸發(fā)育的時(shí)空序列研究表明，內(nèi)源性順式調(diào)控元件的表觀基因組沉默會(huì)破壞轉(zhuǎn)錄因子15（TCF15）和間充質(zhì)同源框1（MEOX1）的表達(dá)，導(dǎo)致體軸伸展異常的出現(xiàn)［48］。最后，在牛和豬的骨骼肌研究中，scATAC?seq 技術(shù)鑒定了E2F7、JUND、ZBTB18、HLF、BACH2、FOSL2 和MAFA 等轉(zhuǎn)錄因子在肌肉發(fā)生過(guò)程中的潛在功能［49］。豬骨骼肌的研究強(qiáng)調(diào)了早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1（EGR1）和ras 同系物家族成員B（RHOB）轉(zhuǎn)錄因子在胚胎骨骼肌發(fā)育中的關(guān)鍵性作用［50］。綜上所述，scATAC?seq 技術(shù)在不同類(lèi)型細(xì)胞分化和發(fā)育研究中提供了寶貴的信息，幫助我們深入了解細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的調(diào)控機(jī)制以及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和增強(qiáng)子的變化，為癌癥、發(fā)育生物學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域的研究提供了新的視角和有益線索。

4 展望

scATAC?seq 是一種重要的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，可揭示不同類(lèi)型細(xì)胞之間的異質(zhì)性問(wèn)題，并對(duì)開(kāi)放染色質(zhì)的可及性進(jìn)行表征，從而深入研究染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控元件之間的動(dòng)態(tài)變化和相互作用關(guān)系。該技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)和基因組學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。它能夠鑒定不同細(xì)胞類(lèi)型、分析轉(zhuǎn)錄因子功能、識(shí)別和注釋增強(qiáng)子區(qū)域，并揭示細(xì)胞發(fā)育和分化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。此外，scATAC?seq 還可應(yīng)用于疾病研究，發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的染色質(zhì)特征和轉(zhuǎn)錄因子變化，從而深入了解疾病的發(fā)生機(jī)制。該技術(shù)還有助于藥物篩選和治療優(yōu)化，通過(guò)評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞的影響，幫助優(yōu)化藥物治療策略。盡管scATAC?seq 是一項(xiàng)強(qiáng)大的技術(shù)，但仍存在改進(jìn)的空間。需要解決的問(wèn)題包括提高數(shù)據(jù)質(zhì)量和降低噪音水平，改善細(xì)胞捕獲效率以提高數(shù)據(jù)可靠性和廣泛適用性。此外，開(kāi)發(fā)更準(zhǔn)確、高效的數(shù)據(jù)分析方法是必要的，以解析復(fù)雜的染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)并實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的細(xì)胞類(lèi)型鑒定、轉(zhuǎn)錄因子分析和增強(qiáng)子注釋。另外，整合和比較多個(gè)數(shù)據(jù)集的工具和方法需要進(jìn)一步改進(jìn)，以提供更全面的認(rèn)識(shí)細(xì)胞類(lèi)型和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多樣性。最后，降低成本和提高效率也是需要關(guān)注的方面，以促進(jìn)scATAC?seq 在大規(guī)模研究中的廣泛應(yīng)用。綜上所述，隨著技術(shù)的不斷成熟，scATAC?seq 正成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中不可或缺的重要工具。