涂曉媛 褚路路 王冕 陳炳智，2 江玉姬，2

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002）

珊瑚狀猴頭菇（Hericium coralloides），屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycetes），傘菌綱（Agaricomycetes），紅菇目（Russulales），猴頭菌科（Hericiaceae），猴頭菌屬（Hericium），又名松花蘑（長白山區(qū)）、玉髯［1］。子實體的形態(tài)特征為花椰菜狀，新鮮時白色或淡黃色，干時淡褐色至銹褐色［2］。目前珊瑚狀猴頭菇已馴化成功，能夠?qū)崿F(xiàn)人工栽培，該食用菌含有多糖、猴頭菌素、猴頭菌酮、甾醇等功能成分［3］，具有利五臟、滋補、助消化，主要用于神經(jīng)衰弱、胃潰瘍等疾病，是一種優(yōu)良的藥用真菌［4］。

多糖是猴頭菇主要活性成分之一［5］，對珊瑚狀猴頭菇多糖（H. coralloidespolysaccharide, HCP）的功能研究主要有增強機體的免疫力［6］、降血膽固醇［7］、抗氧化［8］、抗幽門螺桿菌［9］以及保護胃黏膜［10］等方面。近年來對食用菌多糖的研究較多，主要集中在香菇［11］、靈芝［12］、銀耳［13］等，珊瑚狀猴頭菇是近幾年栽培馴化成功的新品種，對珊瑚狀猴頭菇多糖的提取工藝優(yōu)化研究較少，本試驗采用熱水浸提法探求珊瑚狀猴頭菇多糖最佳的提取工藝參數(shù)，并通過紫外吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜、X?射線衍射對珊瑚狀猴頭菇粗多糖的結(jié)構(gòu)進行初步鑒定，同時研究珊瑚狀猴頭菇多糖的抗氧化活性。為后期進一步探索珊瑚狀猴頭菇多糖的功能活性提供基礎(chǔ)，也為珊瑚狀猴頭菇的開發(fā)及深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

珊瑚狀猴頭菇由國家食用菌品種改良中心福建分中心提供；葡萄糖、水楊酸（均為分析純）、雙縮脲法蛋白含量檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；苯酚分析純購于西隴科學(xué)股份有限公司；1,1?二苯基?2?三硝基苯肼（DPPH）、2,2?聯(lián)氮-二（3?乙基-苯并噻唑?6?磺酸）二銨鹽ABTS、抗壞血酸（VC）、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、無水四硼酸鈉、間羥基聯(lián)苯（均為分析純購于上海麥克林有限公司；95%乙醇購于福州鑫偉誠實驗儀器有限公司；過氧化氫購于上海沃凱生物有限公司；正丁醇購于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 珊瑚狀猴頭菇粗多糖（HCP）的提取 新鮮的珊瑚狀猴頭菇烘干后研磨成粉，提取過程參考楊嘉丹等［14］的方法，并稍加修改：

將粉末與蒸餾水按1∶30（g/mL）混合，熱水浴浸提后，浸提液5 000 r/min 離心10 min，取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸儀濃縮，在濃縮液中加入4 倍的95%乙醇，4℃下沉淀多糖；再將獲取的粗多糖溶液使用Sevage 法（V氯仿∶V正丁醇=4∶1）去除蛋白質(zhì)后放入透析袋（截留分子12 000-14 000 Da）中透析24 h；最后把透析袋中多糖溶液5 000 r/min 離心10 min，取上清液并冷凍干燥得HCP。

1.2.2 珊瑚狀猴頭菇多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法［15］測定多糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的葡萄糖溶液，分別取2 mL 于各試管中，加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL 濃硫酸溶液，避光放置15 min；以蒸餾水取代葡萄糖溶液作為空白對照，在490 nm 處測定其吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程y=?0.010 1+10.212 9x，R2=0.999 4。按照上述方法測定HCP 含量并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線按公式（1）計算HCP 提取率：

公式中：P：多糖提取率（%）；C：多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）；N：稀釋倍數(shù)；m：樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素試驗 按照1.2.1 方法提取珊瑚狀猴頭菇多糖，提取條件為：固定料液比1∶30（g/mL）、提取時間2.0 h、顆粒大小40 目，考察提取溫度60、70、80、90、100℃對HCP 的影響；固定提取時間2.0 h、提取溫度90℃、顆粒大小40 目，考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）對HCP 的影響；固定料液比1∶30（g/mL）、提取溫度90℃、顆粒大小40 目，考察提取時間1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h 對HCP 的影響；固定料液比1∶30（g/mL）、提取溫度90℃、提取時間2.0 h，考察顆粒大小20、40、60、80、100 目對HCP 的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上對最優(yōu)的提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、顆粒大小（D）4 個因素，利用Design?Expert 8.0.6進行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，優(yōu)化HCP 的熱水浸提工藝參數(shù)，試驗設(shè)計的方案見表1。對各因素水平下HCP 的提取率進行測定，并以計算所得的HCP 的提取率為響應(yīng)值進行方差分析。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 化學(xué)成分測定 采用苯酚硫酸法測定總糖含量；雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量；以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量［16］。

1.2.6 紫外光譜分析（UV?Vis） 參考馮鑫等［17］的方法修改，將HCP 配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的溶液，以水作為空白對照，在190-400 nm 波長范圍內(nèi)進行掃描。

1.2.7 傅里葉變換紅外光譜分析（FI?IR） 使用FI?IR 測定多糖的官能團，將HCP 粉末與KBr 粉末混合并壓縮成1 mm 顆粒，采集4 000-500 cm-1范圍內(nèi)的多糖光譜［18］。

1.2.8 X?射線衍射（XRD）分析 參照文獻［19］方法修改，采用X 射線衍射儀，掃描范圍10°-90°，掃描速率步長為10°/min,采樣間隔0.02°對HCP 進行掃描。

1.2.9 體外抗氧化試驗 根據(jù)Chen 等［20］的方法稍加修改，測定HCP 清除DPPH 自由基能力。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 不同濃度的HCP 溶液。取1 mL 樣品溶液加入1 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液充分混合，常溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測定吸光度?？瞻捉M以95%乙醇溶液取代HCP 溶液；VC為陽性對照，操作方法與樣品組相同，每組重復(fù)3 次，取其平均值，按公式計算DPPH 自由基清除率。

式中：A1：樣品溶液或者VC溶液的吸光度值；A2：95%乙醇溶液取代DPPH 溶液加入HCP 溶液或者VC溶液所測的吸光度值；A0：空白溶液的吸光度值。

參考文獻［20］的方法稍加修改測定HCP 對ABTS+自由基的清除能力，取7 mmol/L ABTS 溶液5 mL 和15 mmol/L 過硫酸鉀1 mL 于23℃恒溫箱中孵化12-16 h，使用時用蒸餾水稀釋其溶液，在734 nm 處的吸光度為0.7±0.02。取0.75 mL HCP 溶液于試管中，再加入3 mL ABTS 溶液室溫反應(yīng)15 min，在734 nm 處測量不同濃度樣品的吸光度。空白組以蒸餾水取代HCP 溶液；VC為陽性對照，操作方法與樣品組相同，每組重復(fù)3 次，取其平均值，按公式計算ABTS+自由基清除率。

式中：A1：樣品溶液或者VC溶液的吸光度值；A2：蒸餾水取代ABTS 溶液加入HCP 溶液或者VC溶液所測的吸光度值；A0：空白溶液的吸光度值。

參考文獻［21］的方法稍加修改，取1 mL HCP 溶液，分別加入5 mmol/L 的FeSO4、水楊酸、H2O2溶液各1 mL 混合，放入37℃恒溫箱中避光反應(yīng)30 min，測定其在510 nm 處測得吸光度?？瞻捉M以蒸餾水取代HCP 溶液；VC為陽性對照，操作方法與樣品組相同，每組重復(fù)3 次，取其平均值，按公式計算羥自由基清除率。

式中：A1：樣品溶液或者VC溶液的吸光度值；A2：蒸餾水取代H2O2溶液加入HCP 溶液或者VC溶液所測的吸光度值；A0：空白溶液的吸光度值。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS Statistics 23.0進行數(shù)據(jù)處理，Origin 2021 軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 珊瑚狀猴頭菇多糖提取的單因素試驗

如圖1?A 所示，隨著提取溫度的升高HCP 提取率呈上升的趨勢，當(dāng)提取溫度在80-90℃時，多糖提取率增長較快，當(dāng)高于90℃，上升趨于平緩。綜合考慮節(jié)約能源問題，提取溫度選擇90℃較為適宜。多糖提取率隨著料液比的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（圖1?B），考慮加大溶液體積會使后期濃縮和沉淀工藝難度加大［22］，因此選擇1∶30（g/mL）的液料比。如圖1?C 所示，當(dāng)提取時間達到2.0 h 時，多糖提取率達到最高，提取時間超過2.0 h，多糖提取率下降，因此，選擇提取時間2.0 h 較為適宜。隨著顆粒大小的增加，多糖的提取率逐漸升高，當(dāng)顆粒大小大于80 目后，多糖提取率開始下降（圖1?D）。因此，試驗選擇顆粒大小為80 目較適宜。

圖1 不同提取條件對多糖提取率的影響Fig. 1 Effects of different extraction conditions on the extraction rates of polysaccharides

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、顆粒大?。―）4 個因素為自變量，以珊瑚狀猴頭菇多糖提取率為響應(yīng)值，利用Box?Behnken 試驗方案，進行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2?；貧w分析見表3。

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型的方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

利用Design Expert 8.0.6 軟件對數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得到珊瑚狀猴頭菇多糖的提取率對提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、顆粒大小（D）之間的二次多項回歸方程為：Y=10.83+0.46A+0.30B+1.27C+0.1D-0.21AB-0.26AC+0.14AD-0.38BC-0.075BD-0.37CD-0.52 A2-0.43B2-1.63C2-0.7D2。

由表3 可知，P模型<0.000 1, 表明模型顯著，失擬項P=0.395 9 表示失擬項不顯著，決定系數(shù)R2=0.989 9 接近R2adj=0.979 8，證明該模型是可靠的；對模型進行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗，得到模型的一次項A、B、C 是極顯著的，說明提取溫度、提取時間、料液比對多糖的提取率有顯著影響。F值表示因素對多糖提取率的影響程度，從方差分析表中F值大小可以判斷各因素對試驗結(jié)果影響的程度，F(xiàn)值越大，因素對多糖提取率的影響越大。因此可得到各因素對多糖提取率從大到小的影響順序次序是：C（料液比）> A（提取溫度）> B（提取時間）> D（顆粒大小）。

2.2.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析 由圖2 可知，AB、AC、BC、CD 響應(yīng)面都是向下開放的，并且曲面陡峭。AC、BC、CD 等高線圖沿著料液比向等高線相對密集，響應(yīng)面圖以及等高線圖表明料液比對多糖提取率的影響比提取溫度、提取時間及顆粒大小大。等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明AC、BC、CD 有明顯的交互作用；AB 等高線圖沿著提取溫度向等高線相對密集，表明與提取時間相比較，提取溫度對HCP 的影響更大。AD、BD 兩個響應(yīng)面圖曲面向下開發(fā)，但等高線圖中的等高線較為稀疏并且其中心沒有呈現(xiàn)橢圓形，顏色變化緩慢，表明兩者交互作用不顯著。各因素交互作用對HCP 提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖分析結(jié)果與方差分析一致。

圖2 各因素交互作用對珊瑚狀猴頭菇多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 2 Response surface diagram and contour map of the effects of interactions of various factors on the extraction rates of HCP

2.2.3 優(yōu)化提取工藝參數(shù)的驗證 通過Design?Expert 8.0.6 軟件分析，獲得珊瑚狀猴頭菇多糖的最佳水提條件：提取溫度93.34℃、提取時間2.06h、料液比1∶33.5（g/mL）、顆粒大小80.15 目，在此條件下，HCP 的提取率最高，粗多糖預(yù)測值為11.14%?？紤]實際操作，在提取溫度93℃、提取時間2.0 h、料液比1∶33（g/mL）、顆粒大小80 目的條件下做驗證試驗。經(jīng)3 次重復(fù)試驗，得到實際粗多糖的提取率為11.02%，相對誤差小于1%，表明此模型可以更好地反映HCP 的提取率與影響因素之間的關(guān)系，由此可以確定HCP 最佳提取工藝條件。

2.3 HCP的化學(xué)成分分析

粗多糖經(jīng)成分分析（表4）顯示，總糖含量為65.21%±0.90%，糖醛酸含量13.52%±1.95%，含有極少量的蛋白質(zhì)。

表4 HCP 的化學(xué)成分Table 4 Chemical composition of HCP%

2.4 HCP紫外光譜分析結(jié)果

如圖3 所示，HCP 在198 nm 處有多糖特征吸收峰，260 nm 和280 nm 附近有細(xì)微雜峰，表明HCP含有少量核酸和蛋白質(zhì)。

圖3 HCP 的紫外吸收光譜圖Fig. 3 UV absorption spectrum of HCP

2.5 HCP紅外光譜分析結(jié)果

如圖4 所示，在3 417 cm-1附近的吸收峰為O?H伸縮振動；在2 931 cm-1附近的吸收峰是C?H 伸縮振動產(chǎn)生這兩個是多糖類化合物的特征吸收峰［23］。在1 651 cm-1附近的吸收峰顯示為糖醛酸中的C=O拉伸振動，說明該物質(zhì)中可能含有糖醛酸；在1 411 cm-1附近顯示為C?H 變形振動吸收峰；在1 080 cm-1附近的特征吸收峰表明HCP 可能存在吡喃糖環(huán)，在1 249 cm-1附近的特征吸收峰表示HCP 含有C?O 糖苷鍵。綜上所述，是典型的多糖類物質(zhì)并且具有吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖4 HCP 的傅里葉變換紅外吸收光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared absorption spectrogram of HCP

2.6 XRD分析

由圖5 可知，HCP 在θ=20°處附近有一個強烈凸起的寬衍射峰，表明HCP 結(jié)晶度較低，同時存在無定形和結(jié)晶部分。

圖5 HCP 的XRD 譜圖Fig. 5 XRD spectra of HCP

2.7 珊瑚狀猴頭菇粗多糖的體外抗氧化活性

2.7.1 DPPH 自由基清除能力 如圖6 所示，在0-2.5 mg/mL 范圍內(nèi)，HCP 質(zhì)量濃度的增加，對DPPH 自由基的清除能力從40.03%±4.23%增加到87.02%±2.24%呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢。從質(zhì)量濃度的角度考慮，HCP 清除DPPH 自由基的能力要弱于陽性對照組VC。HCP 對DPPH 自由基的EC50值為0.663 mg/mL。

圖6 HCP 對DPPH 自由基清除率Fig. 6 Scavenging rate of DPPH free radical to HCP

2.7.2 ABTS+自由基清除能力 如圖7 所示，HCP對ABTS+自由基的清除能力存在劑量關(guān)系，HCP對ABTS+自由基的清除能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而增加；當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時，HCP 表現(xiàn)出最強清除活性，對ABTS+自由基的清除率達到98.27%±0.73%接近陽性對照VC。HCP 對ABTS+自由基的EC50值為0.767 mg/mL。

圖7 HCP 對ABTS+自由基清除率Fig. 7 Scavenging rate of HCP to ABTS+ free radical

2.7.3 羥自由基清除能力 如圖8 所示，HCP 對羥自由基的清除能力具有依賴關(guān)系，在0-2.5 mg/mL 范圍內(nèi)，其清除率從23.99%±1.51%增加到87.65%±0.75%。與陽性對照VC相比，HCP 對·OH 自由基的清除活性相對較弱，其EC50值為0.952 mg/mL。

圖8 HCP 對羥自由基清除率Fig. 8 Scavenging rate of HCP free radical to OH

3 討論

真菌多糖常用的提取方法有熱水提取法、超聲提取法、酶提取法等，但大多數(shù)真菌多糖在熱水中溶出率較高，而且對多糖活性影響較?。?4］。因此本試驗采用水提醇沉法提取珊瑚狀猴頭菇多糖。熱水法提取多糖的提取率與溫度、時間、料液比、顆粒大小等條件有著密切的關(guān)系。因此，本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對這些因素進行了響應(yīng)面優(yōu)化試驗，根據(jù)二次模型的響應(yīng)面圖以及等高線圖評價了試驗因素對HCP 提取率的兩兩交互作用，結(jié)果表明各因素對HCP 提取率的影響強弱順序為：料液比>提取溫度> 提取時間> 顆粒大小，與胡麗玲等［25］研究一致。料液比對HCP 提取率的影響最大，胡瑞財?shù)龋?6］研究表明靈芝多糖最佳料液比為1∶30（g/mL），與本研究測定結(jié)果一致；可能是因為料液比過小會限制HCP 的溶出［27］，但隨著溶液體積的增大，其他水溶性雜質(zhì)會析出，降低水提液中的固形物含量，加大后期除蛋白工藝的難度［22］。其次是提取溫度，提取溫度會直接影響多糖在水中的溶解度，多糖提取率隨著溫度的升高而升高，白鳳岐等［28］對靈芝多糖的研究表明在90-100℃提取率最高，與本研究相似，但由于沸水提取對工業(yè)設(shè)備要求高［29］，因此選擇90℃為最適溫度。提取時間過長，多糖的結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，從而導(dǎo)致多糖提取率降低［22］；顆粒過粗，多糖溶出不充分，顆粒研磨過細(xì)，顆粒容易成團，傳質(zhì)阻力增加促使傳質(zhì)速率降低，不利于多糖分子的溶出［30-31］。研究表明HCP在此優(yōu)化提取參數(shù)條件下，提取率為11.02%，與游賢珍［32］提取滑菇多糖研究結(jié)果相比，HCP 提取率較高，說明本試驗水提多糖最佳提取工藝參數(shù)可靠。

UV?Vis 在190-200 nm、260 nm 和280 nm 附近分別為多糖、核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰；HCP在198 nm 處有最大吸收峰，符合多糖的特征曲線；280 nm 存在極其微小的弱峰，表明HCP 含有少量的蛋白質(zhì)，進一步采用雙縮脲法測定HCP 中蛋白質(zhì)含量，其含量為5.28%±0.50%，證明HCP 確實含有少量蛋白質(zhì)。XRD 可以對樣品進行物相定性，可精準(zhǔn)測定樣品的晶體結(jié)構(gòu)、結(jié)晶度等性質(zhì)［33］；且多糖的結(jié)晶結(jié)構(gòu)特征直接決定其抗張強度、柔韌性、溶解性、膨脹性和其他物理性質(zhì)［34］；本研究表明HCP 為半結(jié)晶聚合物，與Peng 等［35］研究竹筍殼多糖結(jié)果相似。FI?IR 可以分析化合物的存在，多糖在4 000-400 cm-1范圍內(nèi)有特征吸收峰，HCP 在此范圍內(nèi)有多糖的特征吸收峰并且含有糖醛酸和吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。

自由基會破壞體內(nèi)蛋白質(zhì)和酶，引起機體炎癥和衰老，清除自由基可以保護機體免受氧化損傷［36］。猴頭菇多糖具有良好的抗氧化作用，黃越等［37］研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菇粗多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時，對DPPH 和·OH 自由基的清除能力為72%和75%；對ABTS＋自由基的清除效果為85%（0.5 mg/mL）。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)HCP 質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，對DPPH、ABTS+、·OH 自由基清除能力分別為87.02%±2.24%、98.27%±0.73%、87.65%±0.75%。兩者相比，珊瑚狀猴頭菇粗多糖對DPPH、·OH 自由基的清除作用強于猴頭菇粗多糖，對ABTS+自由基的清除能力弱于猴頭菇粗多糖，可能因為品種不同，不同提取方法所提取的多糖，其糖醛酸、分子量等結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致抗氧化效果有所差異。大量研究證明多糖的抗氧化活性可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，Liu等［38］從金針菇菌渣中提取的中性多糖和酸性多糖，研究這兩種多糖對ABTS+自由基的清除效果，結(jié)果表明酸性多糖的抗氧化作用優(yōu)于中性多糖，認(rèn)為可能是因為酸性多糖含有更多的糖醛酸和硫酸鹽；Leng 等［39］研究釀酒葡萄多糖的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)Moldova（MD）品種的葡萄多糖分子量較低，糖醛酸含量較高，具有較強的抗氧化活性。綜上所述，HCP 具有良好的體外抗氧化活性，可進一步在動物體內(nèi)探究其抗氧化活性和其他功能。

4 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法得到HCP 最佳水提工藝條件：提取溫度93℃、提取時間2.0 h、料液比1∶33（g/mL）、顆粒大小80 目。HCP 體外抗氧化試驗表明，在一定濃度范圍內(nèi)，對DPPH、ABTS+、·OH 自由基具有良好的清除效果。