李奕雅 吳一凡 丁能水 范小萍 陳凡

（1. 閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，漳州 363000；2. 福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司，漳州 363000）

20 世紀(jì)末以來，隨著DNA 重組技術(shù)的蓬勃發(fā)展以及蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的不斷進(jìn)步，基于原核生物蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的異源蛋白高效生產(chǎn)早已成為現(xiàn)實［1-3］。在原核表達(dá)體系中，以大腸桿菌為代表的表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清晰、生長快速、表達(dá)量高、易于操作、連續(xù)發(fā)酵能力強(qiáng)等優(yōu)點，已廣泛作為外源蛋白的表達(dá)宿主［4］。

然而，在基于大腸桿菌的外源蛋白表達(dá)體系中，作為分離純化目標(biāo)的靶蛋白往往以胞內(nèi)組分的形式存在。在分離提取環(huán)節(jié)，為了使細(xì)胞內(nèi)含物得到釋放，首先必須對細(xì)胞進(jìn)行破碎或裂解。因此，細(xì)胞的破碎便成為提取胞內(nèi)生物活性物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)［5］。目前，常用的大腸桿菌細(xì)胞破碎技術(shù)，主要有高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎法、酶溶法、化學(xué)滲透法等［6］。其中，超聲破碎法作為一種低成本、易使用的菌體破碎手段，一直被廣泛應(yīng)用。該法利用超聲波在液體介質(zhì)中引起的空化效應(yīng)，產(chǎn)生高壓力的沖擊波和局部高溫，破壞細(xì)胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來，參與后續(xù)的純化過程［7］。其作用效果受到探頭直徑、超聲功率、溶液體積、容器大小、容器材質(zhì)、破碎緩沖液組成以及超聲作用時間等多方面因素的協(xié)同影響，若不作針對性優(yōu)化，則難以達(dá)到較好的效果——在保證破碎率的基礎(chǔ)上，盡可能保全靶蛋白的生物活性［8］。因此，超聲破碎的參數(shù)優(yōu)化，就成為原核表達(dá)蛋白質(zhì)純化過程中的關(guān)鍵步驟之一。而這一優(yōu)化過程，往往需要借助SDS?PAGE 及其后續(xù)的染色結(jié)果判斷，費時費力且只能得到半定量的結(jié)果，效率與精度亟待提高［9］。

螢火蟲（Photinus pyralis） 熒光素酶（firefly luciferase, FLuc）大量存在于螢火蟲尾部，與生物發(fā)光密切相關(guān)［10-12］。其分子量約61 kD，常用于報告基因檢測，具有靈敏度高、半衰期短、特異性強(qiáng)等特點，早已成為醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要標(biāo)記工具［13-15］。目前，已有研究表明［16］，F(xiàn)Luc 的作用底物D?Luciferin 在堿性條件下帶負(fù)電荷，無法穿透大腸桿菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜，不能與胞內(nèi)的FLuc產(chǎn)生反應(yīng)。若控制緩沖液的pH 值在堿性范圍，則向表達(dá)FLuc 的菌懸液中添加底物時，底物僅與游離的FLuc 產(chǎn)生反應(yīng)，發(fā)出熒光，故可用于表征菌體裂解時外屏障的受損情況。此外，F(xiàn)Luc 自身熱穩(wěn)定性不佳［17］，在35℃以上環(huán)境中，即可檢測到活性顯著下降。這一特點可用于破碎過程中超聲熱效應(yīng)的判定，為維持靶蛋白特別是熱不穩(wěn)定靶蛋白在破碎環(huán)節(jié)中的活性提供重要參考。

本研究使用基于大腸桿菌cspA啟動子的原核表達(dá)載體［18］，利用螢火蟲熒光素酶活性作為破碎指標(biāo)，考察了其在海腎熒光素酶（Renilla luciferase, RLuc）、增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）和紅色熒光蛋白（mCherry）表達(dá)菌株破碎過程中的定量效果。研究成果為大腸桿菌細(xì)胞破碎過程中的條件優(yōu)化和目標(biāo)蛋白的活性保全提供了簡便易行的評價手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 pCold III DNA 載體（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）；BL21 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（上海唯地生物技術(shù)有限公司）。轉(zhuǎn)化了pCold?FLuc、pCold?RLuc、pCold?EGFP 和pCold?mCherry 等表達(dá)載體的BL21 菌種由本課題組構(gòu)建并保存，各載體結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 本研究使用的載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic representation of the plasmid structures used in this study

1.1.2 試劑 酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid）；氯化鈉、甘油（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氨芐青霉素鈉鹽、RealBand 三色預(yù)染蛋白Marker、IPTG（生工生物工程（上海）股份有限公司）；10×SDS 電泳緩沖液、10%蛋白預(yù)制膠、Ni?NTA 樹脂（鎳珠）（北京蘭博利德商貿(mào)有限公司）；DL101?01 雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.1.3 儀器 XS?TD1 臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱（象尚昱科（上海）實驗儀器有限公司）；Spark 多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；T30D 型三槽超級梯度PCR 儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；UV?1600 紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；H2050R?1 高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；VCX800 細(xì)胞破碎儀（美國Sonics 公司）；Imager 600 UV 生物分子成像儀（美國GE 公司）；DYCZ?24DN 垂直電泳槽、DYY?6D 電腦三恒多用電泳儀電源（北京六一生物科技有限公司）；VM?100旋轉(zhuǎn)混合儀（杭州佑寧儀器有限公司）；GelSMART凝膠成像儀（大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化與靶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 取保存于?80℃的甘油菌1 μL，加入到750 μL 氨芐（100mg/L，下同）抗性LB 培養(yǎng)基中，置于37℃，220 r/min環(huán)境中振蕩培養(yǎng)16 h。隨后取其中的500 μL，加入到150 mL氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至濁度（以O(shè)D650計，避免mCherry 被入射光激發(fā)，干擾檢測［19］）介于0.5-0.6 之間，再添加終濃度100 μmol/L 的IPTG，置于15℃，220 r/min環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并開展后續(xù)實驗。

1.2.2 菌體的超聲破碎 按1.2.1 所述步驟誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，在7 000 ×g，4℃離心2 min 后，棄上清，收集菌泥，以20 mL 冰冷的PBS 緩沖液（pH 7.4，0.01 mol/L，下同）重懸，重復(fù)離心一次，棄上清后以10 mL 冰冷的PBS 重懸。隨后利用50 mL 離心管盛放菌液，置于冰水混合物中，使用直徑6 mm 的超聲探頭，在指定功率下按照“破碎2 s，停止3 s”的條件破碎并采樣檢測。破碎樣品經(jīng)15 000 ×g，4℃離心15 min 后，取上清液檢測蛋白質(zhì)活性。

1.2.3 熒光素酶活性檢測 取一定量經(jīng)PBS 稀釋的熒光素酶樣品，用試劑盒附帶的細(xì)胞裂解液補(bǔ)足20μL 后，利用多功能酶標(biāo)儀逐孔檢測。檢測時，利用自動進(jìn)樣器添加對應(yīng)的底物，再對酶標(biāo)板進(jìn)行2 s 的振蕩，隨后立即檢測熒光強(qiáng)度。此外，檢測FLuc 活性時，設(shè)置數(shù)據(jù)衰減模式為“OD1”（約衰減到原始數(shù)值的10%）；檢測RLuc 活性時，應(yīng)將儀器衰減模式設(shè)置為“OD3”（約衰減到原始數(shù)值的0.1%），以避免過曝。

1.2.4 熒光蛋白活性檢測 利用多功能酶標(biāo)儀檢測EGFP（濾光片組合：EX?485；EM?535）和mCherry（濾光片組合：EX?535；EM?595）活性時，取破碎后的上清液，用PBS 補(bǔ)足100 μL 后上機(jī)檢測。為避免過曝，EGFP 檢測過程中需將增益值（Gain）設(shè)置為45，mCherry 檢測時需將增益值設(shè)置為60。

1.2.5 螢火蟲熒光素酶輔助破碎定量效果檢測 按1.2.1、1.2.2 有關(guān)步驟進(jìn)行靶蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和菌體清洗，最終得到表達(dá)4 種靶蛋白的菌懸液各10 mL。此后，向含有RLuc、EGFP 和mCherry 的菌懸液中，各加入20 μL 表達(dá)了FLuc 的菌懸液。再于160 W 功率下進(jìn)行超聲破碎。破碎結(jié)束后，取上清液2.5 μL，按1.2.3 所述方法直接檢測螢火蟲熒光素酶活性；針對海腎熒光素酶，則取稀釋500 倍后的上清液2.5μL 檢測；對于含有EGFP 或mCherry 的上清液，則按1.2.4 所述步驟，取5 μL 上清液檢測活性。

1.2.6 溫度對蛋白質(zhì)活性的影響評價 按1.2.1、1.2.2 所述步驟進(jìn)行靶蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和菌體破碎（160W，15 min）。隨后取若干個0.2 mL 離心管，每管加入50 μL 含有靶蛋白的上清液，先利用梯度PCR 或冰水混合物（0℃）孵育15 min，再以室溫孵育15 min，隨后以0℃處理的樣品活性為100%，檢測并計算各靶蛋白的殘余活性。

1.2.7 不同破碎功率對熒光素酶活性的影響評價 按1.2.1、1.2.2 有關(guān)步驟進(jìn)行靶蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和菌體清洗，得到表達(dá)FLuc 和RLuc 的菌懸液各10 mL，取每種菌懸液20 μL，加入到10 mL 冰冷的PBS 中，混合均勻后按1.2.2 所述的超聲破碎方法分別使用160 W、240 W 和320 W 超聲功率進(jìn)行菌體破碎，并于破碎過程中定時采樣獲得破碎上清液，取其中2.5 μL 直接檢測熒光素酶活性。

1.2.8 蛋白質(zhì)活性的半定量攝像 針對FLuc 樣品，取少量含有FLuc 的破碎上清液，用試劑盒附帶的細(xì)胞裂解液補(bǔ)足20 μL，再加入檢測用底物溶液100μL，混合2 s 后立即使用攝像頭采集反應(yīng)圖像。針對EGFP 或mCherry 樣品，取少量含熒光蛋白的破碎上清液，用PBS 補(bǔ)足100 μL 后，通過485 nm 光源激發(fā)熒光，以520 nm 濾光板（長通型）輔助拍照。

1.2.9 蛋白質(zhì)的鎳珠法純化與電泳檢測 用10 倍鎳珠體積的PBS 清洗鎳珠3 次，再將等體積的鎳珠添加到待純化的蛋白質(zhì)溶液中，混勻后取樣保存。隨后以20 r/min，4℃上下回旋振蕩12 h，500 ×g離心3 min 后取少量上清液保存。再以PBS 清洗鎳珠3 次，取約20 μL 鎳珠顆粒保存。最后將終濃度1×的SDS?PAGE 上樣緩沖液加入各樣品中，定容至100 μL，95℃加熱10 min 后取其中15 μL 進(jìn)行SDS?PAGE（分離膠濃度10%）檢測，并以考染方式分析電泳結(jié)果。

1.2.10 凍存菌的破碎與檢測 按1.2.1 所述步驟誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白的菌液，離心清洗菌體1 次，用10mL 含有體積分?jǐn)?shù)為30%的甘油的PBS 重懸。再將重懸后的菌液分裝置于?80℃冷凍保存。此后，每隔30 d 取出含有FLuc 和RLuc 的菌懸液各1 mL，37℃水浴解凍，離心后用10 mL 冰冷的PBS 重懸，隨后以160 W 功率破碎，并定時取樣。破碎上清液用PBS 稀釋50 倍后，取2.5 μL 檢測熒光素酶活性。

1.2.11 統(tǒng)計分析 所有檢測結(jié)果使用Minitab v17.0軟件進(jìn)行數(shù)值統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean± SD）”形式表示（每組實驗均重復(fù)3 次）。待比較數(shù)據(jù)的方差一致時，使用Tukey 方法進(jìn)行多重比較；方差不一致時，使用Games?Howell 方法進(jìn)行多重比較。同一實驗中，不含共享字符的兩組數(shù)據(jù)存在顯著差異（P<0.05）。

2 結(jié)果

2.1 熒光素酶和熒光蛋白活性檢測條件的確定

在各靶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和菌體超聲破碎（160 W，20 min） 后， 對含有FLuc、RLuc、EGFP 和mCherry 等4 種蛋白質(zhì)的上清液進(jìn)行活性檢測（FLuc和RLuc 樣品在檢測前須稀釋500 倍），并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。由各標(biāo)準(zhǔn)曲線可見，本研究選擇的樣品添加量與反應(yīng)熒光強(qiáng)度存在較強(qiáng)的線性關(guān)系，可認(rèn)為對應(yīng)的檢測方法和上清液用量是有效且準(zhǔn)確的。此外，基于圖2 所示數(shù)據(jù)可知，在輔助破碎的過程中，向目標(biāo)菌懸液中按1∶500（體積比）添加表達(dá)FLuc的菌懸液，能夠?qū)z測讀數(shù)控制在標(biāo)準(zhǔn)曲線所及的范圍內(nèi)并留有余量，足以為破碎過程提供定量依據(jù)。

圖2 經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的4 種蛋白質(zhì)活性標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curves of four induced proteins activities after induction

2.2 超聲破碎的螢火蟲熒光素酶輔助定量效果檢驗

確定輔助定量所需的FLuc 菌液用量后，按照1.2.5 所述步驟，檢驗FLuc 表達(dá)菌對RLuc、EGFP和mCherry 表達(dá)菌的超聲破碎輔助定量效果。以破碎樣品中活性最強(qiáng)的平均值為100%，繪制活性變化曲線如圖3 所示。通過對圖3 中各子圖的分析可知，F(xiàn)Luc 在破碎上清液中的活性上升趨勢與3 種靶蛋白基本一致。說明FLuc 對靶蛋白的釋放過程起到了良好的定量表征作用，能為不同條件下超聲破碎參數(shù)的設(shè)置提供有效參考。

圖3 三種菌懸液超聲破碎的螢火蟲熒光素酶輔助定量結(jié)果圖Fig. 3 Firefly luciferase-assisted quantification of ultrasonic disruption for three bacterial suspensions

2.3 螢火蟲熒光素酶對超聲破碎功率的敏感性測試

按1.2.6 所述實驗步驟，對4 種蛋白質(zhì)分別進(jìn)行加熱和保溫處理，探討溫度對4 種蛋白質(zhì)活性的影響，結(jié)果如圖4 所示，可得到如下結(jié)論：（1）由圖4?A,B 可見，F(xiàn)Luc 和RLuc 在38.5℃和40℃環(huán)境下處理15 min 后，活性明顯下降，且FLuc 活性損失較大。（2）在圖4?C, D 中，EGFP 和mCherry 所表現(xiàn)出的熱穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于熒光素酶，其活性僅在處理溫度大于67℃后出現(xiàn)下降，且mCherry 的活性下降更為緩慢。因此，后續(xù)宜選用“FLuc+RLuc”這一對溫度更敏感的蛋白質(zhì)組合，考察不同破碎功率對終產(chǎn)物活性的影響。

圖4 不同處理溫度下4 種蛋白質(zhì)活性的變化Fig. 4 Activity changes of four proteins incubated under different temperatures

按1.2.7 所述步驟，以不同超聲功率對熒光素酶表達(dá)菌進(jìn)行破碎，結(jié)果顯示，（1）以160 W 功率破碎（圖5?A），熒光素酶活性在10 min 內(nèi)達(dá)到最大值，隨后逐步下降，破碎25 min 后，兩種酶的活性損失均大于45%。（2）以240 W 功率破碎（圖5?B），熒光素酶活性在5 min 內(nèi)達(dá)到最大并迅速下降，破碎結(jié)束后，兩種酶的活性損失均大于85%。（3）以320 W 功率破碎（圖5?C），熒光素酶活性在10 min內(nèi)就經(jīng)由升高到近乎完全損失，高功率帶來的負(fù)面效應(yīng)明顯。綜合圖5 所示結(jié)果，認(rèn)為FLuc 的活性變化確實能夠反映出破碎條件過于劇烈的可能，從而為蛋白質(zhì)活性的保全提供重要參考。

圖5 不同超聲破碎功率對破碎后熒光素酶活性的影響Fig. 5 Effects of different ultrasonic power on luciferase activity after sonication

2.4 添加熒光素酶對靶蛋白純化的影響

本研究使用的FLuc 不帶純化標(biāo)簽且用量極少，理論上不干擾靶蛋白的后續(xù)純化。為驗證該假設(shè)，首先按照1.2.8 所述步驟，拍攝了實驗2.1 所使用的FLuc、EGFP 和mCherry 破碎上清液的活性影像，結(jié)果如圖6?A-C 所示。可見各上清液中確實含有與樣品對應(yīng)的外源蛋白。隨后再將FLuc/EGFP 或FLuc/mCherry 上清液按2∶1（體積比）混合，作為待純化的樣品，按1.2.9 所述步驟進(jìn)行鎳珠吸附檢測，結(jié)果如圖6?D 所示。由該結(jié)果看出，即便在過量添加FLuc 的樣品中，該酶也難以被鎳珠吸附，其對應(yīng)條帶基本保留在上清液中，與EGFP 和mCherry 的顯色結(jié)果截然相反。因此，以FLuc 作為破碎輔助定量手段時，其對鎳珠純化過程及產(chǎn)物純度的影響可忽略不計。

圖6 螢火蟲熒光素酶的添加對靶蛋白后續(xù)純化的影響Fig. 6 Effect of firefly luciferase addition on the purification of target proteins

2.5 低溫凍存對輔助定量效果的影響

按1.2.10 所述步驟，驗證菌體凍存對輔助定量效果的影響，結(jié)果（圖7）顯示，兩種熒光素酶的活性曲線中，后3 組數(shù)據(jù)的均值在連續(xù)4 次檢測中未見下降趨勢（酶活僅因檢測溫度不同，略有波動），說明凍存期間兩種熒光素酶的活性并未產(chǎn)生可檢出的損失。熒光素酶活性曲線中，0-3 min 內(nèi)的斜率最大，說明破碎初始階段，菌體對超聲作用最為敏感。而在連續(xù)4 次檢測中，位于3 min 數(shù)據(jù)點的數(shù)值，與后3 組數(shù)據(jù)均值之比都在50%-60%之間波動，同樣未見明顯上升趨勢。且圖7?A 所示新鮮菌液的破碎曲線與圖7?B-D 所示凍融菌的破碎曲線，在趨勢上也大體相同，可見一次凍融對大腸桿菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的破壞有限，并不能大幅降低菌體對外力破壞的耐受性，凍融菌破碎難度與新鮮菌體基本一致。

圖7 不同凍存時間對螢火蟲熒光素酶輔助定量效果的影響Fig. 7 Effect of different cryo-storage time on firefly luciferase-assisted quantification

3 討論

螢火蟲熒光素酶具有靈敏度高、線性范圍廣、檢測操作簡單且結(jié)果容易量化等特點，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。本研究提出并驗證了大腸桿菌超聲破碎的螢火蟲熒光素酶輔助定量方法，進(jìn)一步拓寬了熒光素酶的應(yīng)用范圍，其主要優(yōu)勢在于：（1）實際操作中，由于破碎效果受多種條件的協(xié)同影響，使超聲處理條件的精細(xì)優(yōu)化較為繁瑣。本法利用表達(dá)了FLuc 的大腸桿菌作為內(nèi)標(biāo)，通過破碎過程中熒光素酶的活性釋放情況，表征待測菌體的破碎程度，特別適合靶蛋白活性檢測困難的場合，能為大腸桿菌的超聲破碎條件優(yōu)化提供量化指導(dǎo)且不影響靶蛋白的后續(xù)純化，具有良好的可行性。（2）在超聲破碎過程中，氧化效應(yīng)、空化效應(yīng)，特別是熱效應(yīng)的持續(xù)累積［20］，可能對靶蛋白的高級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，對終產(chǎn)物的質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。因此，一種能夠反映破碎條件是否過于劇烈，從而避免靶蛋白活性損失的指標(biāo)就顯得極為重要。而熱穩(wěn)定性不佳且分子量適中［21-22］的FLuc，恰恰適合監(jiān)測破碎條件的劇烈程度，并能夠給出溶液的整體量化均數(shù)，對于穩(wěn)定性高于FLuc 的靶蛋白，其數(shù)據(jù)有較高的參考價值，信息量豐富。但仍應(yīng)注意在實際操作中，破碎條件對靶蛋白活性的影響，還與其自身的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)。對于具體的研究項目，靶蛋白與FLuc相比是否更為穩(wěn)定，應(yīng)通過預(yù)實驗對比確認(rèn)。若遇到靶蛋白穩(wěn)定性較差的情況，可考慮使用條件上更為溫和的化學(xué)或酶法裂解，減小破碎過程中的損失。（3）輔助定量過程中，F(xiàn)Luc 表達(dá)菌的用量極少。若FLuc 表達(dá)菌需要隨目標(biāo)菌一同培養(yǎng)，則整個定量流程將過于繁瑣。而依據(jù)實驗結(jié)果，研究人員可將表達(dá)FLuc 的菌體分裝后低溫凍存，且凍存菌可在至少3 個月內(nèi)保持相似的檢測靈敏度，對需要反復(fù)優(yōu)化破碎條件的研究工作極為有利，也極大地保障了方法的實用性和便捷性。

此外，從本文所示的各項實驗結(jié)果中也能推斷：（1）輔助定量可使用的熒光素酶不僅限于FLuc。在本文所示數(shù)據(jù)中，RLuc 在破碎過程中的活性變化和FLuc 十分接近，同樣可以作為定量依據(jù)。但FLuc 在生物學(xué)研究中應(yīng)用較早，試劑盒國產(chǎn)化程度高［23-25］，檢測成本相對低廉，故成為本研究的首選酶系。（2）因FLuc 的原核表達(dá)效率較高，故應(yīng)避免使用閃光型熒光素酶檢測試劑盒。一方面其熒光強(qiáng)度高，容易造成檢測器過曝；另一方面，閃光型反應(yīng)發(fā)光時間過短，檢測特別是手動加樣檢測時誤差較大，往往導(dǎo)致更大的數(shù)據(jù)變異系數(shù)，對輔助定量極為不利。（3）研究結(jié)果顯示，超聲破碎時，菌體的用量也能顯著影響破碎結(jié)果。相同功率下，菌體量少則破碎速度快，但破碎造成的蛋白質(zhì)變性情況也將增加。這可能與菌體用量大時，隨菌體破碎而進(jìn)入外部緩沖液的物質(zhì)量增加有關(guān)。通常情況下，蛋白質(zhì)自身或環(huán)境中極性氨基酸濃度增大時，其穩(wěn)定性也相應(yīng)提高。且游離到胞外的分子伴侶蛋白，也可能對靶蛋白的高級結(jié)構(gòu)起到保護(hù)或修復(fù)的作用，故其整體活性能夠維持在比較高的水平［26-27］。（4）本研究中pCold III DNA 載體使用了大腸桿菌的cspA啟動子，故大部分大腸桿菌均可作為宿主使用，僅表達(dá)量可能有所不同，具備廣泛應(yīng)用的潛力。且從理論上分析，無論使用何種破碎方式或表達(dá)宿主種類，只要該宿主表達(dá)的FLuc 有活性并累積于胞內(nèi)，而破碎方式又不影響FLuc 的活性和檢測，均可使用本定量方法。（5）若靶蛋白的表達(dá)對細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜有破壞作用，則兩種菌體破碎難度不同，不適用本研究所述的輔助定量方式。

4 結(jié)論

本研究建立了以螢火蟲熒光素酶為內(nèi)標(biāo)的大腸桿菌超聲破碎輔助定量方式，利用相對簡便的操作和穩(wěn)定的檢測結(jié)果，較好地解決了大腸桿菌超聲破碎過程中的檢測效率問題，適合超聲破碎的條件優(yōu)化或日常實驗中的質(zhì)量監(jiān)控，為相關(guān)研究人員提供了又一實用工具。