姜永針，楊海龍，郭悅怡，吳茜涵，吳延睿，張 晶

（武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

副豬嗜血桿菌（Glaesserella parasuis，Gps）是嚴(yán)重威脅豬群的重大細(xì)菌性病原之一。臨床上常見于敗血癥和肺炎在內(nèi)的多系統(tǒng)炎癥，其中以格拉瑟氏病為典型特征。豬群中Gps 普遍存在且難以被凈化，其發(fā)病率高，病情嚴(yán)重時病死率可達(dá)50%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前有關(guān)Gps 侵染肺部的研究主要集中在細(xì)菌毒力因子介導(dǎo)的免疫逃避，以及組織炎癥和細(xì)胞自噬相關(guān)信號的調(diào)控。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。由于各種原因引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn)錯誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集而導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞會啟動未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）保護(hù)機制，激活UPR 的三條信號通路（IRE1α 通路、PERK 通路和ATF6 通路）以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白折疊的壓力，重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[3]?；钚匝酰≧OS）、TLR 配體和一些細(xì)胞因子（IL-17 和TNF-α）已被證實可激活細(xì)胞內(nèi)UPR 信號通路，觸發(fā)細(xì)胞炎癥和組織損傷。

目前，已有關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在免疫應(yīng)答、病毒/細(xì)菌感染、炎癥等方面的研究報道，但在Gps 感染肺部過程中是否引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激尚未見報道。本試驗利用副豬嗜血桿菌血清5 型感染昆明小鼠24 h 建立肺部炎癥模型，再通過實時熒光定量PCR 方法檢測Gps 感染后肺組織中炎性因子及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)基因的變化情況，旨在初步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在該感染過程中的潛在作用，為進(jìn)一步深入了解Gps感染仔豬引發(fā)多系統(tǒng)炎癥的機制提供新的研究方向。

2 材料與方法

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

將副豬嗜血桿菌（SH0165 菌株血清5 型）用0.005%NAD和5%胎牛血清的TSA固體培養(yǎng)基復(fù)蘇，連續(xù)傳代至第3 代；在無菌條件下挑取單菌落，加入含有0.005%和5%胎牛血清的TSB 液體培養(yǎng)基（5 mL）中，設(shè)置搖床37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)10 ～12 h，將其作為種子液；然后將菌液按照2%接種量接種到相同的TSB 液體培養(yǎng)基中，搖床37℃、180r/min 培養(yǎng)10 ～12 h。

2.2 分組與接種

將昆明小鼠（采購自武漢逸摯生物科技有限公司，全雌性，6 周齡）20 只隨機平分為2 組，實驗組和對照組各10 只。實驗組：每只小鼠腹腔注射5.5×109CFU 副豬嗜血桿菌0.2 mL；對照組：腹腔注射同等劑量生理鹽水，觀察24 h后殺鼠取樣。

2.3 總RNA 提取及cDNA 合成

按照TRNzol Universal 總RNA 提取試劑說明書采用直接裂解法提取總RNA。采用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗。

2.4 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR 擴(kuò)增體系（總體積為10 μL）如下：2× SYBR Green Pro Taq HS Premix 5 μL，RNase-free water 3.6 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.2 μL。實時熒光定量PCR擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性30 sec；95 ℃變性5 sec，60 ℃退火和延伸30 sec，共40 個循環(huán)。實時熒光定量PCR的所有數(shù)據(jù)均采用2-△△Ct法進(jìn)行比較分析。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并進(jìn)行繪圖，在軟件上采用t-test 進(jìn)行組間差異分析，數(shù)據(jù)表示為（±s），P ＞0.05表示無顯著性差異（ns），P ＜0.05 表示存在顯著性差異（*），P ＜0.01 表示存在極顯著差異（**），P ＜0.001 表示呈極顯著差異（***）。

2 結(jié)果

2.1 感染Gps 后小鼠肺組織中炎性因子的表達(dá)變化

根據(jù)圖1 的結(jié)果顯示，與對照組相比，在Gps 感染24 h 后，小鼠肺組織中IL-6 與IL-1β的表達(dá)均上調(diào)了5 倍以上，同時TNF-α 的表達(dá)上調(diào)了2 倍以上，表明Gps 感染引發(fā)了小鼠肺部炎癥反應(yīng)。

圖1 Gps 感染24 h 后，小鼠肺組織中炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達(dá)量的檢測結(jié)果

2.2 感染Gps 后小鼠肺組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)基因的表達(dá)變化

根據(jù)圖2 的結(jié)果顯示，與對照組相比，在Gps 感染24 h 后，小鼠肺組織中PERK、ATF6、IRE1、GRP78、ATF4、EIF2α、JNK、XBP1 和CHOP均顯著上調(diào)（P ＜0.05），提示Gps 感染誘導(dǎo)了小鼠肺組織細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。另外，我們檢測了細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspese-3、BCL-2和Bax 的表達(dá)變化，結(jié)果顯示：與對照組相比，在Gps 感染24 h 后，小鼠肺組織中caspase-3與BAX 的表達(dá)顯著上調(diào)，而BCL-2 的表達(dá)顯著下調(diào)，提示Gps 感染誘導(dǎo)小鼠肺部組織中的細(xì)胞凋亡。

圖2 Gps 感染24 h 后，小鼠肺組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)基因及凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的檢測結(jié)果

3 討論

研究已證實Gps 感染引發(fā)豬肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本試驗檢測了Gps 感染小鼠24 h 后肺組織中炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 基因的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示這三個炎性因子的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，說明Gps 感染小鼠肺部炎癥模型構(gòu)建成功。

目前研究已證實ERS 可調(diào)控多種細(xì)胞類型中的炎癥通路，包括肝細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、β 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞?；钚匝酰≧OS）、TLR配體和一些細(xì)胞因子（IL-17 和TNF-α）可激活UPR 中的IRE1α 與PERK，進(jìn)一步加劇炎癥。有文獻(xiàn)表明，ERS 在D-GalN/LPS 誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠模型中被激活，抑制ERS 可減少TNF-α和IL-1β 的表達(dá)，且減輕肝損傷。本試驗研究發(fā)現(xiàn)Gps 感染小鼠24 h 后，肺組織中UPR 的三條信號通路中的關(guān)鍵基因均顯著上調(diào)，提示Gps感染誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，可能進(jìn)一步加強炎癥反應(yīng)。

此外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR 的激活與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，PERK 的激活導(dǎo)致EIF2α 的磷酸化，進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子ATF4 和促凋亡效應(yīng)子CHOP 的表達(dá)。CHOP 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的凋亡中起關(guān)鍵作用，它可以降低促凋亡BCL-2 的表達(dá)并增加Bax 的表達(dá)。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，而Bax是一種促凋亡蛋白。在細(xì)胞內(nèi)，Bcl-2 和Bax 之間的平衡是維持細(xì)胞生存和凋亡的重要因素。當(dāng)Bcl-2 的表達(dá)相對較高時，它會抑制Bax 的活性，從而維持細(xì)胞的生存；相反，當(dāng)Bax 相對較高時，它會抑制Bcl-2 的抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，IRE1 可以觸發(fā)凋亡信號激活激酶-1（ASK1）的激活，從而激活下游激酶JNK，進(jìn)一步抑制Bcl-2 和激活Bax。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，Gps 感染小鼠24 h 后，肺組織中促凋亡基因caspase-3與Bax 的表達(dá)顯著上調(diào)，而抗凋亡基因BCL-2 的表達(dá)顯著下調(diào)，提示小鼠肺組織中發(fā)生細(xì)胞凋亡且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)，但具體功能和調(diào)控機制仍不清楚，還需進(jìn)一步研究。