牛靈玥，王慧，楊俊，杜麗飛，劉俊琦,2※，周望平※

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 430131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

雞腹瀉性疾病是細(xì)菌、病毒、環(huán)境等多種因素均可引發(fā)的常見(jiàn)群發(fā)性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為患病雞食欲下降，生長(zhǎng)減緩，產(chǎn)蛋量降低[1]。大腸桿菌和沙門(mén)氏菌是導(dǎo)致雞腹瀉病的兩種重要且常見(jiàn)的食源性病原微生物。沙門(mén)氏菌每年引起全世界超過(guò)13 億人口感染，超過(guò)20 萬(wàn)例死亡[2]。沙門(mén)氏菌在成年雞體內(nèi)一般呈隱性感染，垂直傳染給下一代或通過(guò)肉、蛋等制品進(jìn)入人體，引起食物中毒，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和公共健康[3]。大腸桿菌通常存在于哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)的胃腸道及其他黏膜表面，分為共生菌株和致病菌株[4,5]。共生菌株與宿主共同生存，互惠互利；致病菌株則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的感染性疾病，且飼養(yǎng)環(huán)境不當(dāng)、應(yīng)激、其他疾病后的繼發(fā)感染都可導(dǎo)致其病發(fā)生，對(duì)宿主機(jī)體造成嚴(yán)重破壞[4-7]。其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是致病菌株中的一種，主要引起禽類(lèi)腹瀉甚至死亡，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，對(duì)禽產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的感染診斷主要通過(guò)細(xì)菌分離鑒定、生化試驗(yàn)、分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)等，常規(guī)的檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)，且對(duì)操作人員、技術(shù)、時(shí)間都有較高的要求[8,9]。單重PCR 技術(shù)彌補(bǔ)了這一不足，降低了對(duì)人員和耗時(shí)的要求，但單次只能檢測(cè)一種基因的限制使得其仍然不適應(yīng)集約化大量養(yǎng)殖的現(xiàn)狀。多重PCR技術(shù)基于PCR 技術(shù)發(fā)展而來(lái)，可以實(shí)現(xiàn)兩種以上的基因同步檢測(cè)，進(jìn)一步提升檢測(cè)速度和通量，在檢測(cè)效率和靈敏度方面都有較大提升[9-11]。

1 材料

1.1 菌株來(lái)源

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的菌種均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離、鑒定和保存。

1.2 主要試劑

DNA 聚合酶、dNTP Mix 和PCR 緩沖液均購(gòu)自杭州博日科技股份有限公司；DNA marker、標(biāo)準(zhǔn)leader 均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek 公司。

1.3 主要儀器與耗材

移液槍、移液槍頭、PCR 管、核酸電泳儀、PCR儀、凝膠成像設(shè)備、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)等。

2 方法

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與基因組DNA 模板提取

將菌種在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，再按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒步驟提取細(xì)菌基因組DNA作為模板，并于-20 ℃保存。

2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GENBANK 和參考文獻(xiàn)[2,3,12,13]，選擇產(chǎn)腸毒素大腸桿菌特征性毒力基因hlyE 基因和沙門(mén)氏菌特征基因invA 基因作靶標(biāo)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，使產(chǎn)物長(zhǎng)度大小相差100 bp 行比對(duì)，引物由北京擎科生物有限公司合成。引物及產(chǎn)物長(zhǎng)度如表1。

表1 設(shè)計(jì)使用的引物

2.3 多重PCR 方法的建立及優(yōu)化

以沙門(mén)氏菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌基因組DNA為模板，加入相應(yīng)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，構(gòu)建50 μL體系，DNA 聚合酶2 μL、5× Buffer 20 μL、TP Mix 2 μL、A 模板和上、下游引物分別各1 μL、ddH2O 補(bǔ)足到50 μL，進(jìn)行初次雙重PCR 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證引物可信度。而后分別調(diào)整DNA 聚合酶、dNTP、Mg2+、引物濃度以及退火溫度等條件，確立最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，建立多重PCR 方法。

2.3.1 酶的優(yōu)化

保持dNTP、Mg2+、模板和引物濃度不變，改變加入酶的量為0.125、0.25、0.5、0.75 μL，加水配平至50 μL 體系，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，而后進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果。

2.3.2 dNTP 的優(yōu)化

將酶優(yōu)化的結(jié)果帶入體系，Mg2+、模板和引物濃度及反應(yīng)條件不變，每管分別加入dNTP 1、2、3、4、5、6、7 μL，并加水配平50 μL 體系，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，而后進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果。

2.3.3 Mg2+的優(yōu)化

將酶和dNTP 優(yōu)化的結(jié)果帶入，保持模板和引物濃度及反應(yīng)條件不變，每管分別加入Mg2+buffer 2、3、4、5、6、7、8 μL，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證。

2.3.4 引物的優(yōu)化

將前文體系優(yōu)化結(jié)果帶入，配平模板后取引物梯度0.5、1、1.5、2 μL，兩種引物兩兩配對(duì)，共16 種進(jìn)行PCR 擴(kuò)增與凝膠電泳檢驗(yàn)。

2.3.5 退火溫度的優(yōu)化

將體系優(yōu)化結(jié)果帶入，構(gòu)建50 μL 體系，應(yīng)用梯度PCR 儀設(shè)置55～62 ℃的溫度梯度，間隔1 ℃，共8 個(gè)梯度，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)。

2.4 靈敏性檢測(cè)

分光光度計(jì)測(cè)得產(chǎn)腸毒素大腸桿菌濃度187.85 ng/μL、沙門(mén)氏菌濃度7.9 ng/μL，以1∶23比例混合均勻，10 倍倍比稀釋得DNA 濃度為15.3、1.53、0.153、0.0153 ng 的梯度為模板，以優(yōu)化后的多重PCR 方法擴(kuò)增，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

2.5 特異性檢測(cè)

用優(yōu)化后的多重PCR 方法，分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室已分離的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌等細(xì)菌的DNA 模板，以驗(yàn)證多重PCR 方法的特異性。

2.6 檢測(cè)方法的應(yīng)用

從某養(yǎng)禽場(chǎng)采集腹瀉糞便樣本59 份，用普通肉湯進(jìn)行37 ℃增菌培養(yǎng)，取少量培養(yǎng)后的菌液于無(wú)菌EP 管內(nèi)，沸水煮10 min 后轉(zhuǎn)冰浴10 min，再放入離心機(jī)12 000 r/mim 離心5 min，取上清液進(jìn)行PCR 檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 多重PCR 方法的建立和優(yōu)化

分別以產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和沙門(mén)氏菌DNA 為模板進(jìn)行單重PCR 和雙重PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)，均可擴(kuò)增到符合預(yù)期大小的特異性條帶。在單重PCR 的基礎(chǔ)上，優(yōu)化酶、dNTP、Mg2+、引物濃度和退火溫度建立多重PCR 方法（圖1～5）。結(jié)果顯示，在50 μL 體系中，BioReady Pfu（5 U/μL）0.5 μL，10× Reaction Buffer（含20 mmol MgSO4）5 μL，2.5 mmol dNTP Mixture 3 μL，兩種引物分別各（10 μmol）1 μL，核酸模板各1 μL，水37.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，重復(fù)30 個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。此時(shí)可高效且特異性擴(kuò)增出目的條帶并無(wú)雜帶出現(xiàn)。

圖1 酶的優(yōu)化

圖2 dNTP 優(yōu)化

圖3 鎂離子優(yōu)化

圖4 引物優(yōu)化結(jié)果

圖5 退火溫度優(yōu)化

3.1.1 酶優(yōu)化結(jié)果

凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BioReady Pfu（5 U/μL）酶最優(yōu)量為0.5 μL。

3.1.2 dNTP 優(yōu)化結(jié)果

凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2.5 mmol dNTP Mixture 最優(yōu)量為3 μL。

3.1.3 Mg2+優(yōu)化結(jié)果

凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示加入10× Reaction Buffer（含20 mmol MgSO4）的最優(yōu)量為5 μL。

3.1.4 引物優(yōu)化結(jié)果

凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分別為1 μL 引物時(shí)結(jié)果較好。

3.1.5 退火溫度優(yōu)化結(jié)果

凝膠電泳結(jié)果顯示，退火溫度取57 ℃與58 ℃間為最優(yōu)結(jié)果。

3.2 靈敏性檢測(cè)

靈敏性檢測(cè)結(jié)果表明，多重PCR 方法對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限度分別為1.53 ng 和0.153 ng（圖6）。

圖6 靈敏性檢測(cè)

圖7 特異性檢測(cè)

3.3 特異性檢測(cè)

特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，只有產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和沙門(mén)氏菌DNA 模板有明顯的擴(kuò)增條帶，其他細(xì)菌模板均無(wú)條帶顯示。

3.4 樣品檢測(cè)

在養(yǎng)殖場(chǎng)采集到的59 份糞便樣品中，檢測(cè)到13 份產(chǎn)腸毒素大腸桿菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率為22.0%；7份沙門(mén)氏菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率為11.8%，7 份同時(shí)表現(xiàn)沙門(mén)氏菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌陽(yáng)性。

表2 樣品檢測(cè)統(tǒng)計(jì)

4 討論

禽大腸桿菌病和沙門(mén)菌病不僅是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了重大困擾和經(jīng)濟(jì)損失，還是重要的食源性病原，可感染人類(lèi)致病甚至引起死亡。因此，建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及公共衛(wèi)生具有重要意義。

傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法需要經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清凝集試驗(yàn)或通用引物擴(kuò)增測(cè)序等方式，操作繁雜、費(fèi)用昂貴，不能滿足養(yǎng)殖場(chǎng)生產(chǎn)實(shí)際的檢測(cè)需求。常規(guī)PCR 檢測(cè)方法具有靈敏度高，特異性好等特征，但一個(gè)體系只能擴(kuò)增同一個(gè)靶片段，影響檢測(cè)效率。采用多重PCR 進(jìn)行檢測(cè)，該方法具有高效快速、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可以大大縮短常規(guī)PCR 的檢測(cè)時(shí)間。

本研究選擇沙門(mén)氏菌高度保守的特異性基因invA[14]和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致病性毒力基因hlyE基因[12,15]作為靶標(biāo)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。多重PCR 影響因素復(fù)雜，除引物和模板外，dNTP、Mg2+、酶濃度同樣會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的影響[10]，因此，對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以優(yōu)化后的方法對(duì)目的菌株和非目的菌株進(jìn)行擴(kuò)增，僅目的菌株存在目的片段，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，證明本反應(yīng)體系穩(wěn)定，引物特異性良好。

此方法對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1.53 ng 和0.153 ng，與相關(guān)研究中10 pg～1 ng 范圍重疊[3,10,13,16]，與魏娟文[13]等對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)最低1 ng 結(jié)果相符，與梁華[16]等建立的多重PCR 方法100 pg 檢測(cè)結(jié)果相同，優(yōu)于劉東海[3]等對(duì)沙門(mén)氏菌檢測(cè)最低0.5 ng 靈敏度。

在部分完成種源凈化的養(yǎng)殖場(chǎng)中，由于沙門(mén)氏菌的水平傳播能力強(qiáng)，仍會(huì)出現(xiàn)沙門(mén)氏菌的感染，而因應(yīng)激、環(huán)境不適、繼發(fā)感染等因素導(dǎo)致的致病性大腸桿菌感染同樣常見(jiàn)。因此，及時(shí)快速地對(duì)環(huán)境、食水、養(yǎng)殖人員、腹瀉雞糞便進(jìn)行檢測(cè)與隔離病雞，可以有效地阻止兩種病菌的水平傳播，保護(hù)健康雞不被傳染從而減少養(yǎng)殖戶的損失?！?/p>