婁云麗,熊 浩,歐海波,錢孟佼,劉 旭

(1.云南省滇南中心醫(yī)院/紅河州第一人民醫(yī)院 a.病案統(tǒng)計(jì)科 b.心胸外科,云南 蒙自 661100;2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院/青島大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院心臟外科,山東 青島 266000)

華法林是心臟瓣膜置換術(shù)后的主要抗凝藥物,但治療劑量因種族和個(gè)體間的不同,差異較大[1],細(xì)胞色素P450 2C9基因(Cytochrome P450 2C9,CYP2C9)和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合1基因(Vitamin K epoxide reductase complex 1 gene,VKORC1)所編碼的蛋白酶是主要的華法林代謝酶[2]。除CYP2C9*1野生型外,CYP2C9*2(C.430C>T)、CYP2C9*3(C.1075A>C)位點(diǎn)突變可導(dǎo)致CYP2C9酶的代謝活性減低[3];同時(shí),VKORC1基因-1639 G>A位點(diǎn)突變的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)可解釋5%～28%的不同人群中華法林維持劑量的差異情況[4]。云南紅河地區(qū)彝族人口眾多,呈大雜居、小聚居的特點(diǎn),少數(shù)民族間通婚和表親婚姻的現(xiàn)象較為常見,導(dǎo)致其基因型與內(nèi)地漢族有較大差異[5,6]。本研究旨在探明紅河彝族CYP2C9、VKORC1基因突變頻率與華法林維持劑量的關(guān)系,為華法林的個(gè)體化給藥研究提供理論支持,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年10月-2021年10月在紅河州第一人民醫(yī)院就診的紅河州彝族心臟人工瓣膜置換術(shù)后的140例患者進(jìn)行臨床資料匹配,數(shù)據(jù)納入實(shí)驗(yàn)組,同時(shí)納入漢族人群作為對(duì)照組:共172例。收集外周血標(biāo)本、收集臨床相關(guān)因素如:年齡、性別、體重、身高、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio,INR)等相關(guān)臨床資料及華法林實(shí)際維持劑量(Acture Warfarin Dose,AWD),見表1。本研究所收集數(shù)據(jù)已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 入組人群一般臨床資料

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)心臟瓣膜置換術(shù)后接受華法林抗凝治療;(2)華法林抗凝狀態(tài)平穩(wěn);(3)INR在1.5～3.0之間。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患有血液系統(tǒng)疾病、出血性疾病或惡性腫瘤;(2)患有胃腸道活動(dòng)性潰瘍或在近3個(gè)月內(nèi)發(fā)生過消化道出血;(3)妊娠期和哺乳期婦女;(4)嚴(yán)重肝功能不全和腎功能不全患者;(5)華法林過敏;(6)患者依從性差,不配合完成隨訪者。

1.2 研究方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系檢測(cè)CYP2C9和VKORC1基因的多態(tài)性,根據(jù)反應(yīng)曲線及△Ct值來確定樣本DNA的基因型。比較入組患者CYP2C9等位基因的突變位點(diǎn)(CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3)和VKORC1-1639G>A基因多態(tài)性的分布差異。本研究中,根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)性及方差齊性,對(duì)計(jì)數(shù)資料的檢驗(yàn)采用了泊松檢驗(yàn),對(duì)計(jì)量資料分組檢驗(yàn)采用了卡方檢驗(yàn)、秩和比檢驗(yàn)等方法,以上統(tǒng)計(jì)分析過程由Stata 16軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 收集患者相應(yīng)臨床資料,見表1。

2.2 所有入組患者行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)

檢測(cè)CYP2C9和VKORC1-1639G>A的基因分型,見圖1。

圖1 患者CYP2C9和VKORC1-1639G>A基因分型PCR擴(kuò)增反應(yīng)曲線

2.3 分析遺傳基礎(chǔ)信息

紅河彝族居民體表面積(Body Surface Area,BSA)均值為:1.56±0.16m2,較漢族人群偏低(P<0.001)。紅河州彝族居民 INR均值為:1.86±0.92,低于漢族人群的2.33±0.40(P<0.001);紅河州彝族居民高血壓與心臟病患病率均低于漢族人群(P<0.001);彝族人群NYHA3級(jí)低于漢族人群,而NYHA4級(jí)要比漢族人群偏高;華法林實(shí)際劑量2組人群無明顯差異,見表2。

表2 2組組人群遺傳基礎(chǔ)信息及INR值的比較

2.4 分析2組人群中CYP2C9突變位點(diǎn)和VKORC1-1639 G>A基因分型的分布差異

CYP2C9*1/*1及VKORC1-1639 AA的基因分型為研究人群中的主要構(gòu)成;但漢族人群中的VKORC1-1639 AA純合突變率要高于紅河彝族人群中(P<0.001),見表3。

表3 CYP2C9突變位點(diǎn)和VKORC1-1639G>A基因分型在2組人群中的分布差異

2.5 進(jìn)一步分析不同的CYP2C9突變位點(diǎn)和VKORC1-1639 G>A基因分型是否會(huì)對(duì)不同人群的AWD值產(chǎn)生差異影響

結(jié)合上述基因分型特點(diǎn),構(gòu)建患者AWD值的分布箱式圖,見圖2;CYP2C9*3位點(diǎn)突變包括:*1/*3突變雜合和*3/*3突變純合,由于突變頻率低,合并為CYP2C9*3(*1/*3、*3/*3)+VKORC1 AA基因分型,其AWD值總體分布在1.75～2.50mg/d(中位數(shù));而對(duì)于CYP2C9*1/*1+VKORC1 AA的主要基因分型,2組人群AWD值總體分布在2.0～3.0mg/d(中位數(shù));CYP2C9*1/*1+VKORC1 GA基因分型,2組人群AWD值總體分布在3.0～4.0mg/d(中位數(shù)),見圖2。方差分析發(fā)現(xiàn):不同基因分型,2組人群中AWD值的分布并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表4。

圖2 AWD值分布情況箱式圖

表4 2組人群中不同CYP2C9+VKORC1-1639 AA基因分型中華法林AWD均值比較

3 討論

3.1 不同民族華法林相關(guān)代謝基因的突變情況

華法林抗凝的靶點(diǎn)是競(jìng)爭(zhēng)性抑制VKORC1亞基,而VKORC1-1639 G>A的突變,可導(dǎo)致VKORC1表達(dá)減少,從而使維生素K的循環(huán)利用減少,維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性降低,使華法林抗凝劑量的需要量明顯減少[3];同時(shí),CYP2C9*2、*3的突變,可導(dǎo)致細(xì)胞色素CYP2C9酶轉(zhuǎn)錄后在肝臟中的代謝活性分別降低30%、80%[7],使患者所需華法林AWD值減少。有文獻(xiàn)報(bào)道:白種人群CYP2C9*2(C.430C>T)突變率為22%[8],亞洲人群里,中國(guó)及東亞人群并沒有發(fā)現(xiàn)CYP2C9*2突變等位基因或突變頻率極低[9-11],而南亞印度多個(gè)地區(qū)CYP2C9*2的突變頻率波動(dòng)較大,在1.2%～9.6%左右[12],CYP2C9*5、*6、*8 和 *11常見于非洲人群[13,14];VKORC1 1639G>A突變頻率在白種人群中為65%～75%左右,中國(guó)人群中為99%,而南亞印度的突變頻率卻明顯要低得多,且南北地區(qū)的波動(dòng)幅度在11.7%～31%左右,可能與印度國(guó)內(nèi)種族較多有關(guān)聯(lián)[12]。因此,由于地域、人種等的不同,CYP2C9及VKORC1 1639G>A突變頻率差異較大,是導(dǎo)致華法林抗凝劑量差異大的原因之一[15]。

本文僅在漢族人群中發(fā)現(xiàn)1例CYP2C9基因*1/*2的雜合突變(突變率0.005%)和 2例VKORC1 GG的野生純合型(其G>A突變率98%),盡管民族上有一定差異,但紅河少數(shù)民族居民在上述兩個(gè)基因表型上,與東亞人群并無太大差別,與以往對(duì)我國(guó)人群的研究結(jié)論一致[16,17]。從結(jié)果中可以看出:盡管漢族人群中的VKORC1-1639 AA純合突變率要高于紅河彝族人群,而考慮到每個(gè)患者做為一個(gè)完整個(gè)體,是無法把這兩個(gè)代謝相關(guān)基因表型的差異對(duì)華法林維持劑量的影響作用分開來進(jìn)行評(píng)價(jià),所以通過箱式圖分布得到進(jìn)一步的驗(yàn)證,CYP2C9*1/*1+VKORC1 AA的主要基因分型,AWD值總體均分布在2.0～3.0mg/d,但2組人群比較無顯著差異。這一現(xiàn)象說明:僅靠華法林代謝基因CYP2C9和VKORC1多態(tài)性的單一遺傳因素并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)華法林的實(shí)際劑量。

3.2 華法林代謝的影響因素

紅河州彝族合并高血壓、冠心病及術(shù)后心功能3級(jí)(NYHA分級(jí))患者要低于漢族人群,此因素也可能會(huì)對(duì)華法林的代謝造成不同影響;與Qian等[18]研究紅河少數(shù)民族人群的基因分布情況的結(jié)論相一致,需根據(jù)多重線性回歸等方式對(duì)相應(yīng)少數(shù)民族人群的因素進(jìn)行多元分析,構(gòu)建相應(yīng)的華法林劑量預(yù)測(cè)公式,才能讓華法林抗凝治療能夠更精準(zhǔn)地應(yīng)用于上述少數(shù)民族人群。值得注意的是:入組的病例均為無出血或栓塞不良事件的穩(wěn)定劑量患者,而紅河州彝族患者INR值波動(dòng)在:1.76±0.45～1.95±1.04,低于漢族人群2.28±0.45～2.64±0.67(P<0.001),INR值維持在2.0～3.0時(shí),接受華法林抗凝治療的患者不易發(fā)生出血、栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥[19],是否可以推測(cè):紅河州彝族居民接受抗凝治療時(shí),若增加華法林口服劑量,使其INR值達(dá)到漢族人群的水平,是否會(huì)出現(xiàn)出血的嚴(yán)重并發(fā)癥,這值得筆者在后續(xù)工作深入研究。

本研究提示:高原地區(qū)居民長(zhǎng)期處于低氧環(huán)境,存在凝血功能激活狀態(tài),當(dāng)創(chuàng)傷、手術(shù)等應(yīng)激作用后,血小板及凝血因子的大量消耗,可導(dǎo)致機(jī)體處于低凝狀態(tài),出血風(fēng)險(xiǎn)增加[20,21]。云南省紅河哈尼族彝族自治州地形以山區(qū)為主(占85%),平均海拔高度在1300～1600m左右,屬于典型的亞高原地區(qū),具有高原地區(qū)的低氣壓、缺氧和高紫外線輻射等特點(diǎn)[22,23]。因而,在分析紅河州居民華法林維持劑量的影響因素時(shí),是否也需要把亞高原地區(qū)作為影響因素進(jìn)行分析,是下一階段筆者所要考慮的一個(gè)問題。

綜上所述,紅河彝族人群以CYP2C9*1/*1野生純合型及VKORC1-1639 AA突變純合的基因型為主,與東亞人群無明顯差別;AWD值總體分布在2.0～3.0mg/d,雖然彝族VKORC1-1639 AA純合突變率低于漢族人群;僅靠CYP2C9和VKORC1代謝相關(guān)基因的遺傳多態(tài)性并不能準(zhǔn)確估算華法林的實(shí)際劑量,針對(duì)彝族人群基因多態(tài)性、體表面積、合并疾病及環(huán)境等多因素等建立精準(zhǔn)的華法林劑量預(yù)測(cè)模型,值得本文在后續(xù)研究中深入討論。