李心蕓,熊振飛,吳杏英,湯樣華

(1.杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院 康復科,浙江 杭州311200;2.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院 骨科,浙江 杭州311201;3.浙江中醫(yī)藥大學 第三臨床醫(yī)學院,浙江 杭州 310053)

關(guān)節(jié)軟骨纖維化、退行性變和丟失,關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨骨質(zhì)再生,以至關(guān)節(jié)不穩(wěn)、半脫位和屈曲性攣縮是膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)的主要發(fā)病機制[1],與正常磨損、年齡及肥胖等密切相關(guān)[2]。KOA的總發(fā)病率達到8.1%,其中,在60歲以上人群中高達30%[3]。目前臨床治療KOA尚無特效藥,多用非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥、膝關(guān)節(jié)鏡治療及人工膝關(guān)節(jié)置換等,但常伴有各種副反應及并發(fā)癥[4]。

低頻脈沖電磁場作為一種無創(chuàng)傷、費用低廉、可長期使用的非藥物療法,近年來成為骨關(guān)節(jié)炎物理治療領(lǐng)域的研究熱點。中醫(yī)辨證分型分期研究發(fā)現(xiàn)[5],骨關(guān)節(jié)炎以肝腎虧虛、氣血不足為本,局部血瘀為標。團隊前期研究結(jié)果[6-7]顯示,自擬益氣化瘀補腎方對氣虛血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎具有較好的治療效果。本研究選取基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、X型膠原蛋白(Col-X)作為觀察指標,從分子生物學、形態(tài)學角度來探討益氣補腎化瘀方聯(lián)合低頻脈沖電磁場對小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的影響。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠45只(8周齡)由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供(動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2013-0016)。飼養(yǎng)條件:(22±2) ℃ 恒溫,濕度50%～60%,光照每12 h明暗交替,換風次數(shù)15～20次/h。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的要求。本研究通過杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核。

1.2 主要試劑和儀器 本研究中所用主要試劑包括Trizol、RIPA裂解液、PMSF、Citrate 檸檬酸鹽緩沖液(MDL)、蘇木素染液、DAB kit、MMP13 抗體、beta Catenin Antibody、小鼠TNF-α ELISA試劑盒、番紅固綠染色試劑盒、小鼠IL-1β ELISA試劑盒、SYBR Green qPCR試劑盒、HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒等,主要儀器有低頻脈沖電磁場治療儀(龍之杰,型號LGT-20000A)、Micro-CT(ZKKS,型號MCT-Ⅲ)、酶標儀(MD,型號CMaxPlus)、核酸定量儀(Thermo Scientific,型號Nanodrop one)、實時熒光定量PCR儀(羅氏,型號LightCycler? 96)、正置熒光顯微鏡(Leica,型號DM3000)、成像系統(tǒng)(日本尼康,型號Nikon DS-U3)。

1.3 動物造模 小鼠適應性飼養(yǎng)1周后選取 42只小鼠制作膝骨關(guān)節(jié)炎模型。剩余2只小鼠作為陰性對照組,1只小鼠備用。模型組小鼠禁食24 h后用0.3%戊巴比妥鈉(100 μL/10 g)將小鼠深度麻醉并固定在恒溫手術(shù)板上,右側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮、碘伏消毒,將模型組小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開,暴露髕韌帶,鈍性分離韌帶與右側(cè)肌肉間的筋膜,并向上分離股四頭肌,直至將鑷子插入到髕韌帶下方后,牽拉韌帶能將髕骨及韌帶拉向膝關(guān)節(jié)外側(cè)為止。將髕韌帶引向膝關(guān)節(jié)外側(cè),暴露膝關(guān)節(jié)腔,彎屈膝關(guān)節(jié),暴露前交叉韌帶,在直視下,將其剪斷或割斷,行前抽屜實驗以驗證前交叉韌帶已剪斷。清洗傷口,逐層縫合,術(shù)后每天肌肉注射給予小鼠青霉素5 000 U,連續(xù)3天。對照組小鼠鈍性分離肌肉和筋膜,同樣牽拉髕骨至一側(cè),但不剪斷前交叉韌帶。

造模8周后,分別取2只造模組小鼠、2只陰性對照組小鼠眼眶血清,離心后取上清液,檢測并對比2組血清中IL-1β和TNF-α的含量,結(jié)合脛骨平臺軟骨組織形態(tài)及后期Micro-CT表現(xiàn),確定小鼠造模是否成功。

1.4 分組及處理 于單腿造模2個月后選取2只小鼠驗證是否造模成功,其余40只按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、中藥組、低頻脈沖電磁場組、聯(lián)合組,每組各10只?？瞻讓φ战M和中藥組分別予以生理鹽水、益氣補腎化瘀方水煎劑灌胃,每次1 mL,每日2次;低頻脈沖電磁場組予低頻脈沖電磁場治療,每天1次,每次30 min;聯(lián)合組在中藥灌胃的基礎上加用低頻脈沖電磁場。益氣補腎化瘀方:黃芪15 g、黨參12 g、川芎12 g、丹參9 g、仙靈脾12 g、補骨脂12 g、防己10 g、牛膝12 g,每次制成水煎劑200 mL。膝關(guān)節(jié)電磁場治療的具體參數(shù)根據(jù)臨床應用參數(shù)結(jié)合查閱文獻[8-9]制定:①磁場強度采用兩檔強度交變,第一檔強度為2.5～3.5 mT,第二檔強度為 3.5～4.2 mT;②頻率共8檔,按出現(xiàn)順序依次為32、28、24、22、20、16、12、8 Hz,治療過程中采用頻率掃描模式,每4 min變化1檔。所有組均連續(xù)處理2個月。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 小鼠膝關(guān)節(jié)CT影像表現(xiàn) 干預結(jié)束后,先行Micro-CT掃描各組小鼠右膝關(guān)節(jié):參數(shù)為電壓45 KeV、電流555 μA、功率25 W、曝光時間48 ms、分辨率35 μm、掃描角度180°,做9 μm連續(xù)掃描后選取一個固定的興趣區(qū)(ROI)體積進行數(shù)據(jù)分析。運用NRecon軟件和CTvox軟件進行小鼠腳掌的三維圖像重建和繪制3D立體圖,記錄骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁的厚度(Tb.SP)、分離度(Tb.SP)和選取 ROI 體積(TV)。

1.5.2 KOA小鼠膝關(guān)節(jié)組織Col-X、MMP-13 mRNA表達 頸椎錯位法處死各組KOA小鼠,提取組織樣本以備用:迅速剃掉小鼠腿部肌肉及韌帶,暴露小鼠右膝關(guān)節(jié),清除膝關(guān)節(jié)周圍的軟組織及韌帶等,將右膝關(guān)節(jié)上下約1 cm截斷。Trizol提取各組模型小鼠的細胞總RNA,并用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時熒光定量PCR。qRT-PCR反應條件為:94 ℃,40 s; 56 ℃,40 s,72 ℃,1 min,共40次循環(huán)。qRt-PCR引物序列見表1。

表1 小鼠qRT-PCR引物序列Table 1 Mice qRT-PCR primer sequence

1.5.3 膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)及MMP-13表達 取關(guān)節(jié)軟骨固定、石蠟包埋,采用番紅-固綠染色、免疫組化染色分別觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)及MMP-13表達情況。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 整個實驗過程中,沒有發(fā)生動物死亡和感染現(xiàn)象。造模8周后,造模組血清IL-1β和TNF-α水平高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.001),見圖1。獲取小鼠膝關(guān)節(jié)組織樣本時發(fā)現(xiàn)造模后的小鼠脛骨平臺軟骨逐漸出現(xiàn)色澤改變、局灶充血、表面磨損、軟骨表面龜裂、潰瘍形成,后期Micro-CT檢測時發(fā)現(xiàn)造模小鼠膝關(guān)節(jié)骨體積分數(shù)與骨小梁厚度較正常值低。結(jié)合相關(guān)文獻[10],提示骨性關(guān)節(jié)炎小鼠造模成功。

注:與空白對照組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。圖1 模型組與空白對照組小鼠血清中的 IL-1β﹑TNF-α水平比較Figure 1 Comparison of serum levels of IL-1β and TNF-α between the model group and the control group

2.2 膝關(guān)節(jié)組織Col-X與MMP-13 mRNA表達 與空白對照組相比,中藥組、低頻脈沖電磁場組、聯(lián)合組KOA小鼠膝關(guān)節(jié)組織中Col-X與MMP-13的表達水平均降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中,聯(lián)合組最低。見表2。

表2 KOA小鼠膝關(guān)節(jié)組織中Col-X、MMP-13 mRNA的表達水平Table 2 Expression levels of Col-X and MMP-13 mRNA in knee tissue of KOA

2.3 膝關(guān)節(jié)軟骨組織的變化情況 番紅-固綠染色顯示:空白對照組膝關(guān)節(jié)表面有較大裂隙,軟骨缺失,軟骨基質(zhì)番紅染色不明顯,軟骨細胞數(shù)量嚴重減少,潮線模糊不清;與空白對照組相比,低頻脈沖電磁場組、中藥組、聯(lián)合組骨平面較為完整,磨損程度較輕;尤其是聯(lián)合組,骨面基本完整無明顯磨損。見封三圖1。

2.4 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-13的表達情況 免疫組化檢測顯示:中藥組、低頻脈沖電磁場組、聯(lián)合組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的MMP-13蛋白表達量均低于空白對照組,且聯(lián)合組低于其他2個治療組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見封三圖2。

2.5 小鼠膝關(guān)節(jié)組織的Micro-CT表現(xiàn) 與中藥組相比,聯(lián)合組小鼠膝關(guān)節(jié)骨體積分數(shù)與骨小梁厚度均上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);2組間的骨小梁分離度與骨體積,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3、圖2。

表3 低頻脈沖電磁場對OA小鼠膝關(guān)節(jié)組織的影響Table 3 Effects of low-frequency pulsed electromagnetic field on knee tissue of OA

圖2 中藥組(A)和聯(lián)合組(B)膝關(guān)節(jié)組織的微CT掃描影像表現(xiàn)Figure 6 MicroCT scanning image of knee tissue in the Chinese medicine group (A) and the combined group (B)

3 討論

中醫(yī)學治病求本,標本皆治,且副反應較少,日漸成為臨床治療KOA的研究熱點之一。本研究團隊前期研究結(jié)果[6-7]表明:骨關(guān)節(jié)炎以肝腎虧虛、氣血不足為本,局部血瘀為標;自擬益氣化瘀補腎方對膝骨性關(guān)節(jié)炎具有較好的治療效果,基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、X型膠原蛋白(Col-X)與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制及患者病程緊密相關(guān)。

低頻脈沖電磁場作為一種非藥物療法,具有無創(chuàng)傷、 無感染、操作簡單、費用低廉、可長期使用、安全性好等優(yōu)勢。目前,脈沖電磁場(PEMFs)正被應用于骨科康復領(lǐng)域以促進成骨修復和保護關(guān)節(jié)[8]。脈沖電磁場刺激骨愈合的科學基礎是運用電活動給各種骨細胞施加機械負荷從而促進骨細胞的再生和修復[9]。本研究結(jié)果顯示:①從分子生物學角度分析,與空白對照組相比較,低頻脈沖電磁場組KOA小鼠膝關(guān)節(jié)組織中Col-X與MMP-13的表達水平有所降低,尤其是聯(lián)合組KOA小鼠膝關(guān)節(jié)組織中Col-X與MMP-13的表達水平是最低的;②從解剖學、影像學角度分析,聯(lián)合組KOA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷程度最輕,軟骨及骨面基本完整無明顯磨損,骨體積分數(shù)與骨小梁厚度在各組數(shù)據(jù)中最高。

MMP-13是一種能調(diào)解細胞外基質(zhì)退化的關(guān)鍵酶。已有研究揭示MMP-13可通過各種ECM分子降解細胞外基質(zhì)中90%的Ⅱ型膠原蛋白(Col-Ⅱ),而Col-Ⅱ在軟骨的生理周轉(zhuǎn)中發(fā)揮作用[10]。 Zhang等[11]在研究miR-320靶向抑制β-catenin并降低MMP-13表達以抑制軟骨細胞膠原降解中也發(fā)現(xiàn)MMP-13極有可能是Wnt/β-catenin通路下游產(chǎn)物,這與本研究的前期研究結(jié)果相符[6-7]。一項有關(guān)動物模型類風濕性關(guān)節(jié)炎的研究[12]表明,接受抗IL-17治療的老鼠出現(xiàn)MMP-13表達的減少和炎癥的緩解,這支持了MMP-13在關(guān)節(jié)炎進展中的作用。當MMP-13水平升高時,軟骨細胞的外層結(jié)構(gòu)可能因軟骨的細胞外基質(zhì)退化而受損[13],從而觸發(fā)KOA。本研究結(jié)果表明MMP-13水平下降最顯著的KOA小鼠,膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷程度最輕,關(guān)節(jié)退化程度也較輕,這進一步證明了MMP-13在KOA發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用。

目前,針對Col-X的研究雖然較少,但現(xiàn)有的研究[14]已發(fā)現(xiàn),KOA軟骨損傷的病理變化為軟骨細胞發(fā)生肥大變性,并伴有Col-X表達增多。且He 等[15]研究發(fā)現(xiàn)Col-X參與了肥大軟骨細胞生成的某個過程,可作為肥大軟骨細胞的特異性表達標志物。Nicol等[16]在研究兒童骨生成的過程中發(fā)現(xiàn)Col-X在軟骨細胞胚胎期和機體生長發(fā)育過程中促進軟骨內(nèi)成骨和使軟骨細胞周圍基質(zhì)鈣化,促進骨骼的形成和發(fā)育。同時也有相關(guān)研究[17-18]表明,膠原蛋白可通過Wnt/β-catenin通路減少軟骨肥大細胞生成。本研究結(jié)果表明Col-X的下降越顯著,其關(guān)節(jié)軟骨損傷情況也越輕微,這也驗證了上述研究結(jié)果。同時,我們也發(fā)現(xiàn)Col-X常與MMP-13的表達存在一定的一致性。

綜上,低頻脈沖電磁場能改善KOA,并在此基礎上提高益氣補腎化瘀方對KOA的治療效應,加快KOA的癥狀改善,為KOA的臨床中西醫(yī)治療方案提供了一定的科學依據(jù)和借鑒意義。低頻脈沖電磁場(FPEMFs)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎可能有以下3個作用機制:提高軟骨細胞功能減緩軟骨細胞退變,保護軟骨細胞;調(diào)控各種信號通路,從而引起一系列化學變化,保護軟骨細胞;促進軟骨蛋白的合成進而促進細胞的修復,尤其是金屬蛋白酶。本研究中我們還發(fā)現(xiàn)MMP-13和Col-X可能存在相關(guān)性,兩者常處于共同升高或降低狀態(tài),所以Col-X極有可能也參與MMP-13降解軟骨細胞外基質(zhì)這一過程,Cao等[19]的研究結(jié)果也進一步佐證了這一推測。前期研究發(fā)現(xiàn)MMP-13、Col-X與Wnt/β-catenin信號通路有著密切的關(guān)系,結(jié)合本研究結(jié)果,我們考慮益氣補腎化瘀方聯(lián)合低頻脈沖電磁場治療膝骨性關(guān)節(jié)炎極有可能是通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路完成,這也將成為后續(xù)研究的重點方向。