周錫勛 ，劉朝清 ，朱曉漫 ，艾曉輝

（1.岳陽漁美康生物科技有限公司，湖南 岳陽 414199；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430223）

復(fù)合碘溶液是精碘溶解后，經(jīng)絡(luò)合、稀釋、酸化而得到的一種消毒劑，具有廣譜、高效、低毒、使用便捷等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，合理使用碘制劑，可起到消毒、驅(qū)殺蟲、調(diào)節(jié)生長與代謝等作用[2]。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila） 是淡水養(yǎng)殖的主要病原菌之一，嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展，對養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]?，F(xiàn)比較復(fù)合碘溶液和改良復(fù)合碘溶液對嗜水氣單胞菌的抑菌效果，并檢測其對草魚的急性毒性，確定改良復(fù)合碘溶液的安全濃度，為改良復(fù)合碘溶液在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚與養(yǎng)殖條件

試驗(yàn)用健康草魚200 尾，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所基地提供，平均體質(zhì)量為（80±20）g。試驗(yàn)前在玻璃水族箱（規(guī)格為1.0 m×0.6 m，水深0.5 m）中暫養(yǎng)7 d。試驗(yàn)用水為充分曝氣自來水，養(yǎng)殖和試驗(yàn)過程中水體持續(xù)充氧，保持水中溶解氧質(zhì)量濃度＞5.0 mg/L，pH 值為 7.5～8.0，溫度為（26±2）℃。

1.1.2 試驗(yàn)藥物及菌種

試驗(yàn)藥物：改良復(fù)合碘溶液（由漁美康生物科技有限公司研發(fā)配制），拜耳迪典復(fù)合碘溶液（成都科宏達(dá)科技有限公司）。

試驗(yàn)菌種：嗜水氣單胞菌XS-91-4-1，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所提供。

1.1.3 儀器設(shè)備

高速離心機(jī)（Velocity 18R，Dynamica 公司）；生物安全柜（AC2-4S，新加坡ESCO 公司）；生化培養(yǎng)箱（ZSD-1160，上海智城分析儀器制造有限公司）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-100B，上海智城分析儀器制造有限公司）；電子天平（YP601N，上海高致精密儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 改良復(fù)合碘溶液對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果

1.2.1.1 嗜水氣單胞菌的活化與培養(yǎng)

取20 μL 嗜水氣單胞菌甘油保存菌種于LB 固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用無菌接種環(huán)取培養(yǎng)板上生長狀態(tài)良好的單菌落，接種于LB 液體培養(yǎng)基，置于搖床28 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)好的菌液1 mL，于1.5 mL 離心管10 000 r/min 離心1 min，棄上清液，用無菌生理鹽水稀釋嗜水氣單胞菌至1.5×108CFU/mL。最后用LB 液體培養(yǎng)基將菌液稀釋100 倍，使培養(yǎng)基中嗜水氣單胞菌的濃度為1.5×106CFU/mL，備用。

1.2.1.2 最小抑菌濃度測定

以嗜水氣單胞菌為受試菌株，采用微量稀釋法測定復(fù)合碘溶液的最小抑菌濃度。試驗(yàn)設(shè)置2 組，第1 組試驗(yàn)藥物組，第2 組為對照藥物組。試驗(yàn)藥物組將配置好的改良復(fù)合碘溶液，加入每孔載有100 μL LB 液體培養(yǎng)基的96 孔板中，采用二倍稀釋法，使第1 至10 孔改良復(fù)合碘溶液的質(zhì)量濃度依次為 10 240，5 120，2 560，1 280，640，320，160，80，40 和 20 mg/L。1 至 10 孔，每孔加入 100 μL 濃度為1.5×106CFU/mL 嗜水氣單胞菌的培養(yǎng)基，此時(shí)第1 至10 孔的藥物質(zhì)量濃度依次為5 120，2 560，1 280，640，320，160，80，40，20 和 10 mg/L。第 11孔加入100 μL 菌液為陰性對照（加菌不加藥），第12 孔不加菌液為空白對照（不加菌不加藥），試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。對照藥物組以拜耳迪典復(fù)合碘溶液作為對照藥物，重復(fù)以上步驟，試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。放入恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)，觀察24 h 內(nèi)細(xì)菌生長情況，每個(gè)平行中無細(xì)菌生長對應(yīng)的最低濃度即為最小抑菌濃度（MIC）[4]。

1.2.2 改良復(fù)合碘溶液對草魚的急性毒性

根據(jù)《水質(zhì)物質(zhì)對淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法》（GB/T 13267—91），開展改良復(fù)合碘溶液對草魚的急性毒性試驗(yàn)[5]。試驗(yàn)設(shè)置2 組，第1 組為試驗(yàn)藥物組，第2 組為對照藥物組。先通過半靜水停食法預(yù)備試驗(yàn)浸泡藥液，觀察48 h 內(nèi)草魚的死亡情況，初步確定試驗(yàn)藥物濃度的大致范圍。再根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將試驗(yàn)藥物組以等對數(shù)間距法設(shè)置5 個(gè)濃度（60，85，120，170 和 240 mg/L）和 1 個(gè)空白對照組（不加藥物），試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行，每個(gè)平行放試驗(yàn)魚10 尾。試驗(yàn)水體積為50 L，每12 h 更換藥液1 次，更換量為100%。對照藥物組以拜耳迪典復(fù)合碘溶液作為對照藥物，重復(fù)上述步驟，試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。在試驗(yàn)過程中，連續(xù)觀察受試魚的行為、中毒癥狀和死亡效應(yīng)。如 5 min 內(nèi)多次刺激無反應(yīng)，即可判定試驗(yàn)魚死亡。記錄各試驗(yàn)組24，48 和96 h 時(shí)魚的存活情況[6]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，采用Karber 法，計(jì)算改良復(fù)合碘溶液在24，48 和96 h 對草魚的半致死濃度及95%置信限區(qū)間[1]。公式如下：

（1）lg LC50=Xk－I（∑P－0.5），

（2）S（lg LC50）=I（∑pq/n），

（3）95%置信限：lg－1[lg LC50±1.96 S（lg LC50）]。

式中：LC50——半致死濃度，mg/L；Xk——最大劑量對數(shù)；I——相鄰兩組劑量的對數(shù)差；∑P——各組死亡率總和，%；S（lg LC50）——標(biāo)準(zhǔn)誤差，mg/L；∑pq/n——各組死亡率×存活率/每組動物數(shù)的總和，mg/L。安全濃度計(jì)算參照Turabell 公式[7]。

SC=0.3×48 h LC50/（24 h LC50/48 h LC50）2

式中：SC——安全濃度，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合碘溶液對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果

復(fù)合碘溶液對嗜水氣單胞菌的抑菌效果（24 h）見表1。由表1 可見，改良復(fù)合碘溶液對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為320 mg/L，拜耳迪典復(fù)合碘溶液對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為2 560 mg/L，改良復(fù)合碘溶液對嗜水氣單胞菌的抑菌效果是拜耳迪典復(fù)合碘溶液的8 倍。在試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，在12 h 內(nèi)80 mg/L 改良復(fù)合碘溶液可以很好地抑制嗜水氣單胞菌繁殖生長，而拜耳迪典復(fù)合碘溶液則需要2 560 mg/L 才可以達(dá)到抑制作用，說明12 h 內(nèi)改良典復(fù)合碘溶液對嗜水氣單胞菌的抑制作用是拜耳迪典復(fù)合碘溶液的32 倍。

2.2 復(fù)合碘溶液對草魚的急性毒性

在復(fù)合碘溶液對草魚的急性毒性試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，對照組草魚健康且行動活潑，未出現(xiàn)異常現(xiàn)象；試驗(yàn)組不同程度地出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、行動緩慢、呼吸異常等中毒和死亡現(xiàn)象，且死亡率隨復(fù)合碘溶液濃度的升高而增加。復(fù)合碘溶液對草魚的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2 可見，改良復(fù)合碘溶液24，48和96 h 的LC50均低于拜耳迪典復(fù)合碘溶液。根據(jù)有毒物質(zhì)48 h 對魚類的毒性標(biāo)準(zhǔn)[7（]劇毒：LC50＜0.1 mg/L；高毒：0.1 mg/L＜LC50≤1.0 mg/L；中毒：1.0 mg/L＜LC50≤10 mg/L；低毒：LC50＞10 mg/L），改良和拜耳迪典復(fù)合碘溶液對草魚均屬于低毒性物質(zhì)。

3 討論

3.1 改良復(fù)合碘溶液的抑菌效果

復(fù)合碘溶液主要通過碘的鹵化作用，破壞菌體蛋白的生物學(xué)活性和菌體的生物膜結(jié)構(gòu)，從而殺滅病原菌[8]。嗜水氣單胞菌是淡水養(yǎng)殖的主要病原菌之一，感染后可引發(fā)魚類敗血癥[9]。本研究改良了復(fù)合碘溶液，并比較了其對嗜水氣單胞菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)改良復(fù)合碘溶液的體外抑菌效果是原來的8 倍，極大提高了復(fù)合碘溶液的抑菌作用，提高了藥效，降低用藥量和成本。高曉華[10]測定了聚維酮碘對6 株嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌對聚維酮碘的敏感度不太高，6 個(gè)菌株中最高的MIC 為1 024 mg/L，進(jìn)一步說明了本研究中改良復(fù)合碘溶液抑菌的高效性。除了嗜水氣單胞菌，改良復(fù)合碘溶液對氣單胞菌[11]、哈維氏弧菌[12]、銅綠假單胞菌[13]、魯氏耶爾森氏菌[10]等均具有不同程度的抑菌效果，可用于防治多種水產(chǎn)動物病害。

3.2 改良復(fù)合碘溶液對草魚的安全性評價(jià)

本研究發(fā)現(xiàn)，改良復(fù)合碘溶液對草魚的急性毒性作用和拜耳迪碘復(fù)合碘溶液相差不大，說明改良后復(fù)合碘溶液的抑菌性能有所改進(jìn)且并未損害其安全性。改良復(fù)合碘溶液對草魚的安全濃度為22.21 mg/L，遠(yuǎn)高于復(fù)合碘溶液的臨床推薦使用濃度0.10 mg/L，可在草魚養(yǎng)殖過程中放心使用。漁業(yè)養(yǎng)殖水體是一個(gè)復(fù)雜且完整的水生生態(tài)系統(tǒng)，多種微生物相互作用，共同維持水環(huán)境穩(wěn)定，有時(shí)很小的藥物劑量也可達(dá)到消毒水體和調(diào)控水質(zhì)的作用，這也是復(fù)合碘溶液臨床使用劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)室抑菌劑量的原因。