薛鴻雁,楊孟雨,楊 歡,董麗君,蔡霞清,趙澤民,王鮮忠

(西南大學動物醫(yī)學院,重慶 400715)

睪丸支持細胞(sertoli cells,SCs)為精子的生成提供了必需的營養(yǎng)和結構支持[1],睪丸支持細胞的數(shù)量決定了精子的數(shù)量[2]。脂質(zhì)代謝在睪丸支持細胞中發(fā)揮了重要作用[3]。SCs中氧化還原反應失衡時,可促使細胞內(nèi)脂質(zhì)和不飽和脂肪酸進行氧化反應形成大量的脂質(zhì)過氧化物[4]。熱應激是影響?zhàn)B豬產(chǎn)業(yè)的重要因素,對公豬生精功能影響很大[5-6]。越來越多的證據(jù)表明,熱應激促進了脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生[7-8],而過量脂質(zhì)過氧化物的生成會影響細胞的存活[9]。在脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生過程中,花生四烯酸脂氧合酶(arachidonic acid lipoxygenase, ALOX)發(fā)揮了重要作用[10]。ALOX廣泛存在于哺乳動物體內(nèi),哺乳動物體內(nèi)有包括花生四烯酸脂氧合酶15B(arachidonic acid lipoxygenase 15-lipoxygenase type B, ALOX15B)等6個類型,能夠?qū)毎谢ㄉ南┧岬榷嗖伙柡椭舅徇M行雙加氧反應, 產(chǎn)生8-HETE、15-HETE等脂質(zhì)過氧化物[11]。在脂質(zhì)過氧化物及其副產(chǎn)物MDA的共同作用下可誘發(fā)ROS的進一步聚集[12],而大量的ROS也加速了細胞凋亡。但ALOX15B在熱應激條件下是否誘發(fā)氧化應激并影響睪丸支持細胞凋亡尚不清楚。

c-Jun氨基末端激酶(jun amino terminal kinase, JNK)是MAPK家族的成員之一[13],也是參與細胞凋亡的重要因子[14],在熱應激條件下被激活[15]。抑制花生四烯酸脂氧合酶12可減少12-HETE的產(chǎn)生并抑制JNK依賴性凋亡[16]。p53作為腫瘤抑制因子,在睪丸組織高度表達并影響生精細胞的生存[17],在JNK信號通路下游受其調(diào)控進而影響凋亡[18]。然而,在熱應激條件下,ALOX15B通過JNK信號通路影響睪丸支持細胞凋亡的機制還需進一步探究。膽囊收縮素引起的肝臟炎癥過程中,抑制JNK信號通路降低了12-LOX的表達與12-HETE的含量[19]。但在JNK信號通路參與熱應激下ALOX15B調(diào)節(jié)支持細胞凋亡中是否存在反饋作用還需進一步驗證。

本試驗利用體外培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細胞的熱應激模型研究ALOX15B對氧化應激以及細胞凋亡的影響,及JNK在ALOX15B誘導細胞凋亡中的作用,進一步探尋JNK對ALOX15B和8-HETE、15-HETE與氧化應激是否存在反饋作用。深入理解熱應激下JNK在ALOX15B影響支持細胞凋亡調(diào)控中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 睪丸組織采自重慶北碚某豬場3周齡的三元仔豬,取睪丸組織置于含有5%青霉素與鏈霉素的PBS中,使用4 ℃冰盒進行運輸,在2 h之內(nèi)帶回實驗室,以便后續(xù)細胞的體外分離培養(yǎng)。

1.1.2 試驗試劑 胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、青鏈霉素(Gibco公司);磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)粉末(武漢賽維爾生物科技有限公司);Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司);Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);RIPA裂解液(Thermo Scientific公司);ECL化學發(fā)光液(Millipore公司);BCA試劑盒、活性氧檢測試劑盒、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(上海碧云天生物技術公司);β-actin一抗(北京博奧森生物技術公司);ALOX15B一抗、p53一抗(武漢三鷹生物技術公司);JNK一抗、磷酸化JNK一抗(Santa Cruz公司);豬8-HETE ELISA檢測試劑盒、豬15-HETE ELISA檢測試劑盒(上海凡科維生物公司);丙二醛檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司);SP600125(Sigma公司)。黃芩素(上海陶素生化科技有限公司);磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑(MCE公司)。其余試劑均為國產(chǎn)分析試劑。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)與處理 睪丸支持細胞的分離按照本實驗室前期方法進行操作[20],當細胞純度鑒定為90%,即可用于后續(xù)試驗。睪丸支持細胞置于含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中,在含有5%CO2的32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。把睪丸支持細胞接種于6孔板,培養(yǎng)48 h后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入1 mL的PBS洗滌后,用不同抑制劑或者轉(zhuǎn)染相應時間,在44 ℃恒溫培養(yǎng)箱中熱處理30 min后進行相關試驗。

1.2.2 ALOX15B的siRNA轉(zhuǎn)染 ALOX15B的兩對siRNA序列如表1所示。將分離后的睪丸支持細胞(1×106個·mL-1)接種于6孔板,培養(yǎng)24 h,當細胞密度達到60%～80%時即可進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h,去除完全培養(yǎng)基,加入無血清培養(yǎng)基使細胞處于饑餓狀態(tài)利于后續(xù)轉(zhuǎn)染。首先,按照每孔7 μL的siRNA與250 μL的Opiti-MEM培養(yǎng)基混合、每孔5 μL的siRNA和250 μL的Opiti-MEM培養(yǎng)基混合,在37 ℃下孵育5 min后,將含有siRNA和Lipofectamine 2000的Opiti-MEM培養(yǎng)基混合,在37 ℃下再繼續(xù)孵育20 min,然后分別將500 μL的混合液體加入到每個孔中。轉(zhuǎn)染8 h后更換培養(yǎng)基,然后繼續(xù)培養(yǎng)56 h后,在44 ℃恒溫培養(yǎng)箱中熱處理30 min(熱應激模型)后對相應物質(zhì)進行分析。

1.2.3 細胞凋亡的檢測 睪丸支持細胞進行相應處理后,用0.25%胰酶消化細胞2 min,300 g離心5 min,棄上清。然后用1 mL的Binding Buffer重懸細胞沉淀,300 g離心10 min。用1 mL的Binding Buffer緩沖液輕輕重懸細胞沉淀。然后,取100 μL以上液體(細胞數(shù)達1×106個·mL-1)混合5 μL的V-FITC,25 ℃孵育20 min,在檢測之前,樣本輕輕混合5 μL的PI溶液,25 ℃孵育5 min。再加入400 μL的PBS溶液充分混勻,用流式細胞儀1 h內(nèi)進行檢測。

1.2.4 蛋白表達的檢測 用含有1%磷酸酶抑制劑與1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取睪丸支持細胞的蛋白,用BCA試劑盒測定總的蛋白濃度,在8%～12%SDS-PAGE聚丙酰胺凝膠電泳后分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)移PVDF膜。用5%脫脂牛奶或5%牛血清白蛋白孵育膜2 h,然后用一抗在4 ℃孵育過夜。與山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗25 ℃孵育2 h后,使用ECL發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)中顯影。

1.2.5 ROS水平檢測 用96孔板培養(yǎng)細胞,當細胞按照試驗要求進行處理后,用冷的PBS溶液清洗細胞3次。按照制造商說明書進行操作,以ROS熒光探針:無血清培養(yǎng)基=1∶1 500的比例進行稀釋熒光探針,每個孔加入100 μL的含ROS熒光探針的培養(yǎng)基,在37 ℃避光孵育2 h。棄去原有培養(yǎng)基,加入100 μL新鮮的無血清培養(yǎng)基。用熒光酶標儀在激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm處測量熒光值。

1.2.6 MDA水平檢測 當細胞按照試驗要求進行處理后,用冷的PBS溶液清洗細胞3次。按照制造商說明書,每個培養(yǎng)皿加入100 μL的MDA裂解液,用超聲波破碎儀將細胞完全破碎。設置空白組、標準品組和試驗組。再向各個管子中加入1 mL的MDA工作液。在95 ℃水浴中煮沸40 min。3 000×g離心10 min,取上清200 μL加入96孔酶標管中,在酶標儀的532 nm處檢測吸光度。

1.2.7 脂質(zhì)過氧化物檢測 細胞(細胞計數(shù)為1×106個·mL-1)裂解于200 μL的PBS中,超聲破碎獲得上清液,7 260×g離心10 min。50 μL的標準樣品加入標準孔。10 μL的上清液溶于40 μL樣品稀釋液中。每孔用100 μL酶標試劑,37 ℃孵育60 min。每孔清洗5次后,加入顯色劑A、B各50 μL,37 ℃孵育15 min。每孔中加入50 μL的終止液,在15 min內(nèi)用酶標儀450 nm處檢測樣品的吸光度。

1.3 統(tǒng)計分析

運用GraphPad Prism和SPSS25進行統(tǒng)計分析。單因素方差分析用于分析3個組以上的數(shù)據(jù)。采用Tukey試驗多重比較各組間的差異。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±SEM”表示。P<0.05被認為是有統(tǒng)計學意義即差異顯著,P<0.01被認為是差異極顯著。

2 結 果

2.1 黃芩素對熱應激條件下脂質(zhì)過氧化物、氧化應激水平與細胞凋亡的影響

熱應激后睪丸支持細胞中8-HETE和15-HETE的水平上升,與對照組相比,分別升高了53.37%(P<0.01)、42.25%(P<0.01);與熱應激組相比,黃芩素與熱應激共同作用下8-HETE和15-HETE的水平分別下降了15.13%(P<0.01)、62.10%(P<0.01)(圖1A、1B)。從圖1C、1D可以看出,熱應激提高了睪丸支持細胞中MDA與ROS水平,與對照組相比,分別升高了32.32%(P<0.01)、422.82%(P<0.01);與熱應激組相比,在黃芩素與熱應激共同作用下MDA、ROS的水平分別下降了65.31%(P<0.01)、43.60%(P<0.01)。圖1E結果顯示,與對照組相比,熱應激組的細胞凋亡率顯著提高了475.77%(P<0.01); 黃芩素與熱應激共同作用于睪丸支持細胞后凋亡率發(fā)生了顯著的下降,相比于熱應激組,降低了318.97%(P<0.01)。

A.黃芩素對熱應激條件下8-HETE含量的影響;B.黃芩素對熱應激條件下15-HETE含量的影響;C.黃芩素對熱應激條件下MDA的影響;D.黃芩素對熱應激條件下ROS的影響;E.黃芩素對熱應激條件下睪丸支持細胞凋亡的影響。*. P<0.05;**. P<0.01;無標注表示P>0.05,下同A.Effects of baicalein on the content of 8-HETE under heat stress; B. Effects of baicalein on the content of 15-HETE under heat stress; C.Effect of baicalein on MDA under heat stress; D.Effects of baicalein on ROS under heat stress; E. Effects of baicalein on apoptosis of sertoli cells under heat stress. *. P<0.05;**. P<0.01; Unlabeled indicates no significant difference (P>0.05), the same as below圖1 黃芩素對熱應激條件下脂質(zhì)過氧化物、氧化應激水平與細胞凋亡的影響Fig.1 Effects of baicalein on lipid peroxides, oxidative stress levels and cell apoptosis under heat stress

2.2 黃芩素和 ALOX15B的siRNA對熱應激條件下JNK激活的影響

從圖2A可以看出,熱處理顯著提高了磷酸化JNK的蛋白水平。與對照組相比,磷酸化JNK提高了30.15%(P<0.01)。與單獨熱處理組相比,50 μM的黃芩素使熱處理條件下支持細胞中磷酸化JNK的蛋白水平降低了34.11%(P<0.01)。為了進一步驗證ALOX15B對熱處理條件下JNK激活的影響,通過siRNA抑制ALOX15B表達,圖2B結果發(fā)現(xiàn),ALOX15B的siRNA1和siRNA2也有類似的效果,與熱處理組相比,二者使磷酸化JNK的蛋白水平分別下降了59.72%(P<0.01)、33.46%(P<0.01)。

A.黃芩素對熱應激條件下支持細胞中JNK和磷酸化JNK的蛋白水平的影響;B.ALOX15B的siRNA對熱應激條件下支持細胞中JNK和磷酸化JNK的蛋白水平的影響A.Effects of baicalein on JNK and phosphorylated JNK protein levels in sertoli cells under heat stress; B.Effects of ALOX15B siRNA on levels of JNK and phosphorylated JNK proteins in sertoli cells under heat stress圖2 黃芩素與ALOX15B siRNA對熱應激條件下JNK激活的影響Fig.2 Effects of baicalein and ALOX15B siRNA on JNK activation under heat stress

2.3 JNK抑制劑SP600125對熱應激條件下JNK激活、p53和細胞凋亡的影響

從圖3A可以看出,與對照組相比,SP600125降低了磷酸化JNK的蛋白水平,降低了57.33%(P<0.01)。SP600125與熱應激的共同作用也減少了磷酸化JNK的蛋白水平,與單獨熱應激組相比,降低了46.72%(P<0.01);熱應激提高了p53的蛋白水平,與對照組相比,上升了89.16%(P<0.01)。與熱應激組相比,p53的蛋白水平在SP600125和熱應激的共同作用下,降低了16.97%(P<0.01)。從圖3B可以看出,與對照組相比,熱應激組的細胞的凋亡率顯著提高了475.77%(P<0.01)。與單獨熱應激組相比,SP600125和熱應激的共同作用下的細胞凋亡率顯著降低了133.17%(P<0.01)。

A.SP600125對熱應激條件下睪丸支持細胞中JNK、磷酸化JNK和p53蛋白水平的影響;B.SP600125對熱應激條件下睪丸支持細胞凋亡率的統(tǒng)計圖A.Effects of SP600125 on JNK, phosphorylated JNK and p53 protein levels in sertoli cells under heat stress; B.Statistical graph of the apoptosis rate of sertoli cells by SP600125 protein levels under heat stress圖3 SP600125對熱應激條件下睪丸支持細胞中JNK激活、p53和細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of SP600125 on JNK activation, p53 and apoptosis in Sertoli cells under heat stress

2.4 JNK抑制劑SP600125對熱應激條件下ALOX15B蛋白表達與脂質(zhì)過氧化物8-HETE、15-HETE的影響

從圖4A可以看出,熱應激提高了ALOX15B的蛋白水平,與對照組相比,上升了103.10%(P<0.01);SP600125與熱應激共同作用下睪丸支持細胞中ALOX15B的蛋白水平發(fā)生了顯著的下降,與熱應激組相比,ALOX15B的蛋白水平降低了45.89%(P<0.01)。從圖4B、4C可以看出,熱應激提高了細胞中脂質(zhì)過氧化物8-HETE、15-HETE的含量,與對照組相比,分別提升了37.89%(P<0.01)、13.86%(P<0.05);與熱應激組相比,SP600125和熱應激的共同作用下,ALOX15B的脂質(zhì)過氧化物8-HETE、15-HETE的含量分別降低了16.48%(P<0.01)、13.47%(P<0.05)。

A.SP600125對熱應激條件下睪丸支持細胞中ALOX15B蛋白水平的影響;B.SP600125對熱應激條件下睪丸支持細胞中8-HETE含量的影響;C.SP600125對熱應激條件下睪丸支持細胞中15-HETE含量的影響A.Effects of SP600125 on ALOX15B protein levels in sertoli cells under heat stress; B.Effects of SP600125 on the content of 8-HETE in sertoli cells under heat stress; C.Effects of SP600125 on the content of 15-HETE in sertoli cells under heat stress圖4 SP600125對熱應激條件下睪丸支持細胞中ALOX15B蛋白水平、8-HETE與15-HETE的影響Fig.4 Effects of SP600125 on ALOX15B protein levels, 8-HETE and 15-HETE in sertoli cells under heat stress

2.5 JNK抑制劑SP600125對熱應激條件下MDA、ROS的影響

從圖5A、5B可以看出,與熱應激組相比,SP600125和熱應激的共同作用下細胞中MDA和ROS都發(fā)生了顯著的下降,MDA水平降低了21.15%(P<0.01),ROS的水平降低了205.35%(P<0.01)。

A.SP600125對熱應激條件下睪丸支持細胞中MDA的影響;B.SP600125對熱應激條件下睪丸支持細胞中ROS的影響A.The effect of SP600125 on MDA in sertoli cells under heat stress; B.Effects of SP600125 on ROS in sertoli cells under heat stress圖5 SP600125對熱應激條件下睪丸支持細胞中MDA、ROS的影響Fig.5 Effects of SP600125 on MDA and ROS in sertoli cells under heat stress

3 討 論

ALOX15B是睪丸支持細胞中形成脂質(zhì)過氧化物的主要酶。豬ALOX15B基因與人和小鼠的ALOX15B基因高度同源,主要形成8-HETE、15-HETE等過氧化物[21-22]。ALOX15B產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物15-HETE可誘導K-562細胞發(fā)生氧化應激,進而引發(fā)細胞凋亡[23]。在本試驗中,熱應激增強了睪丸支持細胞中ALOX15B的表達,同時增加了8-HETE與15-HETE水平,進而誘發(fā)了氧化應激,促進了細胞的凋亡。在熱應激條件下,抑制睪丸支持細胞中ALOX15B的表達不僅降低了8-HETE、15-HETE、MDA和ROS的產(chǎn)生,而且減少了細胞凋亡。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是因為脂質(zhì)過氧化物一方面能夠促進ROS的進一步產(chǎn)生[24-25];另一方面它們的降解會導致產(chǎn)生大量的丙二醛,從而誘發(fā)氧化應激[26],進而加速細胞凋亡[27-29]。因此,ALOX15B通過其過氧化產(chǎn)物在細胞中加速氧化應激的發(fā)生,進而在熱應激誘導的細胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。

熱應激可激活小腸上皮細胞中的JNK信號通路[30]。本試驗結果證明,在熱應激條件下,睪丸支持細胞中的JNK磷酸化蛋白水平升高。Mitra等[31]的試驗結果證明,JNK信號通路參與了由雷公藤甲素誘導的小鼠睪丸支持細胞凋亡。有研究結果也表明,ALOX5、ALOX12、ALOX15及其產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物5-HETE、12-HETE、15-HETE均可激活JNK信號通路[32-33]。本試驗發(fā)現(xiàn),在熱應激條件下,通過黃芩素或ALOX15B的siRNA抑制ALOX15B的表達后,均可降低JNK磷酸化水平,并抑制細胞凋亡,這表明在熱應激條件下睪丸支持細胞中ALOX15B可調(diào)控JNK的激活,進而誘導細胞凋亡。p53是著名的腫瘤因子[34],多種不利因素誘導可引發(fā)p53水平增加[35-36],影響著細胞的存活[37],而磷酸化的JNK能夠激p53[38]。在PC-12細胞,JNK-p53參與了粘菌素誘導的細胞凋亡[39]。本試驗結果發(fā)現(xiàn),在熱應激條件下仔豬睪丸支持細胞中p53表達增加,JNK抑制劑則可以抑制熱應激條件下p53的表達和仔豬睪丸支持細胞的凋亡,這表明,在熱應激下,ALOX15B通過JNK-p53調(diào)節(jié)熱應激條件下支持細胞凋亡。

本試驗還發(fā)現(xiàn),當JNK抑制劑抑制熱應激誘導的凋亡時,JNK能夠反饋抑制ALOX15B的表達,降低8-HETE、15-HETE的含量,減少脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物丙二醛和細胞中ROS的水平,改變細胞的氧化應激水平,進而影響細胞凋亡,這表明,JNK可能通過反饋ALOX15B的表達負向調(diào)節(jié)細胞的凋亡,這與銀松素誘導脂多糖預處理后的白細胞凋亡中JNK抑制劑可抑制ALOX15的表達并減少白細胞凋亡的結果一致[40]。這暗示,在本試驗的熱應激條件下,JNK信號通路一方面能促進細胞凋亡,另一方面能通過負反饋作用調(diào)節(jié)細胞中的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),從而將凋亡控制在一定水平,以防止細胞的過度凋亡,本課題組前期研究的結果發(fā)現(xiàn),撤除熱應激后細胞的活力能逐漸恢復也證明了這一點。

4 結 論

熱應激條件下,ALOX15B的表達促進了睪丸支持細胞中脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,并增加MDA和ROS的產(chǎn)生,誘導細胞的氧化應激,進而激活JNK-p53通路并誘導細胞凋亡;JNK信號通路可反饋抑制ALOX15B的表達及脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,改變細胞的氧化應激狀態(tài),進而對細胞凋亡起到負反饋作用。