陶 潔,李本強,程靖華,石 迎,劉佩紅,劉惠莉*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室,上海 201106;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部區(qū)域特色畜禽品種疾病防控重點實驗室(部省共建),上海 201106)

我國肉鴿規(guī)?；B(yǎng)殖起步晚,上海市和廣東省分別于1976年和1980年引進國外肉鴿品種,自此由南向北、由沿海到內地迅速展開,逐步形成了中國的肉鴿養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)[1]。目前,我國肉鴿產(chǎn)業(yè)仍以傳統(tǒng)飼養(yǎng)模式為主,肉鴿生長和飼養(yǎng)管理研究數(shù)據(jù)缺乏[2]。近年來,隨著肉鴿消費需求量的增加,肉鴿產(chǎn)業(yè)技術研究逐步受到重視。

眾所周知,腸道微生物群落具有生物多樣性功能,與健康和疾病息息相關,除了協(xié)助宿主營養(yǎng)吸收和能量攝取、調控新陳代謝,還可促進腸道發(fā)育,參與免疫調控以增強抵抗力等[3]。影響動物腸道菌群變化的誘因很多,包括飼養(yǎng)管理水平、飼料營養(yǎng)配比、疾病以及動物機體發(fā)育程度等[4],特別是乳鴿,在斷乳后因各種外界因素引起菌群失調,導致腹瀉[5]。

目前,宏基因組(metagenome)技術是微生物多樣性研究的主要手段,不僅能挖掘新基因及其代謝產(chǎn)物等,而且在酶的發(fā)現(xiàn)、新藥開發(fā)、抗生素耐藥組等方面具有廣闊應用前景[6]。近年來,隨著抗生素的大量使用,抗生素耐藥問題已成為全球公共衛(wèi)生面臨的嚴峻威脅[7]。因此,本研究擬利用宏基因組技術對上海某肉鴿養(yǎng)殖場青年鴿和產(chǎn)鴿糞便樣品進行微生物菌群差異分析,豐富肉鴿腸道微生物多樣性數(shù)據(jù),為疾病防控提供參考。同時,深入挖掘分析肉鴿體內抗生素耐藥基因譜,以期發(fā)揮預警功效,助力肉鴿健康養(yǎng)殖。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品來源

從上海某肉鴿養(yǎng)殖場分別采集青年鴿(2～5月齡)和產(chǎn)鴿(5月齡以上樣品)糞便樣品各20份,分別命名為RP組和LP組。RP組包含2個測序樣品:JD-1和JD-2。LP組包含2個測序樣品:JD-3和JD-4。每個測序樣品中包含10份來自不同棚舍的鴿糞樣。

1.2 高通量測序與功能預測分析

基于Illumina NovaSeq/HiSeq高通量測序平臺,采用全基因組鳥槍法(Whole Genome Shotgun, WGS)策略,利用OMEGA Mag-Bind Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA)提取樣品基因組DNA,進一步利用Illumina TruSeq Nano DNA LT Library Preparation Kit構建文庫,并進行雙端(Paired-end,PE)測序。對原始數(shù)據(jù)進行篩查和過濾,用Cutadapt(v1.2.1)[8]軟件去除3′端潛在接頭序列,以及小于50 bp和含有模糊堿基的序列;利用minimap2軟件比對質控后的有效序列與宿主序列,舍棄與宿主有匹配的序列;最后利用Kraken2和Kaiju兩種方法進行物種注釋[9]。采用MetaGeneMark軟件識別重疊群序列(contigs)中的開放閱讀框, 并預測編碼區(qū)域,獲得對應基因和蛋白序列文件[10],按相似度95%,對齊區(qū)域覆蓋度90%進行去冗余,獲得非冗余的蛋白序列集合,并與NCBI的nr數(shù)據(jù)庫進行比對, 設置靈敏度參數(shù)為5.7,lca-mode 為4[11]。將上述過濾處理后的蛋白序列集與常用蛋白數(shù)據(jù)庫比對,進行KEGG、EggNOG和CAZy注釋分析[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用R軟件進行主坐標分析(PCoA)、Venn分析、PLS-DA和LEfSe分析[13]。

2 結 果

2.1 測序數(shù)據(jù)整理和評估

對4個肉鴿糞便樣品進行宏基因鳥槍法測序,得到309 617 334個原始序列共46.75 GB的原始數(shù)據(jù)。質控分析顯示,這4個樣品的有效序列比例均高于98.5%,N50長度為1 698～2 321 bp(表1)。

表1 具體測序信息Table 1 Sequencing informations

2.2 腸道菌群組成結構特征

基于OTUs分類結果,共注釋到細菌10門27綱57目117科323屬1 053種。如圖1A,兩組樣品中相對豐度最高的3個菌門均為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌(Proteobacteria)和放線菌(Actinobacteria)。其中厚壁菌(LP 40.34%,RP 57.49%)和變形菌(LP 54.63%,RP 34.68%)相對豐度之和超過90%,是肉鴿糞便樣品中的優(yōu)勢菌。放線菌為第3豐度菌門,在青年鴿和產(chǎn)鴿樣品中分布比例相似(LP 5.02%,RP 7.82%)。

圖1 青年鴿和產(chǎn)鴿腸道菌群在門水平(A)和屬水平(B)的相對豐度Fig.1 Relative abundance of intestinal microbiota of young pigeons (RP) and older pigeons (LP) at phylum (A) and genus (B) levels

在屬水平上,LP組相對豐度最高的5個菌屬是:埃希氏桿菌屬(48.19%)、腸球菌屬(13.00%)、乳桿菌屬(8.31%)、氣球菌屬(9.55%)、葡萄球菌屬(4.55%);RP組相對豐度最高的5個菌屬是:腸球菌屬(26.56%)、埃希氏桿菌屬(22.11%)、乳桿菌屬(12.14%)、氣球菌屬(10.27%)、嗜冷桿菌屬(8.92%)(圖1B)。

2.3 肉鴿腸道菌群差異物種

在屬水平分析青年鴿和產(chǎn)鴿體內差異物種,Venn圖顯示,LP和RP組共有700種相同菌種,137和216種差異菌種(圖2A)。PLS-DA分析顯示,RP和LP組具有分離現(xiàn)象(圖2B)?；贛EGAN的多樣本分類等級樹圖顯示(圖2C),腸球菌屬(Enterococcus)中,僅3個物種是LP組占高比例,其余均為RP組占高比例,其中解糖腸球菌(Enterococcussaccharolyticus)幾乎為RP組特有。RP組中雙歧桿菌(Bifidobacterium)、棒狀桿菌(Corynebacteriun)、嗜冷桿菌(Psychrobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)含量顯著高于LP組。而LP組金黃色葡萄球菌屬(Staphyloccus)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、庫特氏菌屬(Kurthia)和埃希氏菌屬(Escherichia)含量顯著高于RP組。

A. 韋恩圖; B. PLS-DA分析; C. MEGAN分類等級樹A. Venn diagram; B. PLS-DA analysis; C. MEGAN classification rank tree圖2 青年鴿和產(chǎn)鴿體內差異物種分析Fig.2 Species difference analysis of gut microbiota in young pigeons and older pigeons

2.4 肉鴿腸道微生物宏基因組的代謝特征

eggNOG分析顯示未知功能基因數(shù)量最高,已知功能基因中復制、重組和修復相關基因占比最高(圖3A)。KEGG分析顯示(圖3B),代謝組(Metabolism)豐度最高,其中碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)和氨基酸代謝(Amino acid metabolism)是最豐富的功能門類,分別占總Reads的16.87%和9.97%。比對碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(CAZy),共預測有118 642種CAZy,在六大類酶分子中糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases, GHs)和糖苷轉移酶(Glycosyl Transferases, GTs)占比最高,分別為45.17%和32.88%(圖3C)。進一步利用LEfSe對青年鴿和產(chǎn)鴿腸道微生物菌群功能差異分析發(fā)現(xiàn),差異表達基因主要富集于5個KEGG通路(圖3D):生物合成(Biosynthesis)代謝通路、硫辛酸代謝(Lipod acid metabolism)通路、氧化磷酸化(Oxidative phosphorlation)通路和p53信號通路和阿米巴病通路。

A. eggNOG分析; B. KEGG分析; C. LEfSe分析A. eggnog analysis; B. KEGG analysis; C. LEfSe analysis圖3 肉鴿腸道微生物菌群代謝功能差異分析Fig.3 Metabolic function differential analysis of gut microbiota in pigeons

2.5 抗生素耐藥基因挖掘與分析

挖掘肉鴿體內抗生素耐藥基因(Antibiotic resistance genes, ARGs)種類和組成,結果顯示,青年鴿和產(chǎn)鴿體內ARGs組成均一度和相似度較高,共11大類198種ARGs,占比順序為:多重耐藥類>大環(huán)內脂類>磺胺類>β-內酰胺類>四環(huán)素類>萬古霉素類>喹諾酮類>氨基糖苷類>elfamycin>氯霉素類>其他ARGs。其中多重耐藥類ARGs占40%以上(圖4A)。

A. ARGs分類和占比分析; B. ARGs預測分析A. ARGs classification and proportion analysis; B. ARGs prediction 圖4 肉鴿抗生素耐藥基因譜分析Fig.4 Analysis of antibiotic resistance gene profile in pigeons

青年鴿體內rpoC、Isa、YybT、gshF、gyrB、ileS、A1067、Erm、rpsA等ARGs豐富最高,產(chǎn)鴿體內mshA、gyrB、A1067、tetA、gyrA、fusA、YybT等ARGs豐富最高(圖4B),主要源自大環(huán)內酯類、多重耐藥類、喹諾酮類、氨基糖苷類和磺胺類抗生素。

3 討 論

腸道菌群構成腸道微生態(tài)系統(tǒng),通過與宿主間相互作用維持相對穩(wěn)定狀態(tài),與機體健康狀態(tài)密切相關[14]。但目前肉鴿腸道微生物菌群方面研究甚少,阻礙了肉鴿產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

本研究利用宏基因組學技術對肉鴿糞便中微生物菌群多樣性進行高通量分析,明確肉鴿腸道優(yōu)勢菌門為厚壁菌、變形菌和放線菌。這與肉雞腸道菌群分布類似,肉雞十二指腸、空腸和回腸部位厚壁菌門占比最高(>60%)[15],符合肉鴿具有強大消化吸收功能的特性。本研究通過分析青年鴿和產(chǎn)鴿糞便中微生物多樣性差異,發(fā)現(xiàn)兩者之間存在一定差異,青年鴿體內有益菌如雙歧桿菌含量顯著高于產(chǎn)鴿,而產(chǎn)鴿體內埃希氏菌屬含量顯著高于青年鴿。值得注意的是,青年鴿糞便中多種腸球菌含量都高于產(chǎn)鴿。腸球菌屬于乳酸菌(LAB),益生腸球菌可有效抑制腸道病原菌,維護宿主腸道健康[16]。目前,屎腸球菌和糞腸球菌是最常用的益生腸球菌,屬于飼料級微生物菌種[17]。本研究中青年鴿中屎腸球菌含量顯著高于產(chǎn)鴿,提示隨著日齡增加,產(chǎn)鴿體內有益菌群下降,病原菌數(shù)量增加。

抗生素耐藥基因遞增是各大養(yǎng)殖群體中普遍存在的難題[18],導致臨床用藥效果不理想,嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)健康發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)肉鴿體內ARGs多樣性豐富,多重耐藥類ARGs呈現(xiàn)高流行率。除了高豐度的β-內酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類等ARGs,肉鴿體內萬古霉素和利福平等耐藥基因流行率也較高。已報道結核分枝桿菌rpoA、rpoB、rpoC和rpoD位點突變可影響金黃色葡萄球菌等對利福平的敏感性[19]。而poA、rpoB和rpoC在青年鴿和產(chǎn)鴿體內具有顯著的高流行率。肉鴿是一種在短期內即上市售賣的禽類產(chǎn)品,抗生素問題尤需注意,過度使用抗生素不僅造成抗生素殘留,而且會導致抗生素耐藥性問題。因此,在肉鴿養(yǎng)殖管理中,不僅要加強驅蟲和消毒,保持環(huán)境衛(wèi)生,而且特別要重視用藥管理。

4 結 論

本研究系統(tǒng)分析了不同日齡肉鴿的腸道菌群差異和抗生素耐藥基因,可為鴿場生物安全防控和飼料營養(yǎng)改善等提供數(shù)據(jù)參考。