郭靜，蔣建國(guó)，程愛民，張占軍

揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院，揚(yáng)州市農(nóng)產(chǎn)品智能測(cè)控與清潔生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心（揚(yáng)州 225009）

橄欖油作為地中海飲食中脂肪的主要來源，其中豐富的脂肪酸（如油酸、亞油酸、亞麻酸等）及微量伴隨物（如角鯊烯、生育酚和多酚類物質(zhì)等）使其在預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤、抗氧化等方面有著獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)與保健功效[1-2]。然而，脂肪酸易發(fā)生自氧化及光氧化，這導(dǎo)致橄欖油在儲(chǔ)存過程中容易產(chǎn)生不良風(fēng)味，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受損[3]。有研究表明，維生素C（vitamin C，VC）對(duì)乳液體系中的油脂具有抗氧化作用[4]，并且與其他抗氧化劑復(fù)配能夠表現(xiàn)出較好的協(xié)同抗氧化作用[5-6]。維生素C又稱抗壞血酸，是一種水溶性維生素，主要由一個(gè)五元內(nèi)酯環(huán)及其側(cè)鏈構(gòu)成[7]。VC能夠有效清除體內(nèi)活性氧[8-9]，在食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛用作穩(wěn)定劑和抗氧化劑[10-11]。然而，VC對(duì)環(huán)境極為敏感，極易發(fā)生氧化降解[7,9]，這導(dǎo)致其在相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用受到限制。

微乳液具有外觀透明、熱力學(xué)穩(wěn)定、可自發(fā)形成等特點(diǎn)[12]，在藥物、活性物傳遞等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。課題組前期以生物相容性較高的大豆卵磷脂和非離子表面活性劑司盤80復(fù)配作為表面活性劑，制備以橄欖油為油相的食品級(jí)微乳體系[13]。試驗(yàn)從體系應(yīng)用角度出發(fā)，制備可負(fù)載VC的橄欖油微乳液，充分發(fā)揮反相微乳體系對(duì)VC的包埋作用。同時(shí)，將橄欖油與天然抗氧化劑VC相結(jié)合，利用VC的抗氧化特性，提高體系的抗氧化性能和橄欖油的穩(wěn)定性。試驗(yàn)旨在對(duì)體系的相行為、結(jié)構(gòu)及抗氧化性能進(jìn)行分析，為VC等水溶性活性物的包埋及在食用油體系中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考，對(duì)于新型乳液制品的開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆卵磷脂（純度＞90%，上海Aladin生化科技股份有限公司）；2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，純度≥98%，Sigma-Aldrich有限公司）；溴化鉀、氯化鉀、L-抗壞血酸（VC）、無水乙醇、過硫酸鉀（K2S2O8）：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；司盤80（Span80）、橄欖油：均為化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

Vortex-Genie2渦漩混合儀（美國(guó)Scientific Industries公司）；DDS-11A數(shù)顯電導(dǎo)率儀（上海雷磁新涇儀器有限公司）；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀（德國(guó)Bruker公司）；DK-S22電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Barnstead Lab Tower EDI 15超純水儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 擬三元相圖的繪制

將大豆卵磷脂、Span80和無水乙醇按照質(zhì)量比3︰1︰2在具塞管中混合均勻，作為表面活性劑相。將表面活性劑相與油相（橄欖油）按照質(zhì)量比分別為1︰9，2︰8，3︰7，4︰6，5︰5，6︰4，7︰3，8︰2，9︰1和10︰0進(jìn)行混合，制得表面活性劑/油混合物體系。在25±0.1 ℃水浴條件下，向混合物體系中逐滴加入水相溶液（純水或VC水溶液），當(dāng)體系剛好由澄清、透明轉(zhuǎn)變至渾濁時(shí)，以該臨界點(diǎn)作為體系的相轉(zhuǎn)變點(diǎn)，并記錄所加水相的質(zhì)量。計(jì)算體系中水相所占質(zhì)量百分比，以確定相轉(zhuǎn)變點(diǎn)在擬三元相圖中的位置。

1.3.2 空白及載VC橄欖油微乳體系的制備

以橄欖油為油相，大豆卵磷脂、Span80及無水乙醇按質(zhì)量比3︰1︰2混合作為表面活性劑相，將表面活性劑相與油相按照固定質(zhì)量比9︰1進(jìn)行混合，加入純水或VC水溶液，制備空白及載VC橄欖油微乳體系。

1.3.3 電導(dǎo)率的測(cè)定

以不同濃度VC水溶液（0，0.001，0.010，0.050和0.500 mol/L）為水相，在25±0.1 ℃、表面活性劑相與橄欖油質(zhì)量比9︰1條件下，制備不同水相含量的大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄欖油/VC/水微乳液。采用電導(dǎo)率儀，以0.01 mol/L氯化鉀溶液進(jìn)行校準(zhǔn)，在25±0.1 ℃下測(cè)定體系的電導(dǎo)率，并繪制不同VC濃度時(shí)電導(dǎo)率與水相含量的關(guān)系圖。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析

分別以純水及0.5和1.0 mol/L的VC水溶液作為水相，固定表面活性劑相與橄欖油質(zhì)量比9︰1，制備空白及載VC微乳液（Φ=15%）。采用溴化鉀壓片法，對(duì)VC固體、微乳液樣品等進(jìn)行紅外光譜分析，掃描波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.5 抗氧化能力分析

采用ABTS法測(cè)定樣品的自由基清除能力，即抗氧化能力。參照文獻(xiàn)[14-15]方法，并稍作改進(jìn)：配制含7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L K2S2O8的水溶液，并將其避光冷藏至少12 h，以使兩者充分反應(yīng)生成ABTS+·自由基。將ABTS+·自由基溶液以無水乙醇稀釋至吸光度為0.70±0.01（754 nm）。

以濃度0，0.001和0.010 mol/L的VC水溶液為水相，制備水相含量分別為0，3%，9%和15%的大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄欖油/VC/水微乳體系，并采用無水乙醇將體系分別稀釋10倍（V/V）。以蒸餾水為溶劑，將水相（0.001 mol/L VC/H2O溶液）稀釋至與微乳液中水相含量（3%，9%和15%）相當(dāng)，使水溶液中VC濃度分別為3×10-5，9×10-5和1.5×10-4mol/L。在10 mL試管中依次加入100 μL樣品溶液、2 mL稀釋后的ABTS+·自由基溶液，振蕩使其混合均勻，并于室溫避光靜置20 min，測(cè)定其在波長(zhǎng)754 nm處的吸光度。每組試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次以上，按照式（1）計(jì)算樣品對(duì)ABTS+·自由基的清除率。

式中：A1和A2為樣品溶液和空白溶液分別與ABTS+·自由基溶液反應(yīng)后所測(cè)得的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用AutoCAD 2007軟件繪制擬三元相圖，并對(duì)相圖中微乳單相區(qū)的面積進(jìn)行計(jì)算（以單相區(qū)面積占相圖總面積的百分比表示）[13]。采用Origin 8.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 水相中VC濃度對(duì)微乳體系相行為的影響

圖1為以不同濃度VC水溶液為水相時(shí)，大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄欖油/VC/水的擬三元體系相圖（25℃）。隨著水相中VC濃度的增加（依次為0，0.001，0.010，0.100和0.500 mol/L），體系微乳有效區(qū)域面積未發(fā)生明顯變化（微乳單相區(qū)面積依次為15.6%，14.8%，15.1%，15.2%和15.3%）。VC分子由于C-2、C-3位羥基pKa值差異[16]（分別為11.4和4.2）的影響，在水溶液中表現(xiàn)為一種有機(jī)弱酸。水相溶液中VC濃度的增加，對(duì)體系界面膜的曲率和彈性影響較小，導(dǎo)致對(duì)微乳體系相行為影響不大。彭春玉等[17]在研究反相微乳液的導(dǎo)電性能時(shí)也發(fā)現(xiàn)，隨著水相中氫離子濃度的增加，離子型反相微乳體系（CTAB/正己醇/正己烷/水）相當(dāng)穩(wěn)定，且溶水量并未減少。

圖1 橄欖油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水?dāng)M三元體系相圖（陰影部分為微乳液?jiǎn)蜗鄥^(qū)）

由圖1可見：在以不同濃度VC水溶液作為水相情況下，當(dāng)表面活性劑相（大豆卵磷脂/Span80/無水乙醇質(zhì)量比3︰1︰2）與油相（橄欖油）質(zhì)量比9︰1時(shí)，體系表面活性劑含量相對(duì)較高，對(duì)水相的增溶量均達(dá)到最高。因此，選擇最長(zhǎng)稀釋線，即固定表面活性劑相與油相質(zhì)量比為9︰1，將兩相混合后加入VC水溶液進(jìn)行水相稀釋，制備載VC橄欖油微乳液，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)體系結(jié)構(gòu)等進(jìn)行后續(xù)表征。

2.2 水相中VC濃度對(duì)體系電導(dǎo)率的影響

電導(dǎo)率的測(cè)定是區(qū)分微乳液結(jié)構(gòu)類型的經(jīng)典方法[18-19]。分別以不同濃度VC水溶液（0，0.001，0.010，0.050和0.500 mol/L）為水相，制備橄欖油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水體系，考察體系電導(dǎo)率（σ）隨水相含量（Φ）的變化情況，結(jié)果如圖2所示。隨著水相含量的增加，體系電導(dǎo)率總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，Φ為0時(shí)，表面活性劑、助表面活性劑形成反相膠束，由于反相膠束中離子對(duì)極性較小[17]及表面活性劑中雜質(zhì)的影響，體系電導(dǎo)率值較低。Φ超過4%時(shí)，體系電導(dǎo)率急劇上升，體系出現(xiàn)電導(dǎo)滲濾現(xiàn)象[20]。這主要是由于加入水相溶液后，液滴腫脹且相互之間碰撞的幾率增加，液滴融合并形成導(dǎo)電通道[17,20]，因此，體系電導(dǎo)率迅速增加。此時(shí)，體系為W/O型結(jié)構(gòu)。Φ達(dá)到18%時(shí)，體系電導(dǎo)率隨水相含量的增加上升緩慢，并逐漸趨于最大（Φ=20%）。此時(shí)，導(dǎo)電通道進(jìn)一步擴(kuò)大、連接，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[21-22]，體系由W/O型轉(zhuǎn)變?yōu)殡p連續(xù)型結(jié)構(gòu)。然而，進(jìn)一步增加水相含量，體系開始出現(xiàn)渾濁，電導(dǎo)率下降。由于微乳體系中水增溶量超過臨界值，表面活性劑界面膜被破壞，油、水分層，阻礙水相液滴間的相互作用及電荷傳遞[23]，因此，電導(dǎo)率下降。

圖2 橄欖油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水體系電導(dǎo)率隨水相含量（Φ）的變化

由圖2可見：水相中VC濃度增加至0.5 mol/L時(shí)，體系電導(dǎo)率值整體偏低，但水相含量低于20%時(shí)，體系依舊能保持澄清、透明，表明其穩(wěn)定性未受影響。VC為具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的多羥基化合物，增加水相中VC的濃度會(huì)使過量的VC分子游離于油水界面膜上，且分子間通過氫鍵形成聚集體，影響離子的穿透[17]，體系因而出現(xiàn)電導(dǎo)率相對(duì)偏低的現(xiàn)象。

2.3 橄欖油微乳體系紅外光譜分析

將表面活性劑相（大豆卵磷脂/Span80/乙醇質(zhì)量比3︰1︰2）與橄欖油按質(zhì)量比9︰1進(jìn)行混合，制備表面活性劑/油混合物體系（Concentrate）。分別以純水及較高濃度VC水溶液（0.5和1.0 mol/L）為水相，制備空白及載VC的W/O型微乳液（Φ=15%）。對(duì)Concentrate及各微乳液進(jìn)行紅外光譜分析，以考察VC加入對(duì)體系結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖3所示。對(duì)比圖3（A和B）可以看出，VC經(jīng)微乳體系包裹后，即使不斷增加水相中VC濃度，VC自身特征峰（C＝C伸縮振動(dòng)[24-25]為1 672 cm-1；參與氫鍵的內(nèi)酯C＝O伸縮振動(dòng)[24,26]為1 755 cm-1；樣品中因含有水分而引起的O—H伸縮振動(dòng)[24]為3 528，3 411，3 316和3 217 cm-1）均消失。另外，與空白微乳液相比，載VC微乳液在紅外光譜的峰形和數(shù)量上未發(fā)生明顯變化，且未出現(xiàn)新的特征峰。由此證明，VC被包裹于反相微乳液的親水內(nèi)核中。

圖3 VC固體（A）、Concentrate體系（大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄欖油）及橄欖油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水微乳體系（B）紅外光譜圖

由圖3（B）可見：Concentrate體系在3 258 cm-1附近出現(xiàn)寬而鈍的羥基締合峰[25,27]，這主要是由于（助）表面活性劑分子（Span80、大豆卵磷脂、乙醇）間通過氫鍵發(fā)生締合。在Concentrate體系中加入水相溶液后，無論以純水還是以不同濃度VC水溶液（0.5和1.0 mol/L）為水相，體系在3 258 cm-1處的吸收峰均向高波數(shù)方向移動(dòng)。這主要是由于體系中加入水相溶液（Φ=15%），形成W/O型微乳液，水分子被束縛于膠核內(nèi)部，導(dǎo)致出現(xiàn)峰形尖銳的游離羥基峰[25,28]。另外，隨著水相中VC濃度的增加，水相中VC分子之間、VC與水分子之間及VC與表面活性劑親水頭基之間通過氫鍵逐漸形成鏈狀締合體，鏈端羥基中O—H鍵強(qiáng)度變?nèi)鮗27]，導(dǎo)致O—H伸縮振動(dòng)峰逐漸向低波數(shù)方向移動(dòng)（3 639，3 634和3 630 cm-1），由此也反映VC分子被包裹于橄欖油微乳液的水相內(nèi)核中。

2.4 橄欖油微乳體系抗氧化性能分析

以0，0.001和0.010 mol/L VC水溶液為水相，測(cè)定不同水相含量（Φ=0，3%，9%和15%）時(shí)，橄欖油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水體系對(duì)ABTS+·自由基的清除率，結(jié)果如圖4和圖5所示。由圖4可見，Concentrate體系（大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄欖油）具有一定的自由基清除能力，這主要是由于橄欖油中含有的多酚、生育酚等物質(zhì)及表面活性劑卵磷脂均具有一定抗氧化性[29-30]。另外，純VC水溶液對(duì)自由基清除率與其中VC濃度明顯呈正相關(guān)。

圖4 Concentrate體系（大豆卵磷脂/Span80/乙醇/橄欖油）及不同濃度VC純水溶液（3×10-5，9×10-5和1.5×10-4 mol/L）對(duì)ABTS+·自由基的清除率

圖5 橄欖油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/VC/水微乳體系對(duì)ABTS+·自由基的清除率隨水相含量（Φ）的變化

由圖5可以看出，以純水為水相時(shí)，隨著水相含量的增加，空白微乳液（橄欖油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/H2O）對(duì)ABTS+·自由基清除率逐漸下降，這主要是由于隨著水相含量的增加，空白微乳體系中大豆卵磷脂、橄欖油的含量相對(duì)減少，導(dǎo)致體系對(duì)自由基的清除能力逐漸下降。水相溶液中加入極少量VC（0.001 mol/L）時(shí)，隨著微乳液中水相含量的增加，體系對(duì)ABTS+·自由基的清除率仍明顯下降。但水相含量較高（Φ=9%和15%）時(shí)，載VC反相微乳體系的抗氧化能力則稍有提高。這表明水相溶液中加入少量VC（0.001 mol/L），能夠在一定程度上發(fā)揮VC的抗氧化作用，提高微乳體系的抗氧化能力。但在該條件下，微乳體系的抗氧化能力仍主要受體系中大豆卵磷脂、橄欖油含量的影響。水相中VC濃度增加至0.01 mol/L時(shí)，各水相含量下微乳體系對(duì)自由基的清除率均明顯增加，且自由基清除率與水相含量之間明顯呈正相關(guān)。由此可見，水相中VC濃度達(dá)到0.01 mol/L時(shí)，水相含量的高低對(duì)反相微乳液體系的抗氧化能力具有顯著的影響，此時(shí)，組分VC在體系中的含量成為影響微乳體系抗氧化能力的關(guān)鍵因素。

3 結(jié)論

以橄欖油為油相、VC水溶液為水相，制備載VC橄欖油微乳體系。采用擬三元相圖法考察VC的加入對(duì)橄欖油/大豆卵磷脂/Span80/乙醇/水微乳體系相行為的影響。結(jié)果表明，水相中VC濃度的改變對(duì)微乳有效區(qū)域面積無明顯影響。通過電導(dǎo)率、傅里葉紅外光譜的測(cè)定對(duì)體系結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水相含量低于18%時(shí)，體系為W/O型微乳液，VC分子被包裹于W/O型微乳液的水相內(nèi)核中。增加水相中VC濃度，微乳體系穩(wěn)定性未受影響，但VC濃度較高（0.5 mol/L）時(shí)，大量VC分子游離于表面活性劑界面膜，導(dǎo)致體系電導(dǎo)率整體下降。以ABTS+·自由基清除率為指標(biāo)，對(duì)體系的抗氧化能力進(jìn)行分析。結(jié)果表明，橄欖油微乳體系水相中加入較低濃度VC（0.001 mol/L）時(shí)，體系抗氧化能力主要受體系中大豆卵磷脂、橄欖油含量的影響。水相溶液中VC濃度增加至0.01 mol/L時(shí)，組分VC在體系中含量的高低成為影響體系抗氧化能力的關(guān)鍵因素。試驗(yàn)將VC與橄欖油微乳體系相結(jié)合，通過對(duì)VC的包裹，提高體系的抗氧化能力，為進(jìn)一步研究抗氧化劑VC對(duì)微乳體系中橄欖油的穩(wěn)定作用機(jī)制等提供依據(jù)，并為研發(fā)新型乳液制品提供理論指導(dǎo)。