虢夢佳，楊曼婷，扶番，王鶴，李志鴻

1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院（宜昌 443002）；2.湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心（宜昌 443002）

隨著人們生活水平逐漸提高，溫飽已不再是人們擔(dān)憂的問題，而由于飲食過量或飲食結(jié)構(gòu)不合理，導(dǎo)致的高尿酸血癥已引起人們高度關(guān)注。高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是繼高血壓、高血脂、高血糖“三高”之后出現(xiàn)的“第四高”[1]。在正常嘌呤飲食下，男性空腹血清尿酸水平高于420 μmol/L，女性高于360 μmol/L出現(xiàn)高尿酸血癥[2]。人體長期處于高尿酸水平時(shí)可產(chǎn)生尿酸鹽結(jié)晶沉積，引發(fā)炎癥并導(dǎo)致周圍組織的損傷，即引發(fā)痛風(fēng)[3]，高尿酸血癥還可導(dǎo)致慢性腎病、胰島素抵抗、腎結(jié)石等疾病[4]。

降尿酸的化學(xué)治療藥物主要有別嘌醇、非布司他、丙磺舒、苯溴馬隆等，分別通過抑制黃嘌呤氧化酶活性，減少尿酸生成，抑制腎近曲小管對(duì)尿酸的重吸收，加速尿酸排泄等方式降低血漿中尿酸濃度[5-8]。然而這些藥物均具有不良反應(yīng)，如出現(xiàn)惡心、腹瀉、皮疹、肝功能異常，甚至引發(fā)肝衰竭[3]，因此，尋求更加高效低毒的治療高尿酸血癥的藥物和方法具有重要意義。

飲食是導(dǎo)致高尿酸血癥的重要因素，同時(shí)飲食也是防治高尿酸血癥的重要手段，食療具有中醫(yī)防病、治病、康復(fù)、養(yǎng)生的顯著特色[9]。補(bǔ)虛扶正、瀉實(shí)祛邪的飲食養(yǎng)生之道對(duì)防治高尿酸血癥效果明顯。基于中藥治療高尿酸血癥具有多靶點(diǎn)的優(yōu)勢[10]，飲食調(diào)節(jié)是輔助防治高尿酸血癥的重要方式。茶是人們?nèi)粘Ｉ畹闹匾嬍?，有研究表明茶是高尿酸血癥的保護(hù)因素，適當(dāng)飲茶能保持尿量、促進(jìn)尿酸排泄[11-12]。前期研究表明海棠茶具有良好的降尿酸作用[13]，因此，試驗(yàn)以茶為載體，優(yōu)化海棠磚茶的制作工藝，為開發(fā)新型降尿酸功能性食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海棠茶為湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp.）Rehder][14]的嫩葉，木瓜為貼梗海棠[Chaenomeles speciose（Sweet）Nakai][15]的近成熟果實(shí)（采于湖北省長陽土家族自治縣，由三峽大學(xué)王玉兵教授鑒定）；鐵皮石斛（樂清市潤峰石斛有限公司）；羅漢果（桂林興安縣鼎康食品有限責(zé)任公司）；葛粉[源興堂（安徽）健康產(chǎn)業(yè)有限公司]；根皮苷對(duì)照品[純度98%，由天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)）提供]；甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5900紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；TDZ4-WS低速離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）；YM-ZDXBJ-4全自動(dòng)小茶餅機(jī)立式全自動(dòng)小茶餅緊壓設(shè)備（安溪縣毅銘茶葉機(jī)械有限公司）；CT-C熱風(fēng)循環(huán)烘箱（常州市皖江干燥設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取11.5 mg干燥至恒重的根皮苷對(duì)照品，加50%甲醇定容于10 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為1.15 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 mL對(duì)照品溶液于10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，以50%甲醇為空白，用紫外分光光度計(jì)在波長287 nm處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，根皮苷質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=30.16X+0.078（R2=0.999 9）。

1.3.3 供試品溶液的制備

取1塊（4 g/塊）海棠磚茶，加200 mL開水沖泡5 min，取出磚茶，取15 mL茶汁加入離心管中，用離心機(jī)在2 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min。冷卻至室溫后取10 mL上清液，加甲醇定容至20 mL，即得。

1.3.4 磚茶制作步驟

稱取20 g葛粉，加入40 mL冷水溶解，煮至熟漿。稱取450 g湖北海棠、180 g皺皮木瓜、300 g鐵皮石斛、50 g羅漢果，配成1 000 g磚茶原料，趁熱加入葛粉熟漿?？焖贁嚢?，攪拌過程中加入適量冷水，快速攪拌至均勻，蒸制后取出壓制成塊，每塊5 g，烘干。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

選擇原料顆粒大小、加水量、蒸制時(shí)間、壓力、烘干溫度、烘干時(shí)間6個(gè)可能影響成型磚茶的黃酮溶出效果的因素，以黃酮溶出度為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定合適的因素和適宜的范圍進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.51 原料顆粒大小

將各原料粉碎過篩，規(guī)定過0.250 mm篩的為細(xì)粉，過0.250 mm篩而未過0.425 mm篩的為粗粉，過0.425 mm篩而未過2.00 mm篩的為極粗粉。分別將海棠茶、木瓜、鐵皮石斛、羅漢果的細(xì)粉、粗粉及極粗粉原料混合均勻，選擇葛粉作為黏合劑需用細(xì)粉，加入10 mL水，蒸制5 min，用4 mPa的壓力壓制成磚茶，在100 ℃下烘干2 h。烘干成型后使用1.3.3的方法制得供試品溶液后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，分別計(jì)算得到磚茶開水沖泡5 min總黃酮溶出量。

1.3.52 加水量

原料顆粒大小為粗粉，分別加入4，6，8，10和12 mL水，蒸制5 min，用4 mPa的壓力壓制成磚茶，在100 ℃烘干2 h。烘干成型后使用1.3.3的方法制得供試品溶液后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，分別計(jì)算得到磚茶開水沖泡5 min總黃酮溶出量。

1.3.53 蒸制時(shí)間

原料顆粒大小為粗粉，加入10 mL水，分別蒸制3，5和7 min，用4 mPa的壓力壓制成磚茶，在100 ℃烘干2 h。烘干成型后使用1.3.3的方法制得供試品溶液后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，分別計(jì)算得到磚茶開水沖泡5 min總黃酮溶出量。

1.3.54 壓力

原料顆粒大小為粗粉，加入10 mL水，蒸制5 min，分別用2，4和6 mPa的壓力壓制成磚茶，在100 ℃烘干2 h。烘干成型后使用1.3.3的方法制得供試品溶液后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，分別計(jì)算得到磚茶開水沖泡5 min總黃酮溶出量。

1.3.55 烘干溫度

原料顆粒大小為粗粉，加入10 mL水，蒸制5 min，用4 mPa的壓力壓制成磚茶，分別在80，100和120 ℃烘干2 h。烘干成型后使用1.3.3的方法制得供試品溶液后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，分別計(jì)算得到磚茶開水沖泡5 min總黃酮溶出量。

1.3.56 烘干時(shí)間

原料顆粒大小為粗粉，加入10 mL水，蒸制5 min，用4 mPa的壓力壓制成磚茶，分別在100 ℃烘干1，2和4 h。烘干成型后使用1.3.3的方法制得供試品溶液后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，分別計(jì)算得到磚茶開水沖泡5 min總黃酮溶出量。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，研究各因素對(duì)成型和總黃酮溶出度的影響。使用分析軟件Design Expert 10.0.1進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理以總黃酮溶出度為響應(yīng)值，進(jìn)一步研究A、B、C對(duì)總黃酮溶出度的影響，從而確定制作磚茶的最佳條件。試驗(yàn)因素與水平的選取見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 原料顆粒大小對(duì)總黃酮溶出量的影響

由圖1可知：在加水量、蒸制時(shí)間、壓力、烘干溫度、烘干時(shí)間保持不變，僅改變?cè)项w粒大小的條件下，總黃酮溶出量在13.67～41.08 mg/100 g。原料顆粒大小減小時(shí)，總黃酮溶出量增大，但繼續(xù)減小原料顆粒大小，總黃酮溶出量減少，這是因?yàn)轭w粒過小時(shí)磚茶中的縫隙過小，粘結(jié)緊密，水分不易進(jìn)入。原料顆粒為0.180 mm的極細(xì)粉時(shí)，沖泡過程中出現(xiàn)漂浮的粉末，影響口感，不利于飲用。因此，選擇原料顆粒大小為粗粉較為合適。

圖1 原料顆粒大小對(duì)總黃酮溶出量的影響

2.1.2 加水量對(duì)總黃酮溶出度的影響

由圖2可知：在原料顆粒大小、蒸制時(shí)間、壓力、烘干溫度、烘干時(shí)間保持不變，僅改變加水量的條件下，總黃酮溶出量在13.67～37.65 mg/100 g。隨著加水量的增加，總黃酮溶出量先無明顯變化，再顯著降低，最后顯著升高再緩慢下降。因?yàn)殡S著加水量的增加，壓制后的磚茶黏性增大，浸泡過程中水分進(jìn)入原料內(nèi)部的量減少，時(shí)間延長，進(jìn)而導(dǎo)致總黃酮溶出量減少。但當(dāng)加水量達(dá)到一定值時(shí)，在原料攪拌階段黃酮就已有部分溶出，烘干階段使黃酮附著于磚茶的表面，因此增加總黃酮溶出量。因此，選擇加水量10 mL較為合適。

圖2 加水量對(duì)總黃酮溶出度的影響

2.1.3 蒸制時(shí)間對(duì)總黃酮溶出量的影響

由圖3可知：在原料顆粒大小、加水量、壓力、烘干溫度、烘干時(shí)間保持不變，僅改變蒸制時(shí)間的條件下，總黃酮溶出量在41.52～45.83 mg/100 g，且影響并不顯著。綜合考慮總黃酮溶出量及時(shí)間因素，選擇蒸制時(shí)間3 min較為合適。

圖3 蒸制時(shí)間對(duì)總黃酮溶出量的影響

2.1.4 壓力對(duì)總黃酮溶出量的影響

由圖4可知：在原料顆粒大小、加水量、蒸制時(shí)間、烘干溫度、烘干時(shí)間保持不變，僅改變壓力的條件下，總黃酮溶出量在35.89～50.58 mg/100 g，且影響不顯著。隨著壓力的增加，磚茶中的縫隙減少，水分不易進(jìn)入。綜合考慮總黃酮溶出量及磚茶成型情況，選擇壓力2 mPa較為合適。

圖4 壓力對(duì)總黃酮溶出量的影響

2.1.5 烘干溫度對(duì)總黃酮溶出量的影響

由圖5可知：在原料顆粒大小、加水量、蒸制時(shí)間、壓力、烘干時(shí)間保持不變，僅改變烘干溫度的條件下，總黃酮溶出量在33.56～50.58 mg/100 g，且影響不顯著。因此，選擇烘干溫度100 ℃較為合適。

圖5 烘干溫度對(duì)總黃酮溶出量的影響

2.1.6 烘干時(shí)間對(duì)總黃酮溶出量的影響

由圖6可知：在原料顆粒大小、加水量、蒸制時(shí)間、壓力、烘干時(shí)間保持不變，僅改變烘干溫度的條件下，總黃酮溶出量在33.12～50.58 mg/100 g。烘干時(shí)間過短，磚茶中水分較大，影響保存，同時(shí)影響黃酮成分的溶出，烘干時(shí)間過長可能使黃酮成分變化。因此，選取烘干時(shí)間2 h較為合適。

圖6 烘干時(shí)間對(duì)總黃酮溶出量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

采用Design Expert 10.0.1軟件中的Box-Behnken程序進(jìn)行分析，共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。將表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)過二次多元擬合處理，得到總黃酮溶出量與原料顆粒大小、加水量、烘干時(shí)間3個(gè)因素的回歸方程：總黃酮含量=2.04+0.29A+0.12B-0.074C+0.064AB-0.051AC+0.13BC-0.053A2-0.17B2-0.49C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.390 5＞0.05），說明模型合理，模型決定系數(shù)R2為0.972 4，說明該模型能較好反映磚茶總黃酮溶出量與原料顆粒大小、加水量、烘干時(shí)間的關(guān)系。其中：顆粒大?。ˋ）、加水量（B）、加水量的二次項(xiàng)（B2）、烘干時(shí)間的二次項(xiàng)（C2）對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01）；加水量和烘干時(shí)間的交互項(xiàng)（BC）對(duì)應(yīng)響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05）。各影響因素對(duì)響應(yīng)值的影響性排序?yàn)轭w粒大?。ˋ）＞加水量（B）＞烘干時(shí)間（C）。

表3 回歸模型方差分析

圖7分別顯示3組以總黃酮溶出量為響應(yīng)值的趨勢圖。等高線圖可直觀反映各因素交互作用對(duì)總黃酮溶出量的影響，等高線越接近于橢圓，該因素對(duì)總黃酮溶出量影響越大，其中BC交互坡度最大，等高線趨于橢圓，AB次之，AC較圓，與回歸方差分析結(jié)果相符合，即交互作用BC＞AB＞AC。

圖7 響應(yīng)面交互作用影響

2.2.2 最佳條件工藝參數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)回歸模型分析，得到磚茶制作的最佳工藝條件：原料顆粒大小0.251 mm、加水量12.38 mL、烘干時(shí)間2.367 h。此條件下總黃酮溶出量預(yù)測值為2.327 mg?？紤]實(shí)際操作條件，將各預(yù)測參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣{(diào)整，確定原料顆粒大小0.250 mm、原料與水的料液比5∶13（g/mL）、烘干時(shí)間2.4 h、蒸制時(shí)間3 min、壓力2 mPa、烘干溫度100 ℃為最佳工藝條件。在此工藝參數(shù)下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，由表4得出最終3次試驗(yàn)測得的總黃酮溶出量平均值為55.26 mg/100 g。結(jié)果表明，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響能通過回歸模型得到良好的反映，響應(yīng)面法對(duì)磚茶制作條件的優(yōu)化穩(wěn)定可行。

表4 平行試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

以海棠茶、木瓜、鐵皮石斛、羅漢果、葛粉為原料研制一種具有抗尿酸作用的功能性養(yǎng)生茶，為通過飲食降尿酸提供新選擇，該養(yǎng)生茶具有方便、安全、有效特點(diǎn)，同時(shí)具有降糖、降脂作用[16-17]，適應(yīng)新時(shí)代食療養(yǎng)生的新趨勢需求[18]。

在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，以響應(yīng)面優(yōu)化磚茶的制作工藝，對(duì)磚茶中總黃酮溶出量的二次回歸模型進(jìn)行設(shè)計(jì)分析。結(jié)果表明，模型擬合程度高，試驗(yàn)誤差小。確定磚茶制作的最佳工藝條件：原料顆粒大小0.251 mm、原料與水的料液比5∶13（g/mL）、烘干時(shí)間為2.4 h、蒸制時(shí)間3 min、壓力2 mPa、烘干溫度100 ℃。該制作工藝適應(yīng)規(guī)模化大生產(chǎn)需求。

湖北海棠嫩葉作為茶葉飲用歷史悠久，習(xí)稱海棠茶、花紅茶或三皮罐，是湖北西部地區(qū)夏季廣為飲用的涼茶[19]。湖北海棠其主要化學(xué)成分為黃酮類成分，而黃酮類成分中以根皮苷含量較高[20]，根皮苷有著良好的安全性，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[21]，既是一種天然甜味劑，又對(duì)糖尿病有良好的預(yù)防作用和治療作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)其黃酮類成分對(duì)黃嘌呤氧化酶具有抑制活性[13]，從而減少尿酸生成，同時(shí)具有利尿作用，有利于尿酸排泄，通過多途徑發(fā)揮降尿酸作用，并且不會(huì)造成腎損傷[23]。為滿足功能食品形、色、香、味、效多方面的需求，試驗(yàn)依據(jù)中藥君臣佐使的組方原則，以湖北海棠為主進(jìn)行復(fù)配，充分利用不同藥食兩用資源的不同降尿酸機(jī)制，協(xié)同增效，達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。既保證產(chǎn)品具有良好的降尿酸效果，同時(shí)保證產(chǎn)品具有良好的口感、觀感及便利程度，以提高大眾接受度。

木瓜是第一批列入我國藥食同源名單的既是藥品又是食品的食藥物質(zhì)，具有獨(dú)特的藥用價(jià)值和保健功能，民間有“杏一益、梨二益、木瓜百益”之說。主要含三萜類、黃酮類等成分及維生素，是極好的綠色保健食品[24]。又有研究表明木瓜水提物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用較強(qiáng)，其可能的機(jī)制為抗炎、抑制黃嘌呤氧化酶活性以影響尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)等方式調(diào)節(jié)尿酸代謝[25]。木瓜海棠茶同用，既能增強(qiáng)降尿酸作用，也能調(diào)節(jié)口感。鐵皮石斛具有降尿酸功能[26]，且石斛多糖黏性強(qiáng)，有助于磚茶制備成型。羅漢果中含羅漢果皂苷Ⅴ，可作為難溶性物質(zhì)的載體，對(duì)海棠茶、木瓜中的三萜起到增溶作用[27]，且羅漢果中豐富的甜苷是天然甜味劑，安全、穩(wěn)定、甜度高、易溶于水[28]。加入羅漢果能有效提升產(chǎn)品品質(zhì)，有助于產(chǎn)品更好發(fā)揮作用?？紤]功能食品的多重需求，磚茶優(yōu)選海棠茶、木瓜、鐵皮石斛、羅漢果組方而成，并以葛粉為主要黏合劑，既有利于成型，又有助于強(qiáng)化功能。

黃酮類化合物是許多藥食同源中藥的有效成分之一[29]，具有降尿酸、抗痛風(fēng)作用[30]。因此以磚茶中總黃酮溶出量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面優(yōu)化法海棠磚茶制作工藝條件。獲得最佳的磚茶制作工藝參數(shù)，為降尿酸功能性海棠磚茶的批量生產(chǎn)提供依據(jù)。