李 強(qiáng) 李 濤 魏榮興 余傳剛

隨著社會(huì)科技和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，犬在人類社會(huì)中發(fā)揮著越來越大的作用。它們既可以作為人類忠實(shí)的伴侶輔助完成其日常的工作如陪伴、導(dǎo)盲、心理疾病治療等，也可以作為警犬在巡邏、追蹤、搜毒、搜爆等社會(huì)公共安全領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。然而，由于傳統(tǒng)上犬的品種是根據(jù)它們?cè)谌祟惢顒?dòng)中的作用、身體表型和歷史記錄進(jìn)行分組的，所以不同品種的犬，性情和工作性能也不一樣，尤其是在目前社會(huì)上涉犬案件的增多以及國(guó)家對(duì)于本土優(yōu)秀犬種的種質(zhì)資源保存與開發(fā)日益重視，因此開展犬品種鑒定工作迫在眉睫。

傳統(tǒng)的犬品種鑒定方法是根據(jù)系譜或者體型外貌特征來判斷，然而建立犬的系譜是一項(xiàng)漫長(zhǎng)煩瑣的工作，當(dāng)前市場(chǎng)上許多養(yǎng)犬商家并沒有意識(shí)和能力建立完善的系譜，導(dǎo)致品種鑒定不精準(zhǔn)，系譜參考意義不大。此外，由于犬的品種眾多，體型外貌特征復(fù)雜且有許多相似之處，想要依此來鑒定犬品種頗有難度。而DNA 分子標(biāo)記技術(shù)近年來發(fā)展迅速，被廣泛運(yùn)用于各物種的品種鑒定的研究，相較于傳統(tǒng)鑒定方法其特點(diǎn)在于可以在各個(gè)發(fā)育階段、各個(gè)組織類別進(jìn)行鑒定，不受環(huán)境與基因表達(dá)與否的影響，分子標(biāo)記數(shù)量多，遺傳穩(wěn)定，具有較高的多態(tài)性，分布在有機(jī)體的整個(gè)基因組。同時(shí)不同犬品種之間的基因差異性和同一犬品種之間的基因同質(zhì)性，以及犬基因種間差異大于種內(nèi)差異，使得可以通過對(duì)犬品種的基因差異性和保守性的研究為犬的品種鑒定工作提供良好的條件，因此可以用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)來進(jìn)行犬品種鑒定以獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

一、DNA 分子標(biāo)記技術(shù)研究進(jìn)展

DNA 分子標(biāo)記是指以生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA 的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是基因組特定區(qū)域的一段脫氧核糖核酸序列，這些序列根據(jù)孟德爾遺傳定律，在群體中遺傳生物體的基因特征。DNA 分子標(biāo)記被用于識(shí)別種群內(nèi)部和種群之間的基因變異，以及繪制許多物種的遺傳圖譜，在物種分類中占據(jù)主導(dǎo)地位，經(jīng)過不斷發(fā)展完善，已在各個(gè)生物體中大規(guī)模運(yùn)用于遺傳育種、疾病篩查、品種鑒定、法醫(yī)鑒定等。根據(jù)DNA 檢測(cè)方法的不同，主要分為三代：第一代以分子雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)（RFLP）和數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性（VNTR）；第二代是以PCR 為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，主要包含隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR)；第三代主要是以高通量測(cè)序和DNA 芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，主要包含單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和DNA 條形碼技術(shù)(DNA barcode)，這些DNA 分子標(biāo)記技術(shù)都各有優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，目前最常用的分子標(biāo)記主要是基于PCR 技術(shù)的SSR，以及基于DNA 測(cè)序的SNP。根據(jù)各個(gè)DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)及運(yùn)用，以下主要介紹SSR 和SNP 在犬品種鑒定中的運(yùn)用。

二、SSR 和SNP 在犬品種鑒定中運(yùn)用

（一）SSR 在犬品種鑒定中運(yùn)用

SSR 即微衛(wèi)星DNA，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），廣泛分布于真核生物基因組內(nèi)，突變率高，數(shù)量多，是一類由2～6個(gè)堿基組成的多次重復(fù)的序列，重復(fù)次數(shù)達(dá)10～60 次，使得片段長(zhǎng)度變化極大，導(dǎo)致SSR 多態(tài)性極其豐富，而SSR 極高的多態(tài)性能夠?yàn)槿贩N鑒定提供更多的遺傳多樣性信息量，同時(shí)在傳遞過程中遵循孟德爾遺傳規(guī)律，并呈共顯性遺傳，還具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用到犬品種鑒定、遺傳病篩查、繁殖育種、案件偵破等領(lǐng)域。

目前已有多人利用微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行犬品種鑒定。Irion 等嘗試?yán)梅植荚谌蚪M中的100 個(gè)常染色體微衛(wèi)星標(biāo)記來檢測(cè)美國(guó)養(yǎng)犬俱樂部(AKC)28 個(gè)品種內(nèi)和品種間的基因型變異，根據(jù)由此產(chǎn)生的品種特異性等位基因頻率來闡明系統(tǒng)發(fā)育和品種之間的遺傳距離，進(jìn)行品種鑒定。Koskinen 等研究探討了基于10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的聚類方法在鑒定5 個(gè)品種包括貝德林頓、德國(guó)牧羊犬、金毛尋回犬、威爾士柯基犬、臘腸犬共250 頭家犬個(gè)體起源品種中的有效性，該研究表明，基于微衛(wèi)星DNA 和現(xiàn)代聚類方法可以以非常高的準(zhǔn)確率確定犬的品種。Parker 等通過對(duì)代表85 個(gè)品種的414 頭純種犬的96 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型，研究發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星基因型可以被用來正確地分配99%的犬的品種，同時(shí)結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析能將幾個(gè)具有古代起源的品種與其他具有現(xiàn)代歐洲起源的品種區(qū)分開來。薛政通過利用已公布的65 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)采用位點(diǎn)頻率法、貝葉斯法和遺傳距離法對(duì)39 個(gè)市場(chǎng)上常見寵物犬品種進(jìn)行鑒定，貝葉斯方法的準(zhǔn)確率最高，達(dá)到 97.91%，同時(shí)還計(jì)算出當(dāng)檢測(cè)位點(diǎn)從1個(gè)增加到25 個(gè)時(shí)，品種鑒定準(zhǔn)確率迅速上升，之后增加檢測(cè)位點(diǎn)，準(zhǔn)確率基本穩(wěn)定，隨后采樣本地12 個(gè)品種共15 頭犬來進(jìn)行驗(yàn)證，品種全部鑒定成功。韓宏曉等通過利用犬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的微衛(wèi)星位點(diǎn)信息從中篩選出60 多個(gè)位點(diǎn)采用貝葉斯法、位點(diǎn)頻率法和遺傳距離法等方法對(duì)26 種常見寵物犬品種共128 頭個(gè)體進(jìn)行品種鑒定，發(fā)現(xiàn)篩選出的微衛(wèi)星遺傳位點(diǎn)可用于犬的品種鑒定，并通過后期從寵物醫(yī)院選取的10 個(gè)品種合計(jì)50 頭犬進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示所篩選得到的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記位點(diǎn)可初步用于常見寵物犬種的鑒定。

（二）SNP 在犬品種鑒定中運(yùn)用

SNP 主要是指基因組DNA 序列上單個(gè)堿基的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等多種形式，廣泛分布于整個(gè)基因組，具有數(shù)量多，多態(tài)性高，突變率低，遺傳穩(wěn)定，易于實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，尤其是隨著下一代測(cè)序技術(shù)的不斷優(yōu)化，SNP 正變得越來越容易開發(fā)，成本也越來越低，因此SNP 作為分子標(biāo)記已經(jīng)有了應(yīng)用于犬的品種鑒定中的基礎(chǔ)。

Brouillette 等于2002 年在比格犬、杜賓犬和蘇格蘭約四十余頭犬中對(duì)四種SNP 進(jìn)行基因分型，并與哈代溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡下的預(yù)期基因型頻率進(jìn)行比較，結(jié)果表明SNP 位點(diǎn)可以在犬中用來作為品種鑒定的分子標(biāo)記。Lindblad 等在2005 年通過鳥槍法測(cè)序，從11個(gè)犬種與參考序列的部分序列比較獲得了250 萬個(gè)SNP 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)拳師犬的品種內(nèi)SNP 差異性遠(yuǎn)小于與其他犬品種的差異性，表明了SNP 具有作為犬品種鑒定的分子標(biāo)記的基礎(chǔ)。劉毓文等在2017 年基于犬類22 萬個(gè)DNA SNP 標(biāo)記信息，開發(fā)了一種遺傳算法，用以通過犬類 DNA SNP 數(shù)據(jù)來判斷犬的品系組成，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，準(zhǔn)確鑒定出來了犬的品種。羅晗等在通過篩選已公開的SNP 數(shù)據(jù)，開發(fā)一款專門為家犬品種分類制作的、低成本的、高效的SNP 芯片，只需要約1 萬或者5 萬個(gè)SNP 位點(diǎn)即可達(dá)成97%及最高可達(dá)99%以上正確率。

三、展望

犬一直不斷地深入到人類的生活中，是人類生活中不可或缺的一分子，這就要求加強(qiáng)對(duì)犬的管理。通過DNA分子標(biāo)記技術(shù)，我們可以從犬的分子水平對(duì)犬進(jìn)行品種鑒定、繁殖育種、法醫(yī)鑒定等，讓犬更好地為人類服務(wù)。而SSR 和SNP 是目前最常用也是最有發(fā)展?jié)摿Φ腄NA 分子標(biāo)記，其開發(fā)檢測(cè)技術(shù)仍要朝著高效、便捷和低廉的方向發(fā)展，以期將來為犬的品種鑒定工作發(fā)揮更大的作用。