劉秀娟，張梅梅

（準(zhǔn)格爾旗農(nóng)牧局，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 010300）

1 前言

1.1 病原

寄生蟲病對(duì)全球公共衛(wèi)生有著深遠(yuǎn)影響。據(jù)世界衛(wèi)生組織2020 年全球衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)報(bào)告，傳染病和寄生蟲病是導(dǎo)致動(dòng)物死亡的主要原因之一[1]。目前寄生蟲主要分為體內(nèi)寄生蟲和體外寄生蟲，而體外寄生蟲也是動(dòng)物最易感的原蟲之一[2]。巴貝斯蟲病是一種全球性的人畜共患病，對(duì)人和動(dòng)物的健康及養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益有重大影響[3]。該寄生蟲主要寄生在生物的紅細(xì)胞內(nèi)，并且有高度的宿主特異性。迄今為止，已鑒定出100多類不同的物種均可被感染，并且這種寄生蟲的宿主有向人類發(fā)展的趨勢(shì)。有報(bào)道稱，英國(guó)有一例患者因感染該寄生蟲導(dǎo)致死亡[4]。研究表明，在過(guò)去20～30 年中，該寄生蟲感染牛的病例越來(lái)越多，且成為制約肉牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個(gè)主要原因[5]。

巴貝斯蟲體多為環(huán)形、梨形等，主要寄生在紅細(xì)胞中，會(huì)侵襲宿主血液循環(huán)系統(tǒng)，因而巴貝斯蟲病成為肉牛養(yǎng)殖中一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。該疾病雖然死亡率較低，但會(huì)造成動(dòng)物慢性消耗，使肉牛逐漸消瘦，養(yǎng)殖成本不斷增加[6]。受感染的牛會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、厭食、血紅蛋白尿（俗稱“紅水”）及貧血等癥狀，少數(shù)病例還會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和死亡現(xiàn)象[7]。

目前巴貝斯蟲的主要傳播媒介為硬蜱，該寄生蟲寄生于硬蜱體內(nèi)，硬蜱再寄生于其他動(dòng)物體表通過(guò)吸血將巴貝斯蟲卵傳播到宿主血液中，使宿主感染巴貝斯蟲。懷孕的母畜感染該寄生蟲后還會(huì)經(jīng)卵巢垂直傳播給胎兒，造成胎兒感染[8]。垂直傳播這一現(xiàn)象增加了人類對(duì)巴貝斯蟲病的控制難度，因?yàn)榧词雇ㄟ^(guò)治療將巴貝斯蟲從宿主身上清除，但藥物無(wú)法通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入宿主胎兒體內(nèi)，使得胎兒感染后無(wú)法治愈[9]。

1.2 診斷方法

目前，確定巴貝斯蟲感染的手段包括顯微鏡觀察?？蓪⒋龣z血液制成血涂片，然后對(duì)染色的血液涂片進(jìn)行顯微鏡檢查，觀察紅細(xì)胞內(nèi)是否含有梨狀體樣的寄生蟲。ELISA 試驗(yàn)也可對(duì)巴貝斯蟲進(jìn)行檢測(cè)鑒定[10]。此外，寄生蟲體中的18S 小亞單位（SSU）核糖體RNA 基因的PCR 擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)也是一種用于寄生蟲檢測(cè)和物種鑒定的高靈敏度分子生物學(xué)方法[11]。該基因位于梨形體發(fā)育信息可變區(qū)，許多已發(fā)表的序列均有助于進(jìn)行物種分類[12]。PCR 技術(shù)被證實(shí)比血清學(xué)檢測(cè)更靈敏，比起僅可提供被檢動(dòng)物先前是否被病原感染的抗體反應(yīng)，PCR 技術(shù)還可以直接檢測(cè)帶病動(dòng)物體內(nèi)的病原體[13]。

在英國(guó)，傳統(tǒng)上側(cè)重于確定風(fēng)險(xiǎn)地理區(qū)域后進(jìn)行放牧管理，然后將小牛引入這些風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，以增強(qiáng)免疫力，從而促進(jìn)當(dāng)?shù)氐胤讲〉姆€(wěn)定性[14]。這種方法依賴于公認(rèn)的“牛巴貝斯蟲病反年齡抗性現(xiàn)象”，即1 歲以下的小牛對(duì)該病表現(xiàn)出自然(先天性)免疫[15]，感染的特點(diǎn)往往是低水平的寄生蟲血癥，可以持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間。目前，英國(guó)牛的巴貝斯蟲病主要根據(jù)臨床癥狀以及農(nóng)場(chǎng)和動(dòng)物發(fā)病史進(jìn)行診斷[16]。

2 病例診斷情況

2.1 病史調(diào)查

2022 年9 月，在內(nèi)蒙古鄂爾多斯市準(zhǔn)格爾旗某規(guī)?；笮腿馀ｐB(yǎng)殖場(chǎng)，獸醫(yī)人員例行巡查牛只狀態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)某圈舍有14 頭牛精神沉郁、厭食且觸診體溫較高。截至發(fā)病前，該場(chǎng)肉牛存欄量為450 頭，其中患病牛14 頭，發(fā)病率為3.11%。該養(yǎng)殖場(chǎng)有1 棟隔離圈舍，5棟飼養(yǎng)圈舍，配備有自動(dòng)飼養(yǎng)設(shè)備及清糞設(shè)備。圈舍整體干凈整潔，之前未出現(xiàn)過(guò)有相關(guān)癥狀的病例。

2.2 臨床癥狀

患病牛為進(jìn)口安格斯肉牛，體溫均高于40.2 ℃，對(duì)外界刺激較為不敏感，仔細(xì)觀察體表發(fā)現(xiàn)有蜱蟲附著。經(jīng)過(guò)臨床癥狀觀察疑似肉牛感染血液寄生蟲病，具體發(fā)病原因需要對(duì)血液進(jìn)行詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2.3 實(shí)驗(yàn)室診斷

將患病牛只進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，頸靜脈采血2 mL，依次標(biāo)記為1～14 號(hào)并將血樣送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理及檢測(cè)。

2.3.1 血涂片檢測(cè)。在采集的14 管患病牛的血液樣品中加入0.2 mL 抗凝劑。分別吸取10 μL 抗凝血滴加到載玻片上，用另一塊載玻片從一邊輕輕地勻速推到另一邊，使血液均勻地覆蓋在載玻片上并在室溫下晾干。在晾干的血液涂片上滴加2 滴甲醇溶液進(jìn)行固定，接著在血涂片上滴加100 μL 吉姆薩染色A 液靜置20 min，用等量pH 值為7.2 的磷酸鹽緩沖B 液與吉姆薩染色A 液混合靜置20 min 后用蒸餾水沖洗，再用濾紙吸干血涂片，置于光學(xué)顯微鏡上；滴加1 滴香柏油后用1 000×油鏡觀察血涂片。

由圖1 鏡下觀察到，紅細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，胞內(nèi)有多個(gè)環(huán)形、梨形等形狀不一的蟲體，單一的蟲體整體長(zhǎng)度約為紅細(xì)胞半徑的四分之一，多數(shù)位于紅細(xì)胞邊緣，有的紅細(xì)胞中有3 個(gè)以上的蟲體。血涂片鏡檢疑似牛巴貝斯蟲病，但具體的診斷還需進(jìn)一步檢測(cè)。

圖1 血涂片鏡檢

2.3.2 ELISA 檢測(cè)。用抗凝血分離后的血漿進(jìn)行牛巴貝斯蟲ELISA 檢測(cè)。吸取每個(gè)待測(cè)樣品中10 μL 血漿到酶標(biāo)檢測(cè)板孔中，同時(shí)加設(shè)陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照（每個(gè)對(duì)照設(shè)2 個(gè)重復(fù)防止出現(xiàn)誤差）封板，37 ℃放置20 min； 棄去廢液用PBS 洗滌3～5 次，再加入100 μL HRP 酶標(biāo)抗體封板，37 ℃放置20 min；再棄去廢液用PBS 洗滌3～5 次，加入反應(yīng)液（A 液、B液各50 μL）于37 ℃放置15 min；最后加入50 μL終止液 （需在10 min 內(nèi)檢測(cè)），置于酶標(biāo)儀內(nèi)在OD420進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果如表1 所示，本次檢測(cè)值均大于閾值，顯示存在牛巴貝斯蟲抗體，為了進(jìn)一步確診，需進(jìn)行PCR試驗(yàn)。

表1 牛巴貝斯蟲ELISA 檢測(cè)結(jié)果

2.3.3 18S rDNA PCR 檢測(cè)。提取待檢牛血漿中巴貝斯蟲的DNA，用特異性引物（表2）[15]進(jìn)行18S rDNA的PCR 鑒定。反應(yīng)條件為：94 ℃3 min；94 ℃30 s，56 ℃20 s，71 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；73 ℃5 min[13]。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果（圖2）。

表2 牛巴貝斯蟲特異性引物序列表

圖2 18S rDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

將PCR 產(chǎn)物送至生物公司測(cè)序，測(cè)序完整序列結(jié)果如下所示。結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后，顯示與牛巴貝斯蟲同源性為99.9%，證明本例病因是牛巴貝斯蟲感染。

測(cè)序完整序列：atggaggctacaacaactgcaaaaacagggatatggaaaaaatatctcactttg gtggttcctatactatgtgtag tgattctttctggtgaagtggtacccacagaagc tgccttccaatacgtgaaaatgagccaaagcgcag aaccagccgtagagatg gtggaaggtcctcaaggagacaa actaccaactctcggttgtcagcggatatg atgacagtgacgatggtgatgattccg ataggcccagaggaaggcaacagtc ctccaaatctacgccgaaggat atctggggcagatacatgccaagtttgacctt gcgaaatcccacggttccggtatatacgtcgacctaggagggacagaaaggg ttggtgccacgcaacatcgtatgcccaccggtaagtgccccgtatgggtaagg tgattaacttgggaaacaatgcggacttcctcaaccgaatatccgccgaaaccc acaggacagaggtctggcatttcctgatacagcagttgcagtaactagaaatag caacgcaaggaatcgtgcggcggccgagaaaactgagattattctatcgcctg tgtccgcagcagaccttgtacggtggggctacgatggcaacgacgtcgccaa ctgcgccgagtatgccggcaatatcatacctgcttctgac acagcgcaaa gta caggtacccttgcgtatacgatgccaaggaggaaatgtgtcacatcct cttcac gcccatgcagtacaaccgaggtagtagatatt gtgacaatgatggatcccaag acgaggggacaagctccctcctgtgtatggagccgatgaagagcggcattga tgcacacctttactacggttcttcacgggtagataaaaaatgggaagaaaactg tcccatgtacccagttaaggatgctatctttgggaggggggccaattggacttgt tgtcgctattgagtccgctttcgaagaatttcacgcgtgacgcagaggagtgttc tgctcttatgttcgaaaacgcagcagctgatctcgaaatcgatgaggaagctga taacttcgatgaactgaagactc tatccgacggccttcggaacataaaggcctc caagattgctcaagcgctattctccccaatcgcgaaagcaggcacctcggcca aaaattccaagggagtaggaatgaactgggctaaactatgacagcaatactgg attgtgccgtgttatagaagaaactccaaactgcctcatcatagacgctggtagt tttg ccatgacagcagttggattcgcctctcgagcaggatgctgtcccgtttcca tgtgatatcgttactaacggctacattgagccccgcccgcgaagtcgccatagg aacactacgccaatatttgaagtcacaaccgcgctttcacgagaa。

3 治療方法

治療牛巴貝斯蟲病的原則是通過(guò)清除牛體內(nèi)巴貝斯蟲，使紅細(xì)胞盡快恢復(fù)基礎(chǔ)代謝功能。本次治療選用的是三氮脒注射液（河北某獸藥業(yè)有限公司；產(chǎn)品批號(hào)：2020012；注射劑，1 g/支），牛肌內(nèi)注射，1 次量為3 mg/kg，1 日1 次，間隔24 h 可再次注射，但不得超過(guò)3 次。3 d 后患病牛有了明顯好轉(zhuǎn)。10 d 后全部治愈，精神狀態(tài)、食欲以及體溫均恢復(fù)正常。

4 討論

4.1 防治

蜱蟲是巴貝斯蟲的中間宿主，經(jīng)蜱蟲叮咬是巴貝斯蟲最常見(jiàn)的傳播途徑。蜱蟲具有明顯的季節(jié)性活動(dòng)規(guī)律，多發(fā)生于每年的3—10 月。內(nèi)蒙古的養(yǎng)殖場(chǎng)常選址于人煙稀少的荒灘，而這些地方也是蜱蟲較為活躍的區(qū)域，針對(duì)這些問(wèn)題應(yīng)制定一套有效的牛巴貝斯蟲防控措施。

首先要保持牛群飼養(yǎng)場(chǎng)區(qū)及圈舍衛(wèi)生。將場(chǎng)區(qū)內(nèi)的臭水溝等潮濕的地方用生石灰掩埋后再用泥土填平，以免天氣炎熱使得許多寄生蟲的中間宿主再次繁殖；每天清理圈舍糞便，對(duì)臥床上的墊料、料道及飲水系統(tǒng)要定期清洗消毒、檢查更換，以免時(shí)間長(zhǎng)發(fā)霉滋生細(xì)菌[16]。清潔干凈的環(huán)境能讓動(dòng)物處于一個(gè)舒適的狀態(tài)，從而提高機(jī)體對(duì)外界的抗病能力。

對(duì)牛群要定期驅(qū)蟲。寄生蟲寄生方式主要分為兩種：一種是體表寄生，另一種是體內(nèi)寄生。體表寄生蟲更多是體內(nèi)寄生蟲的一種傳播媒介，寄生蟲通過(guò)體表叮咬吸取血液獲得營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)也將其體內(nèi)其他寄生蟲傳播到血液中。對(duì)此可在體表寄生蟲高發(fā)季節(jié)，在場(chǎng)區(qū)附近燃燒蒿草，通過(guò)煙霧達(dá)到驅(qū)蟲的目的。也可以選擇體表驅(qū)蟲藥（阿維菌素和伊維菌素等）進(jìn)行藥浴或者口服，每年2 次[17]。對(duì)于體內(nèi)寄生蟲則可以在其傳播媒介活躍時(shí)期，對(duì)牛群進(jìn)行抽樣采血，通過(guò)簡(jiǎn)單的血涂片法進(jìn)行鑒定，檢查牛群血液中是否有蟲體的存在。當(dāng)有新的牛只購(gòu)入時(shí)，首先要采血檢測(cè)是否存在寄生蟲，并對(duì)牛只進(jìn)行體表驅(qū)蟲，集中隔離飼養(yǎng)45 d 并檢疫合格后再進(jìn)行合群飼養(yǎng)[18]。

4.2 診斷

顯微鏡檢查是診斷寄生蟲病最常用的方法之一。然而，用顯微鏡對(duì)寄生蟲識(shí)別和量化耗時(shí)且勞動(dòng)密集，許多養(yǎng)殖場(chǎng)缺乏顯微鏡及具有相關(guān)技術(shù)的研究人員，以至于無(wú)法及時(shí)診斷體內(nèi)寄生蟲的種類，而引發(fā)驅(qū)蟲藥的濫用，因此更為方便、快捷以及成本低廉的診斷方法是獸醫(yī)工作者研究的目標(biāo)[19]。本次病例診斷中，除了顯微鏡檢查外，還使用了血清學(xué)方法的ELISA 檢測(cè)和分子生物學(xué)診斷的18S rDNA PCR 技術(shù)。后兩種方法相對(duì)于顯微鏡檢查能更有效地應(yīng)用于臨床實(shí)踐診斷中，且結(jié)果更加準(zhǔn)確[20]，能夠輔助肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)及時(shí)診斷并進(jìn)行驅(qū)蟲。

5 結(jié)論

通過(guò)對(duì)本次報(bào)告肉牛病例進(jìn)行臨床癥狀觀察及實(shí)驗(yàn)室診斷，最終確診為牛巴貝斯蟲感染，并采用三氮脒治愈了該病。