張賀，潘靜，趙敏，王旭芬，趙潤濤，侯琳，張志丹，周偉光*

（1.赤峰海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024000； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）主要存在于人和動物的腸道中，嗜熱、嗜酸，是犢牛發(fā)生細(xì)菌性腹瀉的主要病因之一[1]。其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC） 是引起1～7 日齡犢牛腹瀉最為常見的致病性大腸桿菌，可引起犢牛脫水及酸中毒死亡。ETEC 分布廣泛、侵襲力高，臨床上表現(xiàn)為高熱、食欲減退且糞便呈褐色，多為水樣、糊狀，部分犢牛消瘦死亡，給養(yǎng)殖場造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，同時也是牛急性腸毒血癥的病原之一[2-4]。近年來，由于我國畜牧業(yè)發(fā)展速度較快，以及牛養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，由ETEC 引起的犢牛腹瀉及敗血癥日益嚴(yán)重，發(fā)病率和死亡率不斷升高[5-6]。

大腸桿菌O 抗原血清型的鑒定是大腸桿菌分型最為主要的方法。O 抗原凝集反應(yīng)的血清學(xué)檢測方法用時長，一些血清學(xué)交叉反應(yīng)也會導(dǎo)致試驗結(jié)果不準(zhǔn)確[7-9]。而PCR 鑒定方法和使用wzx/wzy 和wzm/wzt 基因組序列的BLAST 檢索方法可以精確對血清型進(jìn)行鑒定。

本研究采集呼和浩特市周邊地區(qū)犢牛養(yǎng)殖場腹瀉犢牛肛拭子糞樣進(jìn)行ETEC 分離鑒定及毒力分析，在其中篩選出2 株毒力菌株，為進(jìn)一步進(jìn)行疫苗制備及免疫原性研究提供參考。

1 試驗材料

1.1 主要試劑和儀器

細(xì)菌DNA 提取試劑盒購自全式金公司；500 bp DNA ladder、2 000 bp DNA ladder 和Premix Ex Taq購于TaKaRa 公司； 革蘭染色液試劑盒和瑞氏染色液購自青島海博生物。菌株編號CVCC209（血清型：O20:k101，產(chǎn)生ST 腸毒素）購于中國獸醫(yī)微生物菌種管理保藏中心；通用臺式離心機(jī)購自Thermo 公司；高速冷凍離心機(jī)和普通PCR 儀購自Eppendorf 公司； 定量PCR 儀購自Bio-Rad 公司；細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱購自上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司。

1.2 病料來源

呼和浩特市周邊地區(qū)腹瀉糞樣A 牧場14 份；B牧場8 份。

1.3 實驗動物

SPF 級4 周齡ICR 小鼠，雌雄各半，購自斯貝福北京生物技術(shù)有限公司。

2 試驗方法

2.1 病料處理及菌株純化

將腹瀉糞樣置于LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37 ℃恒溫?fù)u床200 r/min 增菌培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)后的增菌液劃線接種于MAC 培養(yǎng)基上，劃線后將培養(yǎng)基倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取培養(yǎng)基上桃紅色單個菌落于LB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，并標(biāo)記號碼，增菌后再次劃線接種于EMB 鑒別培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h 后挑取具有黑色金屬光澤的單個菌落再次進(jìn)行LB 液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，將增菌后菌液于-20 ℃甘油內(nèi)保存[10]。

2.2 菌株分離鑒定

2.2.1 菌株P(guān)CR 鑒定。將2.1 分離鑒定后的菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng)，取增菌液進(jìn)行DNA 提取，探針由實驗室提供[11]，合成引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 ETEC 腸毒素和黏附素菌毛PCR 引物和探針

以上述DNA 為模板，對ETEC 腸毒素和黏附素菌毛進(jìn)行雙重定量PCR 擴(kuò)增。采用25 μL 反應(yīng)體系：Premix Ex Taq 12.5 μL，引物L(fēng)T-F 和LT-R 各0.6 μL，引物ST-F 和ST-R 各1.2 μL，探針LT-P 0.6 μL，探針ST-P 1.1 μL，模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)加至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸45 s，循環(huán)45 次觀察結(jié)果。

2.2.2 菌株革蘭染色鏡檢。用接種環(huán)蘸取1 滴生理鹽水于載玻片中央，再用接種環(huán)蘸取固體培養(yǎng)基上的單個菌落與載玻片上的生理鹽水混合，由內(nèi)及外均勻涂開，進(jìn)行火焰固定；使用革蘭染液試劑盒進(jìn)行染色，順序為：A 液1 min、沖洗、B 液1 min、沖洗、C 液30 s、沖洗、D 液1 min，沖洗后用吸水紙吸取多余水分，晾干后進(jìn)行鏡檢。

2.3 菌株致病力測定

2.3.1 菌株篩選。將ETEC 菌株于LB 液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，置于37 ℃恒溫?fù)u床，200 r/min 培養(yǎng)12 h，取菌液3 mL 置于比色杯中測量其OD 值 （分光光度計讀數(shù)為0.08～0.13，大腸桿菌濃度為1.5×108CFU/mL），調(diào)整待測菌濃度為1×109CFU/mL，選取4 周齡ICR小鼠（體重16～22 g）作為試驗用鼠，根據(jù)菌株的數(shù)量設(shè)置組數(shù)，每組選取4 只小鼠作為研究對象，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 菌液，同時分別設(shè)置滅菌PBS、生理鹽水對照組。小鼠攻毒后72 h 內(nèi)觀察精神狀態(tài)和死亡情況，分別記錄每組小鼠的臨床癥狀及死亡情況，挑選出毒力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行下一步試驗。

2.3.2 LD50和LD100測定。結(jié)合致病力篩選試驗結(jié)果，選取2 株較強(qiáng)毒株再次進(jìn)行增菌培養(yǎng)，置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h 至對數(shù)期，測定其吸光值。根據(jù)小鼠死亡情況，梯度調(diào)整其菌液濃度至預(yù)先測定的LD50和LD100濃度，選取4 周齡ICR 小鼠，每組選取4 只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 菌液，同時設(shè)置對照組，記錄每組小鼠的死亡情況，再對濃度梯度進(jìn)行重復(fù)驗證。

2.3.3 小鼠臨床癥狀及病理變化觀察。攻毒后觀察72 h 內(nèi)小鼠的精神狀況以及死亡情況，對死亡的小鼠進(jìn)行剖檢，觀察病變部位并對病變部位進(jìn)行觸片染色鏡檢。

2.3.4 血清型鑒定。參考AtsushiIguchi 大腸桿菌O抗原PCR 血清實用分型，合成牛大腸桿菌常見的血清型引物[12]，引物序列見表2，篩選出的菌株DNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，同時使用實驗室購買的參考菌株作為陽性對照，鑒定其是否為陽性血清型。采用25 μL 反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)加至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)30 次；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后通過紫外照射觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株P(guān)CR 檢測

將22 份腹瀉糞樣分離菌株純化后得到的大腸桿菌菌株進(jìn)行定量PCR 檢測。結(jié)果表明，22 份樣品中14 份樣品ETEC 呈陽性（圖1）。

3.2 革蘭染色菌體形態(tài)觀察

革蘭染色后，鏡檢可見兩端鈍圓的革蘭陰性短桿菌（圖2）。

圖2 ETEC 菌株革蘭染色鏡檢圖

3.3 菌株致病力測定

3.3.1 分離株致病力篩選結(jié)果。通過PCR 特異性鑒定，篩選出3 株ETEC 菌株D2、D7 和D8，與實驗室分離的1 株ETEC 菌株8-1 進(jìn)行致病性試驗。結(jié)果如表3 所示，根據(jù)4 株分離菌株小鼠致病力初篩結(jié)果，選取2 株具有致病力毒株8-1、D2 作為后續(xù)試驗候選菌株進(jìn)行下一步致病力試驗。

表3 分離菌株致病力篩選結(jié)果

3.3.2 疫苗候選株LD50和LD100測定。對2 株菌的LD50和LD100進(jìn)行測定，根據(jù)致病力初篩小鼠死亡情況，調(diào)整這2 株菌的濃度至預(yù)設(shè)的LD50和LD100梯度濃度。8-1 菌株LD50和LD100第1 次驗證如結(jié)果表4所示；D2 菌株LD50和LD100第1 次驗證結(jié)果如表5 所示。得出結(jié)果后進(jìn)行重復(fù)驗證，8-1 菌株重復(fù)試驗結(jié)果如表6 所示，D2 重復(fù)試驗結(jié)果如表7 所示。

表4 8-1 菌株LD50、LD100 測定

表5 D2 菌株LD50、LD100 測定

表6 重復(fù)驗證8-1 菌株LD50、LD100

表7 重復(fù)驗證D2 菌株LD50、LD100

根據(jù)分離株致病力初篩結(jié)果以及2 株菌LD50和LD100小鼠攻毒及重復(fù)驗證試驗結(jié)果，最終可知8-1 菌株LD50為5×108CFU/mL，LD100為9×108CFU/mL；D2菌株LD50為1.2×109CFU/mL，LD100為2×109CFU/mL。

3.3.3 血清型鑒定。對篩選出的8-1、D2 2 株菌使用參考文獻(xiàn)[12]中牛源常見的68 對大腸桿菌O 抗特異性鑒定引物對進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定，最終得出8-1 菌株血清型為O118，D2 菌株血清型為O2，見圖3。

圖3 2 株疫苗候選菌株血清型基因擴(kuò)增條帶

4 討論

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌作為引發(fā)犢牛腹瀉的主要致病菌，其致病性較強(qiáng)，分布范圍廣泛，侵襲力強(qiáng)，是危害犢牛養(yǎng)殖業(yè)的主要病因，常伴隨脫水、敗血癥及消化不良等癥狀。新生犢牛在1 月齡內(nèi)易感，隨著年齡的增長，發(fā)病率也逐漸下降。

宋美英[13]收集并分離獲得致病性牛源大腸桿菌84 株，對其進(jìn)行16 種毒力基因的PCR 檢測。結(jié)果顯示，攜帶毒力基因的致病性大腸桿菌有60 株，多種毒力基因組合以F41 和K99 為主，并結(jié)合耐藥性進(jìn)行分析，為研制以毒力基因為抗原的新型疫苗、選擇敏感藥物提供了一定依據(jù)。張洋龍[14]將分離出的53 株牛源ETEC 菌株進(jìn)行耐藥基因檢測，通過致病性試驗和毒力基因檢測試驗，成功構(gòu)建牛源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌強(qiáng)毒株的抑制消減基因組DNA 文庫，并對差異基因進(jìn)行了分布及分析研究。張力國[15]在黑龍江不同地區(qū)糞樣中分離出88 株大腸桿菌，并進(jìn)行毒素基因和黏附素基因檢測。結(jié)果顯示，黏附素類型以K88 和F18為主，大腸桿菌類型以ETEC 和EPEC 為主。

本試驗從呼和浩特市周邊的牧場犢牛腹瀉糞樣成功分離出ETEC 菌株，經(jīng)分離純化、小鼠毒力篩選后得到1 株疫苗備選菌株，并與實驗室8-1 陽性菌株進(jìn)行致病性試驗，得到8-1 菌株LD50為5×108CFU/mL，LD100為9×108CFU/mL；D2 菌株LD50為1.2×109CFU/mL，LD100為2×109CFU/mL。2 株菌毒力較強(qiáng)，在小鼠攻菌后，以小鼠死亡情況作為判斷標(biāo)準(zhǔn)的同時進(jìn)行臨床觀察，在選擇梯度攻菌濃度時也進(jìn)行了重復(fù)驗證，反映出2 株菌在小鼠上實際的致病作用。小鼠攻毒的最佳注射位置為腹腔。致病性試驗感染模型的建立參考文獻(xiàn)[16-19]的操作方法。在對大腸桿菌菌落數(shù)進(jìn)行測定時，分光光度計讀數(shù)為0.08～0.13，大腸桿菌濃度為1.5×108CFU/mL。為減小試驗誤差，本試驗分光光度計讀數(shù)均為0.1 左右，這也增加了試驗的準(zhǔn)確性。

血清型鑒定試驗參考了大腸桿菌O 抗原基因wzx/wzy 或wzm/wzt 中的片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，鑒定分離菌株的血清型。相對于玻片凝集鑒定，PCR 擴(kuò)增鑒定更加準(zhǔn)確，避免了與其他O-抗原發(fā)生交叉反應(yīng)[20]。參考文獻(xiàn)[12，20-21]篩選出68 對報道在犢牛和奶牛體內(nèi)產(chǎn)生的大腸桿菌血清型特異性引物，分別對2 株菌進(jìn)行PCR 鑒定，得出8-1 菌株血清型是O118，D2 菌株血清型是O2。

對本試驗分離鑒定的ETEC 菌株進(jìn)一步進(jìn)行致病性試驗，顯示其對小鼠有致病性，適合作為菌株進(jìn)行后續(xù)疫苗免疫相關(guān)試驗。