張瑜 王彥宏 劉美

肺癌是癌癥致死的主要原因之一[1]，盡管肺癌的早期診斷與治療等方面已取得了許多進展，但仍缺乏有效的早期檢測和預(yù)后監(jiān)測的生物標志物，患者5年生存率低，僅為21%[2,3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）可通過多種機制調(diào)節(jié)基因表達，進而影響細胞增殖、遷移、代謝等方面[4]。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）修飾是真核細胞中最常見的內(nèi)部RNA修飾機制，參與調(diào)節(jié)RNA剪接、穩(wěn)定、降解、翻譯等機制，是一個高度動態(tài)、可逆的過程，此過程發(fā)生異?？蓪?dǎo)致下游基因表達失調(diào)，影響細胞功能[5,6]。m6A修飾受“寫入”“讀取”“擦除”3個同源因子的控制，“寫入”因子是將甲基添加到m6A修飾位點的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣（methyltransferase-like,METTL）3、METTL14、METTL16和Wilms腫瘤相關(guān)蛋白等[7,8]，近年來多項研究[9-11]顯示，m6A甲基化修飾異常在血液系統(tǒng)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病以及癌癥等多種疾病中發(fā)揮重要作用。LncRNA THAP7-AS1是一個天然的反義lncRNA，位于染色體22q11.21，其表達在胃癌中顯著上調(diào)[12]，目前關(guān)于lncRNA THAP7-AS1在肺癌中的作用尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)分析與體內(nèi)外實驗探究METTL3介導(dǎo)m6A修飾lncRNA THAP7-AS1影響肺癌進展的作用機制，為肺癌發(fā)展的分子機制提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標本 收集2021年1月至2023年1月經(jīng)手術(shù)切除的120例肺癌組織及相應(yīng)癌旁樣本，術(shù)后病理診斷確診為肺癌[13]。其中男性68例，女性52例，年齡44-76（59.74±11.53）歲。研究已獲得甘肅省白銀市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者均知情并自愿提供組織樣本。

1.2 實驗動物 20只SPF級4周齡健康雄性BALB/c裸鼠，體重（30±5）g，購自河南省實驗動物中心，動物合格證號SCXK（豫）2022-0001。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗，實驗操作均符合3R原則，動物實驗倫理審批號：GSCM-20210112。

1.3 實驗細胞 SPC-A-1（貨號：FS-X1751）、NCI-H1299（貨號：FS-X1698）、LTEP-a-2（貨號：FS-X1679）、H460（貨號：A01X890），購自上海撫生實業(yè)有限公司；人肺癌細胞A549（貨號：BNCC337696），購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；人正常肺支氣管上皮細胞BEAS-2B（貨號：SNL-203），購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司；人腎上皮細胞293T（貨號：HEK293T），購自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.4 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（貨號：11965092）、胎牛血清（貨號：16140063）、鏈霉素/青霉素（貨號：15070063）、TR Izol試劑（貨號：15596018）、High-Capacity cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：4368813）、鏈霉素親和偶聯(lián)磁珠（貨號：88817），購自美國Thermo Fisher公司；慢病毒表達載體的構(gòu)建、鑒定、包裝與滴度測定由上海美軒生物科技有限公司負責(zé)完成；SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（貨號：RR820A），購自大連寶生生物科技有限公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）引物與內(nèi)參購自武漢金開瑞生物工程有限公司；熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization,FISH）試劑盒（貨號：Bes1001），購自廣州伯信生物科技有限公司；MTS試劑盒（貨號：15711），購自西安百螢生物科技有限公司；5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU）細胞增殖檢測試劑盒（貨號：A003-A008），購自美國GeneCopoeia公司；Matrigel基質(zhì)膠（貨號：354234），購自上海研卉生物科技有限公司；IgG（貨號：ab172730）、m6A（貨號：ab286164）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）（1:1000，貨號：ab68153）、Cullin蛋白4B（CUL4B，1:500，貨號：ab227724）、大核糖體蛋白P0（ribosomal protein large P0,RPLP0）（1:1000，貨號：ab192866）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha,PI3KCA）（1:1000，貨號：ab40776）、磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ（phosphoinositide-3 kinase catalytic subunit delta,PI3KCD）（1:1000，貨號：ab109006）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phospho-phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K）（1:200，貨號：ab182651），購自英國Abcam公司；磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B,p-AKT）（1:2000，貨號：4060）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphomammalian target of rapamycin,p-mTOR）（1:1000，貨號：5536），購自美國CST公司。其他試劑均為市售分析純。

羅氏LightCycler480 II PCR儀購自源場芯科技設(shè)備（上海）有限公司；Leica DM4B光學(xué)顯微鏡、徠卡DM1000生物熒光顯微鏡購自德國Leica公司；LF-Mini4型小型垂直電泳槽購自北京龍方科技有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇SPC-A-1、LTEP-a-2、A549、NCI-H1299、H460和BEAS-2B細胞，使用含10%胎牛血清與100 mg/mL鏈霉素/青霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 °C、5% CO2、飽和濕度的電熱恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。SPC-A-1、NCI-H1299細胞分為NC組（轉(zhuǎn)染NC）、sh-NC組（轉(zhuǎn)染sh-NC）、METTL3組（轉(zhuǎn)染METTL3）、sh-METTL3組（轉(zhuǎn)染sh-METTL3）、THAP7-AS1組（轉(zhuǎn)染THAP7-AS1）、sh-THAP7-AS1組（轉(zhuǎn)染sh-THAP7-AS1）、Vector組（轉(zhuǎn)染NC+sh-NC）和THAP7-AS1+sh-CUL4B組（轉(zhuǎn)染THAP7-AS1+sh-CUL4B），按照分組名稱進行慢病毒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建穩(wěn)定表達的細胞株。

1.5.2 實時熒光定量PCR（quantitative reverse transcription-PCR,qRT-PCR）檢測lncRNA THAP7-AS1相對表達情況使用TRIzol試劑提取各組組織、細胞總RNA后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用1 μg cDNA模板、上下游引物各0.5 μg和SYBR Premix Ex Taq II試劑盒配制20 μL PCR反應(yīng)體系，擴增條件：95 °C預(yù)變性2 min，95 °C 15 s，60 °C 60 s，循環(huán)40次。表1為引物序列，應(yīng)用2-△△CT法計算THAP7-AS1的相對水平。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.5.3 FISH實驗 SPC-A-1、NCI-H1299細胞常規(guī)接種于24孔板內(nèi)的載玻片上，培養(yǎng)24 h后加入4%多聚甲醛固定10 min。加入0.5% Triton X-100通透處理5 min。預(yù)雜交液、雜交液37 °C預(yù)熱30 min后加至載玻片上，置于37 °C環(huán)境中反應(yīng)20 min。雜交液1:50稀釋THAP7-AS1探針，加至載玻片上，37 °C避光過夜。洗脫未結(jié)合的探針，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）避光反應(yīng)8 min，于熒光顯微鏡下拍照。

1.5.4 甲基化RNA免疫共沉淀（methyl at ed RN Aimmunoprecipitation,meR IP）實驗 取SPC-A-1、NCI-H1299細胞總RNA，以IgG抗體為對照，目的抗體為m6A，4 °C孵育過夜。加入蛋白G瓊脂糖珠，4 °C孵育2 h，加入20 mmol/L N6-甲基腺苷5'-單磷酸酯鈉鹽，4 °C洗脫2次，1 h后經(jīng)RNA純化試劑盒純化，qRT-PCR分析m6A富集情況。

1.5.5 MTS法檢測細胞增殖能力 各組轉(zhuǎn)染SPC-A-1、NCI-H1299細胞接種至96孔板上，接種密度2000個/孔，于培養(yǎng)24、48、72 h后進行MTS檢測，每孔加入40 μL MTS試劑，避光培養(yǎng)4 h，于490 nm波長下檢測各孔吸光度。

1.5.6 EdU檢測DNA復(fù)制活性 SPC-A-1、NCI-H1299 NC組、THAP7-AS1組、sh-NC組、sh-THAP7-AS1組細胞以4000個/孔的接種密度接種于24孔板中，37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入含EdU工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，4%多聚甲醛固定后加入Triton X-100通透細胞，加入Click反應(yīng)液，37 °C避光反應(yīng)30 min，加入DAPI染核，37 °C避光反應(yīng)10 min，于熒光顯微鏡下拍照，計算EdU陽性細胞的百分比。

1.5.7 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力 SPC-A-1、NCI-H1299 NC組、THAP7-AS1組、sh-NC組、sh-THAP7-AS1組細胞接種至6孔板中，接種密度2000個/孔，培養(yǎng)10 d。棄去培養(yǎng)基，加入甲醇固定30 min，1%結(jié)晶紫染色20 min，統(tǒng)計克隆數(shù)量。

1.5.8 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 各組轉(zhuǎn)染SPC-A-1、NCI-H1299細胞接種至6孔板中，接種密度1×106個/孔，觀察細胞覆蓋率達到90%，用移液器槍頭作劃痕，清除脫落的細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。于劃痕后（0 h）和培養(yǎng)24 h時拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率=（0 h寬度-24 h寬度）/0 h寬度×100%。

1.5.9 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 無血清DMEM/F12培養(yǎng)基與Matrigel基質(zhì)膠按1:3的比例稀釋，混勻后均勻涂抹于小室上室膜底部，置于培養(yǎng)箱中過夜，次日置于紫外線燈下照射30 min。各組轉(zhuǎn)染SPC-A-1、NCI-H1299細胞制成細胞懸液，接種于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定進入下室的細胞，結(jié)晶紫染色，于光鏡下觀察拍照，計算細胞侵襲率=各組侵襲細胞數(shù)/對照組侵襲細胞數(shù)×100%。

1.5.10 體內(nèi)異種移植實驗 20只裸鼠根據(jù)不同腫瘤細胞平均分為兩部分，每部分根據(jù)細胞分組名稱分為NC組、THAP7-AS1組，每組5只。于左側(cè)腹部皮下接種各組細胞，細胞懸液密度為2×106個/mL。從接種后1 d起，每4 d測量一次腫瘤體積，計算公式：體積=1/2（長×寬2）。21 d后觀察到接種位置出現(xiàn)明顯腫塊，完整取出腫瘤并稱重。

1.5.11 RNA pull-down實驗 SPC-A-1、NCI-H1299細胞加入適量預(yù)冷細胞裂解液，充分裂解后于4 °C、10,000 rpm條件下離心10 min，上清液即為總蛋白。體外轉(zhuǎn)錄生物素標記的THAP7-AS1和反義鏈RNA，經(jīng)純化后分別加入SPC-A-1、NCI-H1299細胞總蛋白與鏈霉親和素磁珠，4 °C孵育過夜后離心收集磁珠。RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物經(jīng)洗脫、變性、SDS-PAGE凝膠電泳后進行銀染，切取THAP7-AS1與反義鏈RNA之間的差異條帶，經(jīng)消化后進行質(zhì)譜分析。

1.5.12 RIP實驗 使用細胞裂解液裂解SPC-A-1、NCI-H1299細胞，分別加入IgG與CUL4B抗體偶聯(lián)的磁珠，于4 °C環(huán)境下孵育過夜，加入0.1%十二烷基硫酸鈉和0.5 mg/mL蛋白酶K，于55 °C環(huán)境中孵育30 min去除蛋白質(zhì)。測定RNA濃度與純度后進行qRT-PCR檢測THAP7-AS1的相對表達水平。

1.5.13 Western blot檢測磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT）信號通路相關(guān)蛋白表達情況 收集SPC-A-1、NCI-H1299 Vector組、THAP7-AS1組、THAP7-AS1+sh-CUL4B組細胞，加入適量裂解液裂解后4 °C、10,000 rpm離心10 min，保留上清液，BCA定量后制樣。經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后截取目的條帶，加入封閉液室溫封閉1 h。加入稀釋后的對應(yīng)一抗孵育液：STAT3（1:1000）、CUL4B（1:500）、RPLP0（1:1000）、PI3KCA（1:1000）、PI3 KCD（1:1000）、p-PI3 K（1:200）、p-AKT（1:2000）、p-mTOR（1:1000），4 °C孵育過夜。洗膜，加入1:5000稀釋的對應(yīng)二抗孵育液，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL試劑，避光反應(yīng)5 min后收集熒光成像結(jié)果。

1.5.14 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析使用SPSS 24.0軟件完成，計量資料使用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料以率（%）表示，分類變量比較采用χ2檢驗，兩變量間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。使用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線分析THAP7-AS1對肺癌的診斷價值，計算ROC曲線下面積（area under the curve,AUC）及其95%CI。使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）分析不同THAP7-AS1表達水平的肺癌患者的生存情況。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THAP7-AS1在肺癌中表達上調(diào) 從本研究收集到的組織中隨機選擇了10例肺癌與2例癌旁組織進行l(wèi)ncRNA微陣列分析，結(jié)果顯示，肺癌組織中有425個lncRNA顯著下調(diào)，989個lncRNA顯著上調(diào)（折疊變化＞2.0、P＜0.05）。根據(jù)折疊變化≥5、P＜0.05、與癌旁組織相比表達水平明顯上調(diào)3個條件進一步篩選出LOC100133669與THAP7-AS1兩個候選lncRNA。qRT-PCR檢測全部120對肺癌與癌旁組織，結(jié)果顯示肺癌組織中THAP7-AS1水平較癌旁組織顯著上調(diào)（P＜0.05），因此本研究著重探索THAP7-AS1在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。與正常支氣管上皮細胞BEAS-2B相比，SPC-A-1、LTEP-a-2、A549、NCI-H1299、H460細胞THAP7-AS1表達量均上調(diào)（P＜0.05），SPC-A-1與NCI-H1299細胞中THAP7-AS1 mRNA水平最高，因此選擇SPC-A-1、NCI-H1299細胞進行后續(xù)實驗。FISH實驗結(jié)果顯示，THAP7-AS1位于SPC-A-1、NCI-H1299細胞的細胞質(zhì)與細胞核中。見圖1、2。

2.2 THAP7-AS1與肺癌診斷、預(yù)后及臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)120對肺癌與癌旁組織THAP7-AS1表達水平評價THAP7-AS1對肺癌的診斷價值，繪制ROC曲線，其AUC值為0.737（95%CI: 0.608-0.847,P＜0.05），提示THAP7-AS1對肺癌具有一定的診斷價值。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫生存分析結(jié)果顯示，THAP7-AS1高表達的肺癌患者總生存率較低（P＜0.05）。以THAP7-AS1表達的平均值將肺癌患者分為低表達組與高表達組，年齡、性別、吸煙、組織學(xué)類型、遠處轉(zhuǎn)移、分化程度與肺癌組織THAP7-AS1表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），腫瘤大小、腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis,TNM）分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與肺癌組織THAP7-AS1表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 THAP7-AS1與肺癌診斷、預(yù)后及臨床病理特征的關(guān)系。A：ROC曲線評價THAP7-AS1對肺癌的診斷價值；B：Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫不同THAP7-AS1水平患者生存分析結(jié)果。Fig 3 Relationship between THAP7-AS1 and diagnosis,prognosis and clinicopathological features of lung cancer.A: The diagnostic value of THAP7-AS1 in lung cancer evaluated by ROC curve;B: Results of survival analysis of patients with different THAP7-AS1 levels in Kaplan-Meier Plotter database.ROC: receiver operating characteristic;AUC: area under the curve.

表2 THAP7-AS1表達水平與肺癌患者臨床病理特征間的關(guān)系Tab 2 Relationship between THAP7-AS1 expression level and clinicopathological features in patients with lung cancer

2.3 METTL3介導(dǎo)m6A修飾增強THAP7-AS1表達 使用SRAMP數(shù)據(jù)庫預(yù)測THAP7-AS1序列中的m6A修飾位點，共發(fā)現(xiàn)7個位點。meRIP、qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，THAP7-AS1中存在m6A修飾，過表達或下調(diào)METTL3可顯著提高或抑制SPC-A-1、NCI-H1299細胞中THAP7-AS1的表達水平，肺癌組織中METTL3水平較癌旁組織顯著上調(diào)（P＜0.05），THAP7-AS1表達水平與MEL3表達水平呈正相關(guān)（r=0.4639,P＜0.0001）。見圖4。

圖4 METTL3介導(dǎo)m6A修飾增強THAP7-AS1表達。A：m6A修飾的THAP7-AS1位點3、5在SPC-A-1、NCI-H1299細胞中富集；B：qRT-PCR檢測過表達或下調(diào)METTL3對SPC-A-1、NCI-H1299細胞THAP7-AS1表達水平變化；C：qRT-PCR檢測120對肺癌與癌旁組織THAP7-AS1表達情況；D：肺癌組織THAP7-AS1與METTL3表達水平的相關(guān)性分析。*P＜0.05。Fig 4 METTL3-mediated m6A modification enhances THAP7-AS1 expression.A: THAP7-AS1 sites 3 and 5 modified by m6A were enriched in SPC-A-1 and NCI-H1299 cells;B: qRT-PCR detection of overexpression or down-regulation of METTL3 on the expression of THAP7-AS1 in SPC-A-1 and NCI-H1299 cells;C: The expression of THAP7-AS1 in 120 pairs of lung cancer and normal tissues was detected by qRT-PCR;D: Analysis of correlation between THAP7-AS1 and METTL3 expression in lung cancer.METTL3: methyltransferase-like 3.*P＜0.05.

2.4 THAP7-AS1在體內(nèi)外促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲 MTS、EDU、克隆形成、劃痕、Transwell實驗結(jié)果顯示，與SPC-A-1、NCI-H1299細胞NC組、sh-NC組相比，THAP7-AS1組增殖、克隆形成、遷移、侵襲能力提高（P＜0.05），sh-THAP7-AS1組增殖、克隆形成、遷移、侵襲能力下降（P＜0.05）。體內(nèi)異種移植實驗結(jié)果顯示，與SPC-A-1、NCI-H1299細胞NC組相比，THAP7-AS1組腫瘤生長速度提升，體積、質(zhì)量增大（P＜0.05）。見圖5-7。

圖5 THAP7-AS1促進肺癌細胞增殖。A：構(gòu)建SPC-A-1、NCI-H1299 THAP7-AS1過表達與沉默穩(wěn)定表達細胞株，MTS檢測細胞增殖率；B：EdU實驗檢測細胞DNA復(fù)制活性（×200）；C：克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力。*：與NC組相比，P＜0.05；#：與sh-NC組相比，P＜0.05。Fig 5 THAP7-AS1 promotes the proliferation of lung cancer cells.A: Construction of stable overexpression and silencing cell lines of SPC-A-1 and NCI-H1299 THAP7-AS1,and to detect the cell proliferation rate by MTS;B: Detection of DNA replication activity of cells by EdU assay (×200);C:Colony formation assay to detect the ability of cell clone formation.OD: optical delnsity.*: Compared with NC group,P＜0.05;#: Compared with sh-NC group,P＜0.05.

圖6 THAP7-AS1促進肺癌細胞遷移和侵襲。A：構(gòu)建SPC-A-1、NCI-H1299 THAP7-AS1過表達與沉默穩(wěn)定表達細胞株，劃痕實驗檢測細胞遷移能力（×100）；B：Transwell實驗檢測細胞侵襲能力（×200）。*：與NC組相比，P＜0.05；#：與sh-NC組相比，P＜0.05。Fig 6 THAP7-AS1 promotes migration and invasion of lung cancer cells.A: Construction of stable overexpression and silencing cell lines of SPC-A-1 and NCI-H1299 THAP7-AS1,and detection of cell migration ability by wound scratch assay (×100);B: Transwell assay to detect the invasive ability of cells (×200).*: Compared with NC group,P＜0.05;#: Compared with sh-NC group,P＜0.05.

圖7 THAP7-AS1增強肺癌細胞成瘤能力。A：構(gòu)建穩(wěn)定過表達THAP7-AS1的SPC-A-1、NCI-H1299細胞株，體內(nèi)異種移植實驗?zāi)[瘤圖片；B：移植瘤體積檢測結(jié)果；C：移植瘤質(zhì)量檢測結(jié)果。*P＜0.05。Fig 7 THAP7-AS1 enhances the tumorigenicity of lung cancer cells.A: Construction of stable overexpression and silencing cell lines of SPC-A-1 and NCI-H1299 THAP7-AS1,and tumor pictures of xenotransplantation in vivo;B: Results of volume measurement of transplanted tumor;C: Results of quality measurement of transplanted tumor.*P＜0.05.

2.5 THAP7-AS1結(jié)合CUL4B啟動PI3K/AKT信號通路促進肺癌細胞增殖、遷移、侵襲 通過RNA下拉實驗與質(zhì)譜分析鑒定THAP7-AS1的蛋白質(zhì)復(fù)合體，根據(jù)相對分子質(zhì)量約為100 kDa、肽評分＞100、相關(guān)研究顯示參與腫瘤進展三個條件篩選出2個潛在的結(jié)合蛋白：CUL4B和STAT3。蛋白質(zhì)組學(xué)分析、RIP檢測結(jié)果顯示，CUL4B與THAP7-AS1存在特異結(jié)合。MTS、劃痕、Transwell實驗結(jié)果顯示，與SPC-A-1、NCI-H1299細胞Vector組相比，THAP7-AS1組增殖、遷移、侵襲能力升高（P＜0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示，與SPC-A-1、NCI-H1299細胞Vector組相比，THAP7-AS1組PI3KCA、PI3KCD、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達水平升高（P＜0.05）。見圖8-10。

圖8 THAP7-AS1特異性結(jié)合蛋白篩選驗證。A：THAP7-AS1蛋白質(zhì)復(fù)合體銀染實驗結(jié)果；B：蛋白質(zhì)組學(xué)Western blot驗證結(jié)果；C：RIP檢測CUL4B與THAP7-AS1結(jié)合情況。Fig 8 Screening and verification of THAP7-AS1 specific binding protein.A: Silver staining of the THAP7-AS1-protein complex;B: Results of proteomic Western blot verification;C: Detection of the combination of CUL4B and THAP7-AS1 by RIP assay.CUL4B: Cullin 4B; STAT3: signal transducers and activators of transcription 3;RPLP0: ribosomal protein large P0;RIP: RNA-immunoprecipitation.

圖10 THAP7-AS1結(jié)合CUL4B啟動PI3K/AKT信號通路。SPC-A-1（A）、NCI-H1299（B）THAP7-AS1過表達與沉默CUL4B穩(wěn)定表達細胞株，Western blot檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達情況。*P＜0.05。Fig 10 THAP7-AS1 combined with CUL4B to initiate PI3K/AKT signal pathway.Overexpression of SPC-A-1 (A) and NCI-H1299 (B) THAP7-AS1 and silencing of CUL4B stably expressed cell lines,Western blot detected the expression of proteins related to PI3K/AKT signal pathway.PI3KCA:phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha;PI3KCD: phosphoinositide-3 kinase catalytic subunit delta;p-PI3K:phospho-phosphatidylinositol 3-kinase;p-AKT: phospho-protein kinase B;p-mTOR: phospho-mammalian target of rapamycin.*P＜0.05.

2.6 METTL3介導(dǎo)m6A修飾lncRNA THAP7-AS1表達上調(diào)促進肺癌發(fā)生的具體作用機制 綜合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA THAP7-AS1在肺癌組織與細胞系中表達升高，對肺癌具有一定的診斷價值，其表達水平與患者總生存率、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。THAP7-AS1被SP1轉(zhuǎn)錄激活，經(jīng)METTL3介導(dǎo)m6A修飾后穩(wěn)定表達，通過與CUL4B結(jié)合激活PI3K/AKT信號通路促進SPC-A-1、NCI-H1299細胞增殖、遷移、侵襲，其可能的作用機制見圖11。

圖11 METTL3介導(dǎo)m6A修飾lncRNA THAP7-AS1表達上調(diào)促進肺癌發(fā)生的具體作用機制Fig 11 Specific mechanism of METTL3-mediated upregulation of m6A modified lncRNA THAP7-AS1 expression in promoting lung carcinogenesis.

3 討論

研究[14]表明，多種lncRNA參與調(diào)節(jié)肺癌病理生理過程。LncRNA PKMYT1AR/miR-485-5p/PKMYT1軸通過抑制β-TrCP1介導(dǎo)的β-catenin蛋白的泛素化降解，促進非小細胞肺癌中腫瘤干細胞的維持，進而促進腫瘤發(fā)展[15]。LncRNA ABHD11-AS1存在m6A修飾位點，METTL3介導(dǎo)m6A修飾誘導(dǎo)lncRNA ABHD11-AS1增強NCI-H1299、NCI-H1650細胞增殖能力與瓦博格效應(yīng)[16]。Liu等[12]的研究表明，lncRNA THAP7-AS1由特異性蛋白1激活表達，并由METTL3通過“閱讀器”蛋白胰島素樣生長因子II mRNA結(jié)合蛋白1依賴的途徑介導(dǎo)m6A修飾實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定，激活下游PI3K/AKT信號通路促進胃癌發(fā)展。本研究通過lncRNA微陣列分析篩選肺癌組織與正常肺組織中差異表達的lncRNA，結(jié)果顯示，lncRNA THAP7-AS1在肺癌組織中呈高表達。ROC曲線提示lncRNA THAP7-AS1對肺癌具有一定的診斷價值，其表達水平與患者總生存率、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測lncRNA THAP7-AS1的異常表達能夠影響肺癌發(fā)展。METTL3在催化m6A修飾過程中占據(jù)主導(dǎo)地位，其水平變化可影響m6A修飾RNA甲基化進程[17]。結(jié)合SRAMP數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析結(jié)果、meRIP、qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THAP7-AS1存在m6A修飾，過表達或下調(diào)METTL3可影響SPC-A-1、NCI-H1299細胞THAP7-AS1表達，且METTL3在肺癌組織中表達上調(diào)，其水平與THAP7-AS1表達水平呈正相關(guān)，推測METTL3介導(dǎo)m6A修飾增強THAP7-AS1表達。

為了進一步探究THAP7-AS1在肺癌細胞中的生物學(xué)功能，本研究建立穩(wěn)定過表達與沉默THAP7-AS1的SPC-A-1、NCI-H1299細胞株。各項細胞功能學(xué)實驗結(jié)果顯示，過表達THAP7-AS1增強了SPC-A-1、NCI-H1299細胞增殖、遷移、侵襲能力，而降低THAP7-AS1表達后，SPC-A-1、NCI-H1299細胞惡性生物學(xué)行為明顯受到抑制；體內(nèi)異種移植實驗結(jié)果顯示，過表達THAP7-AS1增強了SPC-A-1、NCI-H1299細胞的成瘤能力，推測THAP7-AS1對肺癌細胞SPC-A-1、NCI-H1299生長、遷移具有促進作用。LncRNA通過與蛋白質(zhì)相互作用參與分子調(diào)控，推測THAP7-AS1可能與某些蛋白存在相互作用，調(diào)節(jié)肺癌細胞的惡性表型。經(jīng)RNA下拉實驗、質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)組學(xué)分析與RIP檢測實驗驗證，THAP7-AS1與CUL4B存在特異結(jié)合。CUL4B是Cullin 4B-RING E3連接酶復(fù)合體中的一種支架蛋白，通過功能性核定位信號及其與核輸入受體蛋白的相互作用在細胞核內(nèi)積聚，在多種癌癥中表達上調(diào)，發(fā)揮致癌作用[18,19]。MTS、劃痕、Transwell實驗結(jié)果顯示，過表達THAP7-AS1的同時抑制CUL4B表達可降低THAP7-AS1對SPC-A-1、NCI-H1299細胞增殖、遷移、侵襲能力的促進效果。PI3K/AKT信號通路參與多種惡性腫瘤細胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移、耐藥等方面，其相關(guān)分子在肺癌中異常表達[20,21]。Western blot檢測結(jié)果顯示，SPC-A-1、NCI-H1299細胞THAP7-AS1組PI3KCA、PI3KCD、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平較Vector組升高，而THAP7-AS1+sh-CUL4B組蛋白表達水平與Vector組無明顯差異，推測THAP7-AS1與CUL4B結(jié)合激活PI3K/AKT信號通路促進SPC-A-1、NCI-H1299細胞生長、遷移。

綜上所述，lncRNA THAP7-AS1在肺癌中高表達，對肺癌具有一定的診斷價值，其表達水平與患者總生存率、不良臨床病理特征有關(guān)，通過METTL3介導(dǎo)的m6A修飾穩(wěn)定表達，與CUL4B結(jié)合激活PI3K/AKT信號通路，進而促進肺癌發(fā)生發(fā)展，具有成為肺癌新的生物標志物與治療靶點的價值。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Zhang Y and Wang YH conceived and designed the study.Zhang Y,Wang YH and Liu M performed the experiments.Wang YH and Liu M analyzed the data.Liu M contributed analysis tools.Zhang Y,Wang YH and Liu M provided critical inputs on design,analysis,and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.