李博文 黃志誠(chéng) 王亞?wèn)| 薛劍超 夏研凱 徐源 楊華夏 梁乃新 李單青

由于既往對(duì)微生物的檢測(cè)依賴(lài)于微生物培養(yǎng)，健康人的下呼吸道曾經(jīng)被認(rèn)為是無(wú)菌的。然而，即使在最?lèi)毫拥淖匀粭l件下也發(fā)現(xiàn)了微生物的存在，與口腔及外界環(huán)境相溝通的下呼吸道中沒(méi)有細(xì)菌顯然不合情理。2010年，Hilty等[1]第一次利用支氣管鏡和16S rRNA測(cè)序技術(shù)證明了下呼吸道細(xì)菌的存在，并展示了哮喘、慢性阻塞性肺疾病患者和健康人下呼吸道菌群的構(gòu)成差異，開(kāi)啟了對(duì)下呼吸道菌群的研究。由于近年來(lái)研究腸道菌群的作用在腫瘤免疫治療領(lǐng)域取得了引人注目的成就，一些研究開(kāi)始著眼于呼吸道菌群對(duì)于肺癌發(fā)生、發(fā)展和治療的影響。同時(shí)，在泛癌種中針對(duì)腫瘤內(nèi)菌群的研究[2]又一次引發(fā)了人們對(duì)于微生物與腫瘤之間關(guān)系的思考。鑒于腫瘤內(nèi)微生物與其所處的器官環(huán)境中的微生物種群高度相關(guān)卻又存在差異，本文將立足于呼吸道菌群和與其息息相關(guān)的肺癌內(nèi)菌群，總結(jié)二者的特點(diǎn)和在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，并展示其臨床應(yīng)用前景。此外，本文也將整理目前肺部菌群研究中樣本收集、測(cè)序和污染控制的要點(diǎn)，從而更好地評(píng)估各研究結(jié)論中可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果，體現(xiàn)微生物測(cè)序在臨床樣本中應(yīng)用的進(jìn)展和局限性。

1 下呼吸道菌群的特點(diǎn)

在下呼吸道中，細(xì)菌數(shù)量自上而下逐漸遞減；相比于上呼吸道，其細(xì)菌負(fù)荷低100-10,000倍，肺內(nèi)每平方厘米可檢測(cè)到約2200個(gè)細(xì)菌基因組，每克肺組織有103-105個(gè)細(xì)菌[3-7]。這種低負(fù)荷緣于下呼吸道更深的解剖位置、黏膜-纖毛清潔機(jī)制、低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境以及肺內(nèi)的表面活性劑和抑菌液層[8]。下呼吸道菌群的構(gòu)成與上呼吸道一致，因此可以推測(cè)其主要來(lái)源是上呼吸道的微吸入物質(zhì)，主要的細(xì)菌種群為擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）[3,8]。普雷沃氏菌屬（Prevotella）、鏈球菌屬（Streptococcus）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）、奈瑟菌屬（Neisseria）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）和梭桿菌屬（Fusobacterium）是健康人肺內(nèi)豐度最高的菌屬[5]。肺內(nèi)菌群的具體構(gòu)成會(huì)因被采樣者的生活環(huán)境、生活習(xí)慣、氣候、環(huán)境污染水平甚至飼養(yǎng)寵物類(lèi)別而異，因此各研究不具有統(tǒng)一結(jié)論[9]。

影響肺內(nèi)微生物動(dòng)態(tài)平衡有3個(gè)因素：遷入、清除、不同菌種的相對(duì)增殖速度（往往由局部生長(zhǎng)條件決定）[10]。這3個(gè)因素的改變會(huì)引起下呼吸道短暫或持續(xù)的菌群失調(diào)，如胃食管功能障礙或反流會(huì)增加細(xì)菌的遷入，吸煙或慢性支氣管炎導(dǎo)致黏膜清除細(xì)菌的能力降低，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的局部生長(zhǎng)條件改變可能會(huì)造成該區(qū)域菌種差異性增殖。肺部疾病是影響菌群失調(diào)的最重要的始動(dòng)原因，氣道的炎癥導(dǎo)致黏液、血漿滲出增加，從而制造出營(yíng)養(yǎng)更豐富、溫度更高和缺氧的微環(huán)境；同時(shí)炎性細(xì)胞因子還會(huì)促進(jìn)特定菌種生長(zhǎng)，活化的免疫細(xì)胞對(duì)各菌種也有不一致的殺傷效果。這些效應(yīng)最終造成了菌群的選擇性生長(zhǎng)，而這些生長(zhǎng)的菌群會(huì)通過(guò)其病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern,PAMP）和代謝物進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)[10]。這種自我放大的正反饋回路可能導(dǎo)致呼吸道微環(huán)境的永久改變以及微生物的永久性紊亂。

2 下呼吸道菌群與肺癌的關(guān)系

相對(duì)于健康人，肺癌患者下呼吸道菌群的豐富度降低，優(yōu)勢(shì)屬為Prevotella（20%）、Streptococcus（12%）和Veillonella（8%）[11,12]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）的下呼吸道菌群之間存在顯著的組成差異。晚期肺癌患者下呼吸道菌群比早期患者更接近于口腔的菌群組成[4,12]。同樣，生存不佳的患者相比于長(zhǎng)生存期患者，其下呼吸道樣本微生物的構(gòu)成也與口腔樣本更相似。上、下呼吸道微生物組成越相似，進(jìn)展的可能性越大，這種紊亂菌群的特征與預(yù)后之間存在的關(guān)系可能與白細(xì)胞介素17（interleukin 17,IL-17）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K）、有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）等通路上調(diào)有關(guān)[4]。

下呼吸道菌群紊亂與腫瘤發(fā)展的因果關(guān)系也在探索中。紊亂的下呼吸道菌群可能通過(guò)其對(duì)炎癥-增殖信號(hào)的激活、與免疫細(xì)胞的相互作用以及代謝物或毒素促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[13]。暴露于Veillonella、Prevotella和Streptococcus的A549細(xì)胞系ERK和PI3K通路顯著上調(diào)[13]。細(xì)菌的配體會(huì)上調(diào)IL-1β和IL-23的水平，激活并擴(kuò)增Th17和γδT細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥出現(xiàn)并促進(jìn)腫瘤發(fā)生[14]。在KP腫瘤小鼠模型中，Veillonella的引入使小鼠生存降低、體重減輕、腫瘤負(fù)荷增加，同時(shí)腫瘤內(nèi)招募了更多的Th17細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，IL-17水平升高[4]。而使用抗生素或益生菌［鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG）或雙歧桿菌（Bifidobacterium）］霧化吸入來(lái)改變肺內(nèi)免疫抑制性微環(huán)境，可以顯著降低小鼠腫瘤細(xì)胞靜脈注射后成瘤的數(shù)量，并可以增加抗腫瘤藥物治療的療效[15]。因此，下呼吸道菌群具有促進(jìn)和抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的雙面作用。肺微生物組既可以抵抗致病性病原的增殖，也可以在肺免疫抑制性微環(huán)境的形成中起到重要作用[15]。

3 腫瘤內(nèi)細(xì)菌和肺癌內(nèi)細(xì)菌的特點(diǎn)

關(guān)于腫瘤內(nèi)細(xì)菌特點(diǎn)的研究往往在泛癌種中進(jìn)行，近年來(lái)也開(kāi)始關(guān)注肺癌（表1）。癌癥基因組圖譜計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas Program,TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)的6.4×1012條測(cè)序的短讀序列中，7.2%為非人類(lèi)數(shù)據(jù)；在這些非人類(lèi)數(shù)據(jù)中35.2%為細(xì)菌、古菌或病毒的遺傳序列[16]。腫瘤內(nèi)細(xì)菌豐度很低，僅0.1%-10%腫瘤細(xì)胞中存在細(xì)菌[17]。16S rRNA測(cè)序結(jié)果表明腫瘤內(nèi)既存在革蘭氏染色陽(yáng)性（G+）菌，也存在革蘭氏染色陰性（G-）菌，主要以胞內(nèi)菌形式存在于腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞內(nèi)，且一般定位在細(xì)胞質(zhì)中[2]。在肺癌中，癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌負(fù)荷最高，顯著高于各種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)[18]。胞內(nèi)菌可能改變自己的包裝方式，進(jìn)化為細(xì)胞壁缺乏型細(xì)菌（類(lèi)似于L型細(xì)菌），具有高度可變的大小和形狀[2]。

表1 肺癌內(nèi)菌群相關(guān)研究及主要發(fā)現(xiàn)Tab 1 Research on the bacteria in lung cancer and main findings

一般來(lái)說(shuō)，腫瘤內(nèi)菌群的生物多樣性低于其對(duì)應(yīng)的正常組織，這暗示腫瘤可能會(huì)因?yàn)槠洫?dú)特的微環(huán)境選擇性擴(kuò)展某些細(xì)菌種群[17]。在進(jìn)行肺癌組織與癌旁正常肺組織的菌群豐富度和多樣性比較時(shí)，各研究[18-20]的結(jié)論不一致。腫瘤內(nèi)的菌群主要來(lái)源于其所處的器官。肺癌組織或癌旁肺組織中菌群多樣性顯著低于唾液和支氣管灌洗液樣本，這些肺癌內(nèi)部的細(xì)菌可能來(lái)源于附近的小氣道[19]。同時(shí)這些菌群也可能來(lái)自于血液循環(huán)系統(tǒng)（如一些來(lái)自于腸道的細(xì)菌），例如相比于正常肺組織，肺癌組織中存在更多腸道細(xì)菌和一些潛在病原體[21,22]。腫瘤的血管系統(tǒng)高度混亂、內(nèi)皮連接不完整以及部分血管為盲端血管的特點(diǎn)導(dǎo)致了其高滲透性和血流緩慢的特征，加之腫瘤內(nèi)免疫抑制的微環(huán)境，使腫瘤可能會(huì)為血液循環(huán)中的細(xì)菌提供庇護(hù)所[23]。

不同癌種，甚至是不同基因型或表型腫瘤中的細(xì)菌組成也有所不同。肺腺癌中的細(xì)菌負(fù)荷高于肺鱗癌，瘤內(nèi)菌群組成也不一致[18]。如肺腺癌中棲熱菌屬（Thermus）相對(duì)豐度比肺鱗癌更高，而羅爾斯通菌屬（Ralstonia）和噬酸菌屬（Acidovorax）更低[21,24]。在肺鱗癌中，Acidovorax在吸煙者或TP53突變患者中豐度更高[21]。

腫瘤所處的微環(huán)境影響其內(nèi)部微生物種群的組成以及富集代謝通路。吸煙患者NSCLC病灶中的細(xì)菌顯著富集了一些降解香煙中化學(xué)物質(zhì)的代謝通路，以及一些植物代謝通路（可能來(lái)源于煙草中的植物相關(guān)細(xì)菌）[2]。不吸煙者肺癌中的細(xì)菌負(fù)荷高于吸煙者，可能是因?yàn)槲鼰熕茉炝司植康目咕h(huán)境[18]。

腫瘤內(nèi)菌群不僅是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的“果”，也起到促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的“因”的作用[17]。腫瘤內(nèi)菌群或菌體成分可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的干性、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、黏附程序和機(jī)械壓力反應(yīng)程序促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[25-29]。CTNNB1（涉及Wnt/β-catenin通路）、HIF1A（涉及缺氧）和VEGFA（涉及血管生成）等基因表達(dá)水平與肺癌內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷呈正相關(guān)；而TP73（涉及細(xì)胞周期）和TLR5（涉及模式識(shí)別）與肺癌內(nèi)菌群負(fù)荷呈負(fù)相關(guān)。一些涉及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的基因表達(dá)水平與肺癌內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷存在相關(guān)關(guān)系，暗示肺癌內(nèi)細(xì)菌可能有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的能力[18]。此外，被細(xì)菌感染腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)外泌體激活其他細(xì)胞的Wnt/β-catenin等通路，因此沒(méi)有被細(xì)菌寄生的腫瘤細(xì)胞也能受到細(xì)菌的影響[30]。

4 下呼吸道菌群/肺癌內(nèi)菌群在臨床上的應(yīng)用方向

4.1 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分層與生存預(yù)測(cè) 肺癌患者正常肺組織中更高的細(xì)菌豐富度和多樣性、更高豐度的毛螺菌科（Lachnospiraceae）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和羅斯氏菌（Roseburia）與更差的預(yù)后相關(guān)，而更高豐度的科里氏菌科（Koribacteraceae）卻預(yù)示著更好的預(yù)后[20]。

在I期肺癌患者中，復(fù)發(fā)患者術(shù)前唾液中代爾夫特菌屬（Delftia）豐度更高而B(niǎo)ifidobacterium豐度更低、腫瘤組織中葡萄球菌屬（Staphylococcus）更多而芽孢桿菌屬（Bacillus）和厭氧芽胞桿菌屬（Anaerobacillus）更少。利用術(shù)前支氣管肺泡灌洗液對(duì)呼吸道菌群進(jìn)行評(píng)估是預(yù)測(cè)早期肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的合適樣本形式[19]。而IIIB-IV期肺癌患者上、下呼吸道微生物組成越相似，進(jìn)展的可能性越大。相比于完全緩解（complete response,CR）或部分緩解（partial response,PR）的患者，腫瘤進(jìn)展患者的下呼吸道菌群富集Veillonella、Streptococcus、Prevotella和羅氏菌屬（Rothia）[4]。

4.2 腫瘤治療 目前很少有下呼吸道菌群與免疫治療效果相關(guān)的研究，但在腸道菌群領(lǐng)域的相關(guān)研究可以提供思路。2018年，Routy等[31]發(fā)現(xiàn)抗生素影響免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）的臨床獲益，對(duì)ICIs響應(yīng)和不響應(yīng)的晚期NSCLC患者的腸道細(xì)菌組成具有差異。腸道無(wú)菌荷瘤小鼠在移植對(duì)ICIs響應(yīng)者的糞便微生物后可以增強(qiáng)對(duì)ICIs的敏感性[31-33]。

肺內(nèi)菌群與腸道菌群有很多相似處，例如二者都與外界環(huán)境溝通且存在黏膜免疫系統(tǒng)[34]。有些學(xué)者[35]提出“腸-肺”軸的假設(shè)，希望能將兩個(gè)微生物組進(jìn)行聯(lián)系。事實(shí)上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有證據(jù)[9]提示腸、肺微生物組可能具有直接或間接的交互作用。兩個(gè)微生物組之間的直接交互在于在解剖結(jié)構(gòu)上二者便有相互溝通的可能性。肺內(nèi)的自然清掃機(jī)制可以將肺內(nèi)細(xì)菌排入腸道，而胃內(nèi)容物的微吸入則有可能使腸道細(xì)菌進(jìn)入肺內(nèi)。同時(shí)，腸道菌群可以通過(guò)PAMPs調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化、活化、分泌細(xì)胞因子，這些細(xì)胞或物質(zhì)可以通過(guò)黏膜淋巴管和血液循環(huán)影響到呼吸道黏膜，間接影響肺黏膜的炎癥環(huán)境與菌群構(gòu)成[8]。

對(duì)ICIs響應(yīng)者和無(wú)響應(yīng)者的腸菌對(duì)比研究[8]的結(jié)果有兩個(gè)共性：響應(yīng)者腸道細(xì)菌多樣性更高，以及響應(yīng)者腸道菌以厚壁菌為主導(dǎo)。這些對(duì)ICIs響應(yīng)的腫瘤內(nèi)體現(xiàn)為CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)增加、骨髓來(lái)源抑制性細(xì)胞（myeloid derived suppressor cells,MDSCs）浸潤(rùn)減少和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells,Tregs）浸潤(rùn)減少。有趣的是，Le等[15]發(fā)現(xiàn)利用霧化吸入抗生素來(lái)改變下呼吸道菌群組成的小鼠的肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量顯著減少，且腫瘤內(nèi)產(chǎn)生IL-10的Tregs減少、自然殺傷（natural killer,NK）細(xì)胞活性增強(qiáng)。小鼠霧化吸入Lactobacillus rhamnosus GG后，樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells,DC）和NK細(xì)胞活性上調(diào)，M2相關(guān)基因Il10、Ido和Irf4表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor β,TGF-β）和前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）表達(dá)有下調(diào)趨勢(shì)；而M1相關(guān)標(biāo)志IL-12和干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory factor 5,IRF5）顯著上調(diào)。霧化吸入Lactobacillus rhamnosus GG或Bifidobacterium還可以顯著增強(qiáng)抗腫瘤藥物的作用。這些結(jié)果提示了與腸道菌群相似，肺內(nèi)菌群也有希望成為未來(lái)增強(qiáng)抗腫瘤治療的輔助靶點(diǎn)。

4.3 液體活檢 血液樣本中的血液微生物DNA（blood-based microbial DNA,mbDNA）可以提供腫瘤的信息，識(shí)別早期腫瘤，并可以實(shí)現(xiàn)將一種癌種與其他癌種進(jìn)行區(qū)分?；跀?shù)據(jù)庫(kù)中泛癌種患者血液和腫瘤組織中微生物組的基因信息，可以通過(guò)檢測(cè)mbDNA將肺癌患者與健康人或其他癌種（如前列腺癌）患者鑒別出來(lái)[16]。

5 研究下呼吸道菌群/肺癌內(nèi)菌群的相關(guān)技術(shù)

5.1 樣本采集 常選取的標(biāo)本形式有口腔刷取組織、支氣管刷取組織、支氣管肺泡灌洗液、手術(shù)切除樣本和呼出氣冷凝物[36]。

有研究[37]在探索肺支氣管菌群與肺癌的關(guān)系時(shí)提出應(yīng)該選擇腫瘤另一側(cè)肺的支氣管進(jìn)行取樣，以減少腫瘤堵塞導(dǎo)致下呼吸道微生物變化的影響；也有研究[11]在鄰近腫瘤的段支氣管中取材。在取癌旁正常組織作為腫瘤內(nèi)菌群對(duì)照時(shí)，應(yīng)注意盡量靠近腫瘤取材，避免因支氣管等級(jí)不相同而帶來(lái)的固有的菌群差異。

5.2 測(cè)序技術(shù) 16S rRNA測(cè)序是目前應(yīng)用最廣泛的研究下呼吸道/肺癌內(nèi)菌群的檢測(cè)方法。16S rRNA片段包含9個(gè)高變區(qū)（V1-V9）以及在細(xì)菌中高度保守的區(qū)域。其中，V4區(qū)域特異性好，是進(jìn)行細(xì)菌注釋和多樣性分析的最佳選擇[38]。而Nejman等[2]對(duì)16S rRNA基因上的5個(gè)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，相對(duì)于一般的V4或V3-V4擴(kuò)增檢測(cè)方法提高了覆蓋范圍和分辨度。

5.3 污染控制 避免污染是研究腫瘤菌群的關(guān)鍵思想。由于下呼吸道內(nèi)和腫瘤內(nèi)的微生物含量極少，輕微的污染即可導(dǎo)致顯著的差異性結(jié)果。應(yīng)建立較為全面的無(wú)菌取樣流程，盡量避免實(shí)驗(yàn)室前污染，如從待檢測(cè)樣本石蠟塊邊緣取純石蠟進(jìn)行對(duì)照測(cè)序。同時(shí)應(yīng)避免實(shí)驗(yàn)室污染，在DNA提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增過(guò)程中設(shè)置陰性對(duì)照[2]。最后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行恰當(dāng)處理也能有效減少污染的干擾。

6 總結(jié)

由于腫瘤周邊及腫瘤內(nèi)存在獨(dú)特的解剖學(xué)、生理學(xué)和免疫學(xué)環(huán)境，細(xì)菌需要發(fā)展出與腫瘤微環(huán)境相匹配的功能學(xué)特征，形成了獨(dú)特的微生物種群。這些獨(dú)特的微生物又通過(guò)活化各種促炎及促增殖的信號(hào)通路影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前的研究多關(guān)注下呼吸道菌群/肺癌內(nèi)菌群在肺癌患者和健康人、肺癌組織和正常肺組織之間的差異，然而各研究結(jié)果并沒(méi)有得到統(tǒng)一的差異菌群，這是因?yàn)橄潞粑谰?肺癌內(nèi)菌群受到地區(qū)環(huán)境、空氣污染以及個(gè)體遺傳等條件的影響較大。因此相對(duì)于試圖描繪出具體的差異細(xì)菌種系，更好的方向是聚焦于這些差異細(xì)菌富集的功能及代謝通路是否具有一致性，從功能學(xué)的角度來(lái)分析腫瘤內(nèi)細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)和其可能對(duì)腫瘤發(fā)展造成的影響。

從轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的角度上說(shuō)，肺癌內(nèi)獨(dú)特細(xì)菌種群可以將自己的DNA釋放入血液系統(tǒng)，基于具有全血樣本基因信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以對(duì)肺癌患者進(jìn)行早期鑒別，對(duì)于缺少關(guān)鍵基因突變的肺癌尤其具有意義。在肺癌的治療中，通過(guò)霧化吸入抗生素或細(xì)菌，可以便捷并有效地調(diào)控呼吸道菌群的分布，而且不會(huì)輕易改變?nèi)砭河绕涫悄c道菌群的組成，有效提高治療效果。此外，檢測(cè)下呼吸道中以Veillonella為代表的口腔定殖菌群可以預(yù)測(cè)肺癌患者復(fù)發(fā)或進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。下呼吸道菌群在免疫治療療效的預(yù)測(cè)上更是具有前景。然而，由于下呼吸道菌群/肺癌內(nèi)菌群極低的豐富度，污染對(duì)于肺部菌群研究和臨床應(yīng)用是致命的，如何科學(xué)地取樣以及控制測(cè)序過(guò)程中的污染將是肺部菌群研究的關(guān)鍵。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.