賀文娟 劉立

在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率和死亡率正在不斷上升，調(diào)查顯示，2020年肺癌新發(fā)病例和死亡病例分別約為82和72萬(wàn)例，位居所有癌癥的首位[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是最常見(jiàn)的肺癌亞型，約占肺癌病例的85%以上，其惡性程度高，預(yù)后差，患者的5年生存率僅為15%[2]。臨床對(duì)NSCLC的治療主要有手術(shù)切除、化療和放療等方式，而對(duì)于晚期NSCLC患者主要采取化療方式。奧西替尼（Osimertinib,OSM）是第三代表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs），其被應(yīng)用于晚期NSCLC的靶向治療，具有較好的治療效果[3,4]。但若長(zhǎng)期連續(xù)使用OSM，患者對(duì)OSM的敏感性將大幅降低，這限制了NSCLC的治療效果[5]。OSM的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，目前的研究還不深入，因此，探究OSM新的耐藥機(jī)制，將有助于制定有針對(duì)性的治療手段，從而有效解決耐藥問(wèn)題。雙特異性磷酸酶1（dual specificity phosphatase 1,DUSP1）是MKP磷酸酶家族的重要成員，能廣泛參與機(jī)體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，主要通過(guò)水解滅活絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）家族成員發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[6,7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)DUSP1參與了多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，高表達(dá)的DUSP1可以促進(jìn)NSCLC血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，目前關(guān)于DUSP1甲基化與OSM耐藥性關(guān)系的研究，還鮮有報(bào)道。葉酸（folic acid,FA）是一種可溶膳食性維生素，參與細(xì)胞的DNA甲基化、合成和修復(fù)，F(xiàn)A缺乏或代謝異?？蓪?dǎo)致DNA低甲基化，進(jìn)而引起腫瘤或其他疾病的發(fā)生[9,10]。但FA在NSCLC組織或細(xì)胞中對(duì)DUSP1的調(diào)節(jié)作用和對(duì)OSM耐藥性的影響未見(jiàn)報(bào)道。地西他濱（Decitabine,DAC）是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，其觸發(fā)去甲基化導(dǎo)致體外和體內(nèi)表觀遺傳沉默的腫瘤抑制基因的連續(xù)再激活。本研究建立OSM耐藥細(xì)胞株P(guān)C9R，探究FA調(diào)控DUSP1甲基化對(duì)PC9R細(xì)胞OSM耐藥性的影響。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞 NSCLC OSM敏感細(xì)胞株P(guān)C9購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑 FA（貨號(hào)：F8758）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；OSM（貨號(hào)：128830）購(gòu)自瑞典AstraZeneca AB公司；DAC（國(guó)藥準(zhǔn)字H20140050）購(gòu)自齊魯制藥公司；CCK-8試劑盒（貨號(hào)：CK04）購(gòu)自日本東仁化學(xué)科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：556507）購(gòu)自美國(guó)BD生物科學(xué)有限公司；Transwell小室（貨號(hào)：3450）購(gòu)自Corning公司；BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：PC0020）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：RR036A）購(gòu)自日本Takara公司；Trizol試劑（貨號(hào)：15596018）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；EZ DNA Methylation-GoldTMKit（貨號(hào)：D5005）購(gòu)自ZYMO Research公司；DUSP1（貨號(hào)：ab61201）、p38 MAPK（ab182453）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）（貨號(hào)：ab184699）、p-ERK（貨號(hào)：ab201015）、GAPDH（貨號(hào)：ab9485）一抗及其二抗（貨號(hào)：ab6721）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 PC9R細(xì)胞株的建立 采用濃度梯度遞增法建立OSM耐藥的NSCLC耐藥細(xì)胞株P(guān)C9R[11]。

1.4 細(xì)胞分組與處理 將PC9R細(xì)胞分為對(duì)照組、OSM組（5 μmol/L OSM）、FA組（600 nmol/L FA）、甲基化抑制劑DAC組（10 μmol/L DAC）、FA+OSM組（600 nmol/L FA+5 μmol/L OSM）和FA+OSM+DAC組（600 nmol/L FA+5 μmol/L OSM+10 μmol/L DAC）。細(xì)胞分組后加入相應(yīng)濃度藥物進(jìn)行處理。

1.5 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖 于96孔板中接種PC9R細(xì)胞（5×103個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h后按1.4所述加入相應(yīng)濃度藥物，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。置含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，加入CCK-8溶液（10 μL/孔），培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 于6孔板中接種PC9R細(xì)胞（2×105個(gè)/孔），并按1.4方法進(jìn)行處理。培養(yǎng)24 h后，用200 μL無(wú)菌移液槍槍頭在各孔垂直畫(huà)出一道劃痕，之后用無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞。加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別于0和48 h時(shí)用倒置顯微鏡觀察并拍照，用Image J軟件分析計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。劃痕愈合率=（1-48 h的面積/0 h的面積）×100%。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 收集1.4中的各組細(xì)胞，于Transwell小室上室（基質(zhì)膠包被）中接種細(xì)胞（3×105個(gè)/孔）。將600 μL完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）加入下室，孵育24 h后，將穿膜細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色15 min。光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將PC9R細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后按1.4方法進(jìn)行處理。培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，于離心管中加入1×106個(gè)細(xì)胞，并加入Binding Buffer（500 μL）懸浮細(xì)胞，于室溫下分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI避光反應(yīng)15 min。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）法測(cè)定細(xì)胞DUSP1mRNA表達(dá) Trizol試劑提取各組PC9R 細(xì)胞總R NA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列設(shè)計(jì)如下：DUSP1上游引物：5’-GAGCTGTGCAGCAAACAGTC-3’，下游引物：5’-GTCTGCCTTGTGGTTGTCCT-3’；β-actin上游引物：5’-CCCTGGCACCCAGCAC-3’，下游引物：5’-GCCGATCCACACGGAGTAC-3’。用2-ΔΔCt方法計(jì)算DUSP1mRNA的相對(duì)表達(dá)，β-actin為內(nèi)參。

1.10 甲基化特異性PCR（methylation specific PCR,MSP）檢測(cè)細(xì)胞中DUSP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài) 提取各組細(xì)胞DNA，各取1 μg進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。MSP的反應(yīng)體系為20 μL，正向引物：5’-TGTTTGGTAGGGCGGGTGA-3’，反向引物：5’-GTCGCACACAACCCAAATA-3’。PCR產(chǎn)物（范圍=chr5:172198165-172198336，171 bp）位于DUSP1啟動(dòng)子和外顯子1邊界的CpG島IV上。反應(yīng)條件為：95oC 5 min，95oC 15 s，58oC 15 s，72oC 15 s，循環(huán)35次，72oC 10 min。取各組擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用BioQ軟件分析甲基化程度。

臺(tái)灣對(duì)大陸的農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易對(duì)島內(nèi)的皮革、漁產(chǎn)、農(nóng)事服務(wù)、屠宰生肉及副產(chǎn)品、石油煉制品、原油及天然氣礦產(chǎn)、批發(fā)、飼料、雜糧農(nóng)作物、稻谷和水果等產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)效果和附加價(jià)值GDP效果顯著，即對(duì)上述產(chǎn)業(yè)的拉動(dòng)作用較強(qiáng)。比較典型的如石油煉制品，雖然其沒(méi)有直接地促進(jìn)貿(mào)易增加值，但其2011年的生產(chǎn)效果和附加價(jià)值GDP效果分別達(dá)9708.89萬(wàn)美元和861.77萬(wàn)美元(見(jiàn)表6)，這說(shuō)明農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易對(duì)石油煉制品有明顯的間接拉動(dòng)效果，兩岸貿(mào)易有力地促進(jìn)了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1.11 Western blot分析各組細(xì)胞DUSP1蛋白、MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC9R細(xì)胞按上述的1.4處理。收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)總蛋白濃度進(jìn)行定量。取20 μg蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜1.5 h，4oC搖床上與5%脫脂牛奶封閉2 h。4oC下加入DUSP1（1:1000）、p38 MAPK（1:1000）、p-ERK（1:1000）、ERK（1:1000）、GAPDH（1:1000）一抗孵育24 h。于室溫下加入相應(yīng)二抗（1:5000）孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參。進(jìn)行曝光并拍照，采用Image Lab軟件對(duì)目標(biāo)蛋白的灰度值進(jìn)行定量分析。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析 本研究用Graph Pad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)用于多組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FA對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響 如圖1所示，與對(duì)照組相比，OSM組細(xì)胞OD450值（48、72 h）顯著下降（P＜0.05），F(xiàn)A組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），DAC組細(xì)胞OD450值（48、72 h）顯著上升（P＜0.05）。與OSM組相比，F(xiàn)A+OSM組細(xì)胞OD450值（48、72 h）顯著下降（P＜0.05）。與FA+OSM組相比，F(xiàn)A+OSM+DAC組細(xì)胞OD450值（48、72 h）顯著上升（P＜0.05）。

圖1 FA對(duì)PC9R細(xì)胞增殖能力的影響Fig 1 Effect of FA on cell proliferation activity of PC9R cells.FA: folic acid;DAC: Decitabine;OSM: Osimertinib.

2.2 FA對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 如圖2所示，與對(duì)照組相比，OSM組細(xì)胞劃痕愈合率顯著下降（P＜0.05），DAC組細(xì)胞劃痕愈合率顯著上升（P＜0.05）。與OSM 組相比，F(xiàn)A+OSM組細(xì)胞劃痕愈合率顯著下降（P＜0.05）。與FA+OSM組相比，F(xiàn)A+OSM+DAC組細(xì)胞劃痕愈合率顯著上升（P＜0.05）。

圖2 FA對(duì)PC9R細(xì)胞遷移能力的影響（劃痕實(shí)驗(yàn)）。與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與OSM組相比，#P＜0.05；與FA+OSM組相比，&P＜0.05。Fig 2 Effect of FA on migration ability of PC9R cells (scratch test).Compared with Control group,*P＜0.05;Compared with OSM group,#P＜0.05;Compared with FA+OSM group,&P＜0.05.

2.3 FA對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 如圖3所示，與對(duì)照組相比，OSM組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著下降（P＜0.05），F(xiàn)A組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），DAC組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著上升（P＜0.05）。與OSM組相比，F(xiàn)A+OSM組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著下降（P＜0.05）。與FA+OSM組相比，F(xiàn)A+OSM+DAC組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著上升（P＜0.05）。

圖3 FA對(duì)PC9R細(xì)胞侵襲能力的影響（Transwell實(shí)驗(yàn)）。與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與OSM組相比，#P＜0.05；與FA+OSM組相比，&P＜0.05。Fig 3 Effect of FA on the invasion ability of PC9R cells (Transwell experiment).Compared with Control group,*P＜0.05;Compared with OSM group,#P＜0.05;Compared with FA+OSM group,&P＜0.05.

2.4 FA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 如圖4所示，與對(duì)照組相比，OSM組細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.05），DAC組細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜0.05）。與OSM組相比，F(xiàn)A+OSM組細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.05）。與FA+OSM組相比，F(xiàn)A+OSM+DAC組細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜0.05）。

圖4 FA對(duì)PC9R細(xì)胞凋亡的影響。與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與OSM組相比，#P＜0.05；與FA+OSM組相比，&P＜0.05。Fig 4 Effect of FA on apoptosis of PC9R cells.Compared with Control group,*P＜0.05;Compared with OSM group,#P＜0.05;Compared with FA+OSM group,&P＜0.05.

圖5 各組PC9R細(xì)胞DUSP1 mRNA表達(dá)比較。與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與OSM組相比，#P＜0.05；與FA+OSM組相比，&P＜0.05。Fig 5 Comparison of DUSP1 mRNA expression in PC9R cells in each group.Compared with Control group,*P＜0.05;Compared with OSM group,#P＜0.05;Compared with FA+OSM group,&P＜0.05.DUSP1: dual specificity phosphatase 1.

2.6 FA對(duì)DUSP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的影響 如圖6所示，與對(duì)照組相比，OSM組細(xì)胞DUSP1甲基化水平顯著上升（P＜0.05），F(xiàn)A組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），DAC組細(xì)胞DUSP1甲基化水平顯著下降（P＜0.05）。與OSM組相比，F(xiàn)A+OSM組細(xì)胞DUSP1甲基化水平顯著升高（P＜0.05）。與FA+OSM組相比，F(xiàn)A+OSM+DAC組細(xì)胞DUSP1甲基化水平顯著下降（P＜0.05）。

圖6 MSP檢測(cè)PC9R細(xì)胞DUSP1甲基化狀態(tài)。與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與OSM組相比，#P＜0.05；與FA+OSM組相比，&P＜0.05。Fig 6 MSP detected DUSP1 methylation status in PC9R cells.Compared with Control group,*P＜0.05;Compared with OSM group,#P＜0.05;Compared with FA+OSM group,&P＜0.05.MSP: methylation specific polymerase chain reaction.

2.7 FA對(duì)細(xì)胞DUSP1蛋白、DUSP1下游MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響 如圖7所示，與對(duì)照組相比，OSM組細(xì)胞DUSP1蛋白表達(dá)顯著下降，p38 MAPK蛋白、ERK磷酸化水平顯著上升（均P＜0.05）；FA組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；DAC組細(xì)胞DUSP1蛋白表達(dá)顯著上升，p38 MAPK蛋白、ERK磷酸化水平顯著下降（均P＜0.05）。與OSM組相比，F(xiàn)A+OSM組細(xì)胞DUSP1蛋白表達(dá)顯著下降，p38 MAPK蛋白、ERK磷酸化水平顯著上升（均P＜0.05）。與FA+OSM組相比，F(xiàn)A+OSM+DAC組細(xì)胞DUSP1蛋白表達(dá)顯著上升，p38 MAPK蛋白、ERK磷酸化水平顯著下降（均P＜0.05）。

圖7 FA對(duì)細(xì)胞DUSP1蛋白、DUSP1下游MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響。與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與OSM組相比，#P＜0.05；與FA+OSM組相比，&P＜0.05。Fig 7 Effects of FA on the expression levels of DUSP1 protein and key proteins of DUSP1 downstream MAPK signaling pathway.Compared with Control group,*P＜0.05;Compared with OSM group,#P＜0.05;Compared with FA+OSM group,&P＜0.05.p38 MAPK: p38 mitogen-activated protein kinase;ERK: extracellular regulated protein kinases;p-ERK: phosphorylated ERK;GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

3 討論

NSCLC是一種發(fā)病率和死亡率逐年上升的惡性腫瘤疾病，發(fā)病前期確診較困難，一般發(fā)現(xiàn)時(shí)患者已處于中晚期，給治療帶來(lái)較大的阻礙[12,13]。NSCLC的發(fā)病原因主要有環(huán)境因素、吸煙、職業(yè)暴露、輻射、既往肺部感染、遺傳等，其中吸煙是引起NSCLC的最主要原因[14,15]。OSM是治療NSCLC的一線藥物，是一種靶向治療藥物，約50%的NSCLC患者存在EGFR突變，OSM可以有效延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但存在OSM耐藥性問(wèn)題，長(zhǎng)期使用OSM會(huì)使OSM的療效明顯下降[16,17]。因此，本研究通過(guò)建立OSM耐藥細(xì)胞株P(guān)C9R，探究FA對(duì)PC9R細(xì)胞OSM耐藥性的影響。

DUSP1是本研究組前期通過(guò)建立兩種NSCLC OSM耐藥細(xì)胞株（PC9R、H1975R），并通過(guò)高通量基因芯片分析了差異化基因表達(dá)譜所發(fā)現(xiàn)的基因。研究[18-20]發(fā)現(xiàn)，DUSP1可以參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，其在晚期乳腺癌、NSCLC、胰腺癌中的表達(dá)水平顯著升高。Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn)DUSP1的異位表達(dá)可以通過(guò)影響ERK信號(hào)通路而增加化療藥物吉非替尼敏感性。Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)DUSP1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)受其啟動(dòng)子甲基化調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，敏感株中抑制DUSP1甲基化可增強(qiáng)其表達(dá)，并減弱OSM對(duì)敏感株的殺傷力。

FA是一種水溶性B族維生素，在體內(nèi)以四氫葉酸的形式存在。四氫葉酸可以用于嘌呤、胸苷酸的合成以及蛋氨酸循環(huán)途徑中同型半胱氨酸的甲基化[23]。在腫瘤發(fā)生的早期，DNA甲基化水平降低，局部CpG島甲基化程度升高，廣泛調(diào)控原癌基因和抑癌基因的表達(dá)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[24]。張銀鈴等[25]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的FA可以提高卵巢癌細(xì)胞OV90基因組的甲基化水平，對(duì)其生長(zhǎng)具有一定抑制作用。通過(guò)檢索DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)FA在小鼠肌肉組織中可增強(qiáng)DUSP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化而減弱其表達(dá)[26]。本研究結(jié)果顯示，與OSM組相比，F(xiàn)A+OSM組細(xì)胞OD450值（48、72 h）、劃痕愈合率、細(xì)胞侵襲數(shù)目、DUSP1水平顯著下降，細(xì)胞凋亡率、DUSP1甲基化水平、p38 MAPK蛋白表達(dá)、ERK磷酸化水平顯著升高。與FA+OSM組相比，F(xiàn)A+OSM+DAC組細(xì)胞OD450值（48、72 h）、劃痕愈合率、細(xì)胞侵襲數(shù)目、DUSP1水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率、DUSP1甲基化水平、p38 MAPK蛋白表達(dá)、ERK磷酸化水平顯著降低。這說(shuō)明FA與OSM聯(lián)用可能通過(guò)增強(qiáng)DUSP1甲基化抑制DUSP1表達(dá)，調(diào)控下游MAPK信號(hào)通路，抑制NSCLC細(xì)胞OSM耐藥性。

綜上所述，F(xiàn)A與OSM聯(lián)用可能通過(guò)增強(qiáng)DUSP1甲基化抑制DUSP1表達(dá)，抑制NSCLC細(xì)胞OSM耐藥性。本研究為臨床治療中改善NSCLC患者化療耐藥性提供了科學(xué)依據(jù)和參考。但本研究是在細(xì)胞水平上進(jìn)行的分析，還需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)及臨床試驗(yàn)的深入探索。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Liu L conceived the project and supervised the experiments.He WJ conducted the experiments and performed the data analysis.Both the authors read and approved the final manuscript.