雷 蕾, 夏桂玲, 李 璐, 胡鱗方, 袁 露, 楊 輝

貴州省人民醫(yī)院 1干部醫(yī)療科/老年醫(yī)學(xué)科 2藥劑科,貴陽(yáng) 550002

急性心肌梗死等缺血性心肌病具有高發(fā)病率與高死亡率,嚴(yán)重威脅患者生命安全。心肌細(xì)胞損傷、心室重構(gòu)等均可能引起急性心肌梗死[1-2]。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)屬于新型的非編碼RNA,由前體mRNA反向剪接生成共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu),其與線性RNA不同,它具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)不易被RNase R降解。研究表明circRNA與急性心肌梗死等多種心血管疾病有關(guān)[3-4]。circ_0038467在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞損傷中表達(dá)上調(diào),沉默其表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[5]。但circ_0038467與急性心肌梗死等心血管疾病的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。生物信息學(xué)分析顯示miR-495是circ_0038467的潛在靶點(diǎn)。研究表明miR-495過(guò)表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡[6]。但關(guān)于miR-495對(duì)血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響研究較少。此外,抑制NF-κB信號(hào)通路可緩解急性心肌梗死的發(fā)展進(jìn)程[7]。同時(shí),miR-495已經(jīng)被證實(shí)參與一些人類疾病中NF-κB信號(hào)的調(diào)控[8-9]。因此,本研究通過(guò)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9C2進(jìn)行AngⅡ誘導(dǎo)建立心肌細(xì)胞損傷模型,探究circ_0038467調(diào)控miR-495/NF-κB對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;AngⅡ購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;Trizol試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技公司;Lipofectamine2000、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;si-NC、anti-miR-NC、si-circ_0038467、miR-NC、anti-miR-495、miR-495 mimics購(gòu)自廣州銳博生物公司;pcDNA、pcDNA-circ_0038467購(gòu)自上海吉瑪制藥公司;雙熒光素酶報(bào)告基因載體及其活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;LDH、MDA、SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;細(xì)胞凋亡、兔抗鼠cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bcl-2、p-P65、P65、p-IκBα及IκBα蛋白抗體購(gòu)自武漢艾美捷科技公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 AngⅡ組:在濃度為1 μmol/L的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)H9C2細(xì)胞,培養(yǎng)時(shí)間為24 h[10];Con組:正常培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-circ_0038467、miR-NC、si-NC、miR-495 mimics依次轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染成功的H9C2細(xì)胞內(nèi)加入濃度為1 μmol/L AngⅡ的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,并記為AngⅡ+si-NC組、AngⅡ+si-circ_0038467組、AngⅡ+miR-NC組、AngⅡ+miR-495組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-circ_0038467和anti-miR-NC、si-circ_0038467和anti-miR-495依次轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞,在濃度為1 μmol/L AngⅡ的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染成功的H9C2細(xì)胞24 h,并記為AngⅡ+si+anti-miR-NC組、AngⅡ+si+anti-miR-495組。

1.2.2 采用qRT-PCR方法對(duì)circ_0038467、miR-495進(jìn)行檢測(cè) 利用Trizol試劑提取各組H9C2細(xì)胞總RNA,在42℃15 min,95℃3 min的反應(yīng)條件下反轉(zhuǎn)錄,并加入RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至20μL;按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為95℃ 20 s,60℃ 30 s;72℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.3 MDA水平、LDH、SOD活性檢測(cè) 收集各組H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液上清,采用試劑盒檢測(cè)LDH的活性;在H9C2細(xì)胞加入RIPA裂解液后,采用試劑盒檢測(cè)MDA水平及SOD的活性。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞分組培養(yǎng)48 h,收集后加入PBS沖洗,再加入結(jié)合緩沖液進(jìn)行重懸,按照說(shuō)明書(shū)中的指示先后加入10 μL的Annexin Ⅴ-FITC和PI 5 μL,再按照說(shuō)明書(shū)中的溫度要求進(jìn)行避光染色,15 min后上流式細(xì)胞儀,檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) Circinteractome預(yù)測(cè)circ_0038467與miR-495的靶向結(jié)合區(qū)域,合成野生型載體Wt-circ_0038467和缺失miR-495結(jié)合區(qū)域的突變型載體Mut-circ_0038467,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法用miR-NC或miR-495對(duì)H9C2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)箱中孵育24 h,熒光素酶試劑盒測(cè)定基因熒光強(qiáng)度。

1.2.6 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜,加入按照1∶3000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗,室溫?fù)u床孵育2 h,ECL顯色,暗室下X線膠片顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 circ_0038467和miR-495在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中的表達(dá)

AngⅡ組circ_0038467水平為(2.82±0.23),相較于Con組,AngⅡ組circ_0038467水平顯著升高(P<0.05);AngⅡ組miR-495水平為(0.34±0.03),相較于Con組,AngⅡ組水平(0.34±0.03)顯著降低(P<0.05)。

2.2 干擾circ_0038467表達(dá)對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與Con組比較,AngⅡ組LDH的活性和MDA水平升高(均P<0.05),SOD活性降低(P<0.05);與AngⅡ+si-NC組比較,AngⅡ+si-circ_0038467組LDH的活性和MDA的水平降低(均P<0.05),SOD的活性升高(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 干擾circ_0038467表達(dá)對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.3 干擾circ_0038467表達(dá)對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

AngⅡ組細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3及cleaved Caspase-9蛋白水平較Con組升高(均P<0.05),Bcl-2蛋白水平較Con組降低(P<0.05);AngⅡ+si-circ_0038467組細(xì)胞凋亡率較AngⅡ+si-NC組降低,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達(dá)也降低,,Bcl-2蛋白水平則升高(均P<0.05),見(jiàn)圖1、表2。

A:凋亡相關(guān)蛋白表達(dá);B:細(xì)胞凋亡流式圖;1:Con組;2:AngⅡ組;3:AngⅡ+si-NC組;4:AngⅡ+si-circ_0038467組

表2 干擾circ_0038467表達(dá)對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.4 circ_0038467對(duì)miR-495表達(dá)的調(diào)控作用

圖2顯示circ_0038467與miR-495之間的結(jié)合位點(diǎn)。miR-495高表達(dá)能夠抑制野生型載體Wt-circ_0038467的熒光素酶活性(0.58±0.05vs.1.05±0.09,P<0.05)。pcDNA-circ_0038467組miR-495的表達(dá)低于pcDNA組(0.44±0.04vs.1.00±0.00,P<0.05);si-circ_0038467組miR-495的表達(dá)高于si-NC組(2.86±0.24vs.0.98±0.06,P<0.05)。

圖2 miR-495與circ_0038467之間結(jié)合位點(diǎn)

2.5 miR-495過(guò)表達(dá)對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響

與AngⅡ+miR-NC組比較,AngⅡ+miR-495組LDH的活性和MDA的水平降低(均P<0.05),SOD的活性升高,細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高(均P<0.05),見(jiàn)圖3、表3。

A:凋亡相關(guān)蛋白表達(dá);B:細(xì)胞凋亡流式圖;1:AngⅡ+miR-NC組;2:AngⅡ+miR-495組

表3 miR-495過(guò)表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響

2.6 下調(diào)miR-495表達(dá)可逆轉(zhuǎn)circ_0038467敲除對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響

與AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-NC組比較,AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-495組LDH的活性、MDA水平、細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3及cleaved Caspase-9蛋白水平均明顯提高(均P<0.05),但Bcl-2蛋白和SOD的活性降低(均P<0.05),見(jiàn)圖4、表4。

A:凋亡相關(guān)蛋白表達(dá);B:細(xì)胞凋亡流式圖;1:AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-NC組;2:AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-495組

表4 下調(diào)miR-495表達(dá)可逆轉(zhuǎn)circ_0038467敲除對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響

2.7 下調(diào)miR-495可逆轉(zhuǎn)干擾circ_0038467對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響

與AngⅡ+si-NC組比較,AngⅡ+si-circ_0038467組p-P65及p-IκBα蛋白水平降低(均P<0.05);AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-495組p-P65及p-IκBα蛋白水平較AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-NC組升高(均P<0.05),見(jiàn)圖5、表5。

1:AngⅡ+si-NC組;2:AngⅡ+si-circ_0038467組;3:AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-NC組;4:AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-495組

表5 下調(diào)miR-495可逆轉(zhuǎn)干擾circ_0038467對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響

3 討論

AngⅡ可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激等反應(yīng),從而加重心肌細(xì)胞損傷,而circRNA異常表達(dá)可參與心血管疾病發(fā)生及發(fā)展[11-12]。circRNA具有穩(wěn)定性與組織特異性,其廣泛存在于真核生物體內(nèi),并可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA/mRNA表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞的活力及凋亡進(jìn)行調(diào)控,可作為治療心血管疾病的新型靶點(diǎn)[13-14]。

先前的研究表明降低circ_0038467的表達(dá)能夠削弱LPS對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的損傷[15]。circ_0038467可促進(jìn)PM2.5誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷[16]。本研究發(fā)現(xiàn)在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0038467表達(dá)升高,提示circ_0038467可能參與心血管疾病發(fā)生過(guò)程。研究表明心肌細(xì)胞損傷時(shí)抗氧化能力減弱,LDH、MDA的水平升高,而SOD的活性降低,并可加重心肌組織損傷[17]。本研究顯示,在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中,干擾circ_0038467表達(dá)可降低LDH的活性和MDA的水平,提升SOD活性,表明下調(diào)circ_0038467表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激具有抑制作用。此外,心肌細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白水平經(jīng)AngⅡ作用后均顯著提升,與楊麗紅等[18]研究結(jié)果相符,而干擾circ_0038467表達(dá)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

miRNA和circRNA的相互作用是探索circRNA生物學(xué)功能的基礎(chǔ)之一。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些circRNA可以作為miRNA的海綿調(diào)節(jié)各靶基因的表達(dá),從而參與心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)circ_0038467直接結(jié)合miR-495并負(fù)調(diào)控其表達(dá),提示circ_0038467可能通過(guò)靶向miR-495促進(jìn)心血管疾病。早期的研究表明miR-495可減輕冠心病導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷[19]。miR-495通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路而抑制心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而減輕細(xì)胞損傷[20]。本研究結(jié)果表明,AngⅡ誘導(dǎo)組miR-495呈現(xiàn)低表達(dá),其過(guò)表達(dá)會(huì)抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡。由于過(guò)表達(dá)miR-495和干擾circ_0038467表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的抑制作用一致,且下調(diào)circ_0038467表達(dá),提高miR-495的表達(dá)水平,這進(jìn)一步證實(shí)circ_0038467可通過(guò)靶向miR-495參與AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。此外,NF-κB通路在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、炎癥、免疫和生存等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,并參與了心肌細(xì)胞AC16細(xì)胞的缺血再灌注損傷[21-22]。抑制NF-κB信號(hào)通路可降低心肌細(xì)胞凋亡水平,保護(hù)心肌細(xì)胞免受外界刺激誘導(dǎo)的心肌損傷[23]。本研究證實(shí)了干擾circ_0038467可通靶向miR-495抑制NF-κB信號(hào)通路的激活,從而抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述,AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0038467呈現(xiàn)高表達(dá),而miR-495呈現(xiàn)低表達(dá),circ_0038467可靶向調(diào)控miR-495的表達(dá),干擾circ_0038467表達(dá)可通過(guò)靶向促進(jìn)miR-495表達(dá)介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路,從而對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡具有抑制作用,進(jìn)而降低細(xì)胞損傷。circ_0038467可能作為心血管疾病治療的潛在靶點(diǎn),但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。