張瑩丹, 陳 莉

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,南寧 530021

細胞重編程是指分化的細胞在特定條件下被重新編程恢復到全能狀態(tài),或者轉(zhuǎn)分化成另一種細胞類型的過程[1]。導入外源性特定神經(jīng)元決定基因(neuronal determination genes)到非神經(jīng)元細胞中表達(即異位表達),可將非神經(jīng)元細胞直接重編程為具有功能的誘導神經(jīng)元(induced neurons,iNs),從而改善神經(jīng)功能,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的治療策略[2-4]。其中,神經(jīng)母細胞特異性轉(zhuǎn)移因子——Achaete-scute家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1(achaete scute homolog-1,Ascl1)及其相關的重編程機制在指導終末分化的非神經(jīng)元細胞重編程為誘導神經(jīng)元的研究中取得突破。本文將主要圍繞Ascl1重編程神經(jīng)元這一主要科學問題,就Ascl1對不同非神經(jīng)元細胞的重編程及其機制進行闡述。

1 Ascl1重編程非神經(jīng)元細胞為神經(jīng)元的可行性

1958年,Gurdon等[5]將非洲爪蟾胚胎晚期的細胞核移植到卵細胞中,使移植后的卵細胞獲得了細胞全能性,表明終末分化細胞的基因狀態(tài)不是靜止的,推翻了細胞分化是不可逆過程的理論,為細胞重編程研究的發(fā)展打下基礎。特定因子的異位表達如骨骼肌調(diào)節(jié)的關鍵轉(zhuǎn)錄因子MyoD可將成纖維細胞(fibroblast,Fb)重編程為成熟的肌細胞[6],這表明可能存在著特定譜系調(diào)節(jié)因子影響細胞發(fā)育和分化。

Ascl1是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,該家族在神經(jīng)源性命運決定(neurogenic fate determination)中起著重要作用[7]。Ascl1基因位于12號染色體長臂22區(qū)至23區(qū)上,其蛋白主要由兩組極性氨基酸殘基和位于第118～170號氨基酸序列組成的典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構域構成,可以與目的基因啟動子的E-box模塊結(jié)合,促進神經(jīng)相關基因的轉(zhuǎn)錄活性,主要在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中表達[8];Ascl1在神經(jīng)發(fā)育過程中有助于γ-氨基丁酸能中間神經(jīng)元的產(chǎn)生,參與了前腦發(fā)育過程中神經(jīng)決定(neural determination)和神經(jīng)元表型的確定,也在泛神經(jīng)發(fā)生(panneurogenic)和神經(jīng)元亞型決定中起著重要作用[9-10],并且對小腦、脊髓及視網(wǎng)膜等特定的細胞亞型也有著多重貢獻[11]。此外,Ascl1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的異位表達可以改變神經(jīng)祖細胞的分化方向,從而調(diào)控細胞命運[9]。

Heins等[12]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)源性的決定因子Pax6可以指導體外星形膠質(zhì)細胞(astrocyte,AST)轉(zhuǎn)分化為具有一定功能的神經(jīng)元,進一步驗證了特定因子的表達可以增強細胞的神經(jīng)元譜系特性,甚至指導非神經(jīng)元細胞的神經(jīng)發(fā)生,表明通過調(diào)控特定轉(zhuǎn)錄因子的表達可改變終末分化細胞的命運,并將其重編程為神經(jīng)元細胞。隨后,許多研究也證實了成纖維細胞、星形膠質(zhì)細胞或其他細胞能夠響應Ascl1的異位表達重編程為誘導神經(jīng)元(induced neurons,iNs),并且能夠在神經(jīng)網(wǎng)絡中發(fā)揮功能,促進了相關神經(jīng)功能的恢復[13]。

2 Ascl1誘導成纖維細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

成纖維細胞起源于胚胎中胚層的間充質(zhì),增殖能力強且代謝旺盛,在體內(nèi)分布廣、數(shù)量多,并且具有多向分化能力,尤其是分化為成骨和成軟骨細胞、去分化為多能干細胞甚至轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元細胞[14-17]。目前已有多項研究利用Ascl1或多因子組合將成纖維細胞直接重編程為具有功能的誘導神經(jīng)元。

2.1 Ascl1誘導成纖維細胞向多巴胺能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

2010年,Vierbuchen等[18]篩選了在神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子Ascl1、Brn2和Myt1,并以慢病毒為載體過表達于小鼠成纖維細胞中,發(fā)現(xiàn)單獨表達Ascl1能夠在體外誘導成纖維細胞為具有未成熟電生理特性的iNs,而共表達Ascl1、Brn2和Myt1(ABM)三因子時,iNs表現(xiàn)出與內(nèi)源性成熟神經(jīng)元相似的膜電生理特性,并且這些iNs大多數(shù)為興奮性神經(jīng)元。Pfisterer等[19]在ABM三因子組合的基礎上共轉(zhuǎn)染指導多巴胺能神經(jīng)元命運決定轉(zhuǎn)錄因子Lmx1a和FoxA2,觀察到成纖維細胞在體外誘導為功能性多巴胺能神經(jīng)元(induced dopaminergic neurons,iDANs),實現(xiàn)將成纖維細胞向特定神經(jīng)元亞型的成功轉(zhuǎn)化。非人類靈長類狨猴成纖維細胞在Ascl1結(jié)合microRNA-9/9*和microRNA-124誘導下也轉(zhuǎn)分化為具有自發(fā)神經(jīng)元活動的神經(jīng)元[20]。

以上研究僅證明了過表達Ascl1可將體外培養(yǎng)的成纖維細胞重編程為iNs。Caiazzo等[21]將Ascl1、Nurr1和LMX1a因子共表達于小鼠、健康成人及帕金森患者供體來源的成纖維細胞,獲得了功能性iDANs,并成功移植到新生小鼠腦室中,對重編程技術在由體外到體內(nèi)移植的應用進行了研究,觀察到iNs能夠整合到宿主神經(jīng)網(wǎng)絡中獲得完整的神經(jīng)元多巴胺能細胞命運,并長期保持電生理活動。進一步研究發(fā)現(xiàn),將Ascl1、Ngn2、Sox2、Nurr1和Pitx3多因子轉(zhuǎn)化的iDANs移植到帕金森大鼠疾病模型上后,iDANs能夠在體發(fā)揮多巴胺能神經(jīng)元的功能,緩解帕金森大鼠的相關運動癥狀[22],實現(xiàn)了重編程iDANs由轉(zhuǎn)變形態(tài)到發(fā)揮功能的應用。這一發(fā)現(xiàn)為未來帕金森疾病的治療提供了一個潛在有效的治療策略。

2.2 Ascl1誘導成纖維細胞向氨基酸類神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

除了多巴胺能神經(jīng)元外,Ascl1也能將成纖維細胞重編程為氨基酸類神經(jīng)元。Ascl1與Foxg1、Sox2、Dlx5和Lhx6多因子共同重編程成纖維細胞的功能性γ-氨基丁酸能神經(jīng)元,能夠整合到宿主神經(jīng)元網(wǎng)絡中抑制宿主海馬體的興奮性神經(jīng)元[23],這一研究為治療癲癇或平衡其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關的神經(jīng)元回路中抑制/興奮信號傳導提供了新的治療策略。

此外,Ascl1、Brn2、Myt1三因子(ABM)與其他因子共轉(zhuǎn)染誘導人成纖維細胞為具有電生理特性的前腦谷氨酸能神經(jīng)元,這些iNs移植到哺乳動物腦室能夠與中樞神經(jīng)系統(tǒng)宿主神經(jīng)元建立突觸連接[24]。另一項研究通過將ABM因子與bHLH家族的NeuroD1在胎兒和人出生后成纖維細胞中共表達,獲得的谷氨酸能神經(jīng)元,能夠形成功能性突觸整合到體外小鼠皮層神經(jīng)元共培養(yǎng)神經(jīng)網(wǎng)絡中,但是在體內(nèi)的研究未能進一步完善深入[25]。在此之前,科學家們應用的重編程策略多為ABM三因子或在ABM因子的條件下添加其他因子誘導成熟神經(jīng)元的產(chǎn)生,但在沒有其他因子輔助的情況下,Chanda等[26]也證實了單因子Ascl1也足以誘導體外培養(yǎng)的成纖維細胞為成熟谷氨酸能神經(jīng)元。

2.3 Ascl1誘導成纖維細胞向5-羥色氨酸能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

FEV、Lmx1b和FoxA2是5-羥色胺能神經(jīng)元終末分化的關鍵轉(zhuǎn)錄因子,Xu等[27]將其同Ascl1轉(zhuǎn)染于人成纖維細胞中,發(fā)現(xiàn)細胞檢測到5-HT、AADC等神經(jīng)元標志物的表達,表現(xiàn)出自發(fā)動作電位和自發(fā)興奮性突觸后電流,表明經(jīng)誘導細胞轉(zhuǎn)分化為5-羥色胺能神經(jīng)元(Induced serotonergic neurons,iSNs)。這項研究與之前誘導成纖維細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化研究一致,即在沒有Ascl1表達的條件下,神經(jīng)元的產(chǎn)生效率明顯受到影響。同年,Vadodaria等[28]發(fā)現(xiàn)在人成纖維細胞中過表達5-羥色胺能神經(jīng)元中高表達的轉(zhuǎn)錄因子NKX2.2、FEV、GATA2和LMX1B與神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄因子Ascl1、NGN2,能高效轉(zhuǎn)化為5-羥色胺能神經(jīng)元。

除此之外,通過Ascl與其他因子共同作用于成纖維細胞重編程可誘導出視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、去甲腎上腺素能神經(jīng)元等[29-31]。

2.4 Ascl1誘導成纖維細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化的相關機制

ABM因子重編程成纖維細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化過程中存在著分級機制,即Ascl1結(jié)合成纖維細胞中許多同神經(jīng)祖細胞相似的神經(jīng)元靶基因位點,并打開封閉的染色質(zhì)、快速誘導染色質(zhì)重塑和核小體定相,在重編程早期具有主導靶向能力,發(fā)揮著“先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子”的作用[32-33]。進一步單細胞測序分析提示,外源性Ascl1的過表達導致成纖維細胞相關基因的沉默和增強子的失活、神經(jīng)元靶基因的上調(diào)以及細胞周期基因的下調(diào),并參與神經(jīng)元形態(tài)學定義基因的表達,從而誘導細胞退出細胞周期,進入神經(jīng)元發(fā)育的起始階段,與此同時Ascl1重編程細胞過程中伴隨不同啟動子的高甲基化的發(fā)生,如單獨誘導非CG甲基化的獨特神經(jīng)元特征,而其他輔助轉(zhuǎn)錄因子如Brn2和Myt1等則針對競爭性成肌細胞程序,在從頭甲基化中抑制供體成纖維細胞轉(zhuǎn)化過程中的成肌細胞程序,從而指導更準確的神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化程序,為神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化后期的成熟發(fā)育創(chuàng)造了有利條件[34-36]。

3 Ascl1誘導星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

星形膠質(zhì)細胞是成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最為廣泛的細胞,約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞的20%～40%[37]。在成人大腦中,成熟的星形膠質(zhì)細胞一般處于靜止狀態(tài),當大腦處于損傷或應激狀態(tài)下,星形膠質(zhì)細胞則反應性增生肥大,表達膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)、巢蛋白(nestin)等神經(jīng)前體細胞蛋白,此時星形膠質(zhì)細胞具有多能神經(jīng)干細胞的潛能[38],是神經(jīng)元重編程中最理想的細胞來源類型。

3.1 Ascl1誘導星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

Berninger等[39]利用Ascl1和Neurogenin2共同誘導出生后早期小鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化獲得iNs,這些iNs存在動作電位,但未建立功能性突觸輸出,也未確定具體亞型。Liu等[40]證實僅Ascl1的表達足以誘導體外培養(yǎng)的出生后及成年小鼠的中腦背側(cè)星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化為功能性神經(jīng)元;該研究進一步實驗表明,使用GFAP啟動子的腺相關病毒作為載體感染體內(nèi)中腦背側(cè)星形膠質(zhì)細胞表達Ascl1,能夠有效將中腦背側(cè)星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為功能性GABA能及谷氨酸能神經(jīng)元。在DLX2協(xié)同Ascl1的作用下,體外皮層星形膠質(zhì)細胞可定向誘導出功能性GABA能神經(jīng)元并建立功能性突觸輸出[41],而移植到內(nèi)側(cè)顳葉癲癇伴海馬硬化癥模型小鼠海馬體中的皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞可重新編程以產(chǎn)生GABA能iNs,并與顆粒細胞建立GABA能突觸整合到癲癇網(wǎng)絡中,以減少自發(fā)性復發(fā)性海馬癲癇發(fā)作[42]。

除氨基酸類神經(jīng)元外,Ascl1同NeuroD1、LMX1A、MiR218體外實驗將人星形膠質(zhì)細胞重編程為多巴胺能神經(jīng)元,體內(nèi)實驗將帕金森成年小鼠紋狀體星形膠質(zhì)細胞重編程為多巴胺能神經(jīng)元,并實現(xiàn)對帕金森模型小鼠部分運動障礙癥狀一定程度上的改善[3,43]。

在Ascl1誘導下,星形膠質(zhì)細胞可向不同的神經(jīng)元亞型轉(zhuǎn)分化,這可能是由于星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Notch1信號通路的水平導致了星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元重編程的敏感性不同[44],而不同的轉(zhuǎn)錄因子輔助以及星形膠質(zhì)細胞起源影響著重編程的方向[45],這對深入研究誘導星形膠質(zhì)細胞定向重編程為特定亞型神經(jīng)元提供了新的切入點,為治療人類神經(jīng)疾病補充各種神經(jīng)元亞型的細胞來源提供了新的可能。

3.2 Ascl1介導星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的相關機制

Ascl1在重編程星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化過程中早期誘導了神經(jīng)源性程序——上調(diào)參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)的Insm1、Sox11、Sox4、Dll1等以及下調(diào)星形膠質(zhì)細胞中Aqp4、Slc1a3、Fgfr3和膠質(zhì)祖細胞中的Pax6、Fabp7、Vimentin等典型基因的表達,提高Rcor2、Ncor2、Cbfa2t3等轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性[46],并結(jié)合了多個靶標基因如KLF10、MyT1、MyT1L等進行調(diào)控iNs細胞軸突形成及電生理成熟[47]。同時,Ascl1絲氨酸磷酸化受體位點突變增強成人皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)元轉(zhuǎn)化[48];神經(jīng)元富含的線粒體抗氧化蛋白如SOD1和PRDX2,通過對抗異常的活性氧來增加更多的細胞進入神經(jīng)元轉(zhuǎn)化過程[49];作為抑制因子,NOTCH1信號傳導介導Ascl1驅(qū)動的星形膠質(zhì)細胞到神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化[50]。

4 Ascl1誘導Müller膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化及機制

Müller膠質(zhì)細胞具有干細胞潛能,是視網(wǎng)膜再生的可靠來源[51]。Müller膠質(zhì)細胞中Ascl1或協(xié)同Atoh1、Pou4f2,Islet1表達,可轉(zhuǎn)化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元,與宿主視網(wǎng)膜神經(jīng)元建立突觸連接,并對光做出反應,有效刺激視網(wǎng)膜再生[52-53]。

Ascl1在重編程Müller膠質(zhì)細胞的過程中,可與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關基因如Tubb3、NeuroD4等結(jié)合調(diào)控神經(jīng)發(fā)生[54],同時受到STAT信號途徑的調(diào)控影響,STAT信號途徑激活或與Ascl1結(jié)合誘導分化基因抑制劑(inhibitor of differentiation,Id)表達,從而抑制Ascl1在Müller膠質(zhì)細胞亞群中啟動神經(jīng)發(fā)生;此外,STAT途徑的抑制導致Ascl1與非STAT靶標的結(jié)合增加,導致神經(jīng)元基因的富集,實現(xiàn)Ascl1在神經(jīng)發(fā)生所需的基因上更有效的結(jié)合,促進重編程的發(fā)生[55]。

5 Ascl1誘導其他非神經(jīng)元細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化

在轉(zhuǎn)錄因子Ascl1重編程策略下,其他非神經(jīng)元細胞的研究也取得了一定進展。在成年鼠損傷大腦皮層NG2膠質(zhì)細胞中過表達Ascl1和Sox2可誘導皮層的功能性iNs發(fā)生[56],體內(nèi)海馬原位神經(jīng)膠質(zhì)細胞中Ascl1和Dlx2可誘導GABA能iNs,減少內(nèi)側(cè)顳葉癲癇伴海馬硬化癥小鼠癲癇發(fā)作[36],Ascl1協(xié)同其他因子將成年人腦周細胞、多能干細胞成功重編程為功能性iNs[57-59],更有Ascl1對腫瘤細胞進行重編程的成功驗證[60-61]。

6 總結(jié)和展望

近年來在直接神經(jīng)元重編程領域取得了長足的進步,尤其是Ascl1相關的重編程方案正日趨成熟。利用Ascl1將非神經(jīng)元細胞直接重編程為神經(jīng)元細胞以代替特異性神經(jīng)元發(fā)揮功能,這對于更深入地研究神經(jīng)系統(tǒng)細胞的同一性和可塑性具有重大價值,同時為治療人腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病細胞代替治療、藥物發(fā)現(xiàn)和再生醫(yī)學研究開辟了一條全新的道路。體內(nèi)外的重編程已使得模型動物的神經(jīng)功能和相應運動癥狀得到顯著改善,但迄今為止僅僅局限于對局部神經(jīng)元、局部神經(jīng)網(wǎng)絡和相關運動障礙癥狀的觀察。使用重編程的神經(jīng)元替換退化或損傷的神經(jīng)元,重編程后的神經(jīng)元產(chǎn)量如何維持穩(wěn)定、身份特性是否能維持長期穩(wěn)定,其新形成的神經(jīng)網(wǎng)絡是否存在異常連接,正常的神經(jīng)通路是否受損以及如何整合到神經(jīng)網(wǎng)絡中發(fā)揮功能仍未得到解答。此外,將非神經(jīng)元細胞如膠質(zhì)細胞在體重編程為誘導神經(jīng)元,其局部非神經(jīng)元細胞的數(shù)量和功能如何維系,也應得到重視。神經(jīng)系統(tǒng)的重編程更深入的機制仍不十分明朗,這將不利于將細胞重編程技術應用于未來神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中。因此,要將這項前沿技術運用到實際臨床中,仍需對神經(jīng)元細胞直接重編程的細胞網(wǎng)絡連接以及重編程中的分子機制和細胞微環(huán)境進一步探索。