唐玉娟 羅世杏 黃國弟 宋恩亮 李日旺 趙英 張宇 莫永龍 唐瑩瑩

關鍵詞：杧果；TP-M13-SSR；遺傳多樣性；分子身份證

我國是世界第二大杧果（MangiferaindicaL.）生產(chǎn)國，近年來，我國杧果產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，截至2020年，全國杧果種植面積達32.3萬hm2，產(chǎn)量約266萬t，產(chǎn)值達205.2億元（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)墾局2021年統(tǒng)計數(shù)據(jù)），杧果產(chǎn)業(yè)已成為我國熱區(qū)主要農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一。豐富的種質資源是杧果新品種選育和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎，據(jù)統(tǒng)計，目前我國保存有大約1000份杧果種質材料，保存量位居世界第二[1]。面對如此龐大的種質數(shù)量，如何有效進行鑒定區(qū)分及合理利用是目前亟待解決的問題。

形態(tài)學鑒定和分子標記鑒定是種質鑒定的常用方法。形態(tài)學鑒定由于易受環(huán)境影響，且需要鑒定者有一定的經(jīng)驗，在種質鑒定上存在難度。而分子標記具有多位點性、高變異性和穩(wěn)定性等特點，被越來越廣泛應用于種質鑒定。SSR（simplesequencerepeats）標記具有操作簡便、準確可靠，重復性好等優(yōu)點，被國際植物新品種權保護聯(lián)盟（UPOV）推選為DNA指紋圖譜構建的首選標記之一[2]。目前，SSR標記在國內已應用于蘋果[3]、梨[4]、桃[5]、荔枝[6]等多種果樹遺傳育種研究的各個領域，在杧果研究中也有相關報道，如黃麗芳等[7]用篩選出的多態(tài)性引物對杧果實生資源進行SSR-PCR擴增，最終將116份資源劃分為4個群組；周立等[8]利用課題組開發(fā)的功能性SSR分子標記對種質圃內的杧果材料進行遺傳多樣性分析，將43個品種劃分為3個組。

分子身份證（molecularID）是在DNA指紋圖譜的基礎上提出的一種鑒定種質資源的方法，即將指紋圖譜進行編碼賦值，使每一份種質擁有一段特定的字符串，通過字符串對種質進行區(qū)分。國外OHTSUBO等[9]利用SSR分子標記的方法構建了水稻的分子身份證；PAN[10]利用21對SSR引物構建了1025份甘蔗種質資源的分子身份證數(shù)據(jù)庫。國內祁偉[11]較早地應用ISSR和SRAP分子標記分別繪制了紅麻與蓖麻DNA指紋圖譜，并建立其分子身份證；在果樹種質資源的分子身份證研究上，則是艾呈祥等[12]較早地利用10對SSR引物構建了38份甜櫻桃種質的指紋圖譜，將分子指紋賦值后建立品種的分子身份證，而后在桃[13]、葡萄[14]和梨[15]等果樹上也進行過此類研究。目前關于杧果分子身份證研究較少，僅見王明等[16]和姚全勝等[17]利用SSR引物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法構建數(shù)字化指紋圖譜。

TP-M13-SSR是近年發(fā)展起來的最新檢測技術，結合了SSR技術和熒光檢測技術的特點，具有高檢測精度、高效率等優(yōu)點，比目前廣泛采用的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測技術準確性更高、重復性更好，可以進行高通量DNA的指紋品種鑒定。目前，基于SSR熒光標記的杧果種質遺傳多樣性分析和分子身份證構建研究國內外尚未見報道。本研究通過對杧果種質資源保護廣西創(chuàng)新基地圃內保存的145份杧果地方品種、育成品種及其近緣野生種扁桃進行遺傳多樣性分析，構建個體獨特的分子身份證，以期實現(xiàn)杧果種質資源的快速、準確區(qū)分，為杧果種質合理利用提供指導。

1材料與方法

1.1材料

145份種質均取自國家杧果種質資源保護廣西創(chuàng)新基地，包括99份杧果，36份杧果近緣野生種扁桃（表1）。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取于2021年9月采集健康杧果葉片、扁桃葉片，參照王家保等[18]的方法提取DNA并進行檢測。

1.2.2引物合成課題組前期通過簡化基因組測序成功開發(fā)了杧果SSR標記（相關數(shù)據(jù)未發(fā)表），從開發(fā)的引物中篩選出12對擴增條帶清晰、重復性好、穩(wěn)定性高的SSR引物。實驗所用SSR引物合成與加M13接頭的TP-M13-SSR引物、5′端帶有熒光標記的M13正向引物（5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′）均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.3PCR擴增PCR擴增體系及程序參考高源等[19]稍作修改。PCR反應體系：模板DNA（20ng/μL）1μL，帶接頭正向引物（10μmol/L）0.1μL，帶熒光基團的接頭引物（10μmol/L）0.4μL，反向引物（10μmol/L）0.4μL，2×TaqPCRMasterMix5μL，ddH2O3.1μL，共10μL。

PCR反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，62～52℃退火30s，72℃延伸30s，10個循環(huán)，每個循環(huán)降1℃；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，25個循環(huán)；72℃延伸20min，4℃保存待用。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化后在美國ABI3730基因測序儀上進行熒光檢測，收集原始數(shù)據(jù)。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析利用GeneMapper軟件3.0分析ABI3730收集的數(shù)據(jù)，利用PopGen32和PowerMarker3.25軟件計算遺傳多樣性指標和多態(tài)性信息含量，利用NTSYS2.10軟件UPGMA方法進行聚類并構建聚類圖。

1.2.5分子身份證構建將每對引物獲得的等位基因數(shù)按從小到大順序排列，依次從阿拉伯數(shù)字1開始賦值，超過9的從英文字母A開始賦值，將每份種質在12個位點的等位基因按照賦值編碼表賦值，獲得每份種質特有的字符串即分子身份證。

2結果與分析

2.1熒光引物擴增結果多態(tài)性分析

課題組前期通過簡化基因組測序成功開發(fā)了杧果SSR標記，從開發(fā)的引物中篩選出12對擴增條帶清晰、重復性好、穩(wěn)定性高的SSR熒光引物（表2）。利用12對熒光引物對145份杧果種質進行擴增，計算獲得遺傳多樣性指標和多態(tài)性信息含量（表3）。12對引物的觀測等位基因數(shù)在3～11之間，其中引物Mgi061和Mgi135最多為11，平均等位基因數(shù)為6.25；有效等位基因數(shù)在2.2263～5.2468之間，平均值為3.2838；觀察雜合度（Ho）為0.4122～0.6959，平均值為0.5858；期望雜合度（He）介于0.5527～0.8003之間，平均值為0.6725；Shannon指數(shù)（I）介于0.9815～1.9269之間，平均值為1.3383；Nei基因多樣性指數(shù)（Na）介于0.5740～0.8094之間，平均值為0.6702。多態(tài)信息含量（PIC）分布范圍在0.5036～0.7827之間，平均值為0.6396。上述結果表明，本研究篩選的12對引物在145份種質中的多態(tài)性較高。圖1展示了部分種質在熒光引物Mgi061中的毛細管電泳圖。

2.2杧果種質親緣關系分析

基于SSR熒光標記擴增結果，用NTSYS2.10軟件構建遺傳聚類圖（圖2）。在遺傳相似性系數(shù)為0.7060時，供試145份材料分為2個類群，I類群包含109108份杧果和20份扁桃，種質數(shù)量最多，占總數(shù)的88.90%；Ⅱ類群包括17份材料，全部為扁桃。

在遺傳相似性系數(shù)為0.7330時，I類群分為5個亞群，I-1亞群為5個亞群中種質數(shù)量最多的一個，包含13份扁桃和51份杧果，杧果有來自美國的湯米阿瓊斯、愛文、圣心、法斯希爾、海頓、紅凱特，緬甸的水英達、阿某杧、新德隆、帕拉英達、馬帥，印度的903、1號、秋實1號，中國廣西桂熱系列和龍州泰國杧、農(nóng)院8號、良余1號、白皮杧、小紅象牙、象牙22號、象牙、桂青杧、秋實2號，中國云南的云熱302、陽紅1號、勐底紅杧、胭脂杧、云南矮杧、紅蘋、三蜜杧、楊杧，越南的奶油香杧實生、三色杧、越南西貢引，中國臺灣的臺農(nóng)1號、杉林1號，古巴的大娃杧，中國四川的安寧紅杧，泰國的暹羅杧，海南的興熱1號。I-2亞群較少只有4份材料，即中國廣西的桂熱杧120號，中國四川的新紅2號，古巴的太太杧，緬甸的馬切蘇；I-3亞群包括40份材料，其中扁桃6份，其余34份杧果分別是中國臺灣蜜桃杧、臺農(nóng)2號、臺牙杧、金煌杧、貴妃杧、鳳凰杧，泰國的泰引1號、3號、泰國14號、南逗邁4號、四季蜜杧、農(nóng)桑，印度5號、6號、906號，中國廣西的串杧、桂熱杧08-10、四合象牙、本地紅花杧、永樂1號，中國云南的虎豹牙、龍杧、菲杧、大青蜜杧、土杧，越南沙華綠、艾普、紅杧，澳大利亞青杧，中國海南紅玉，印尼海豹，巴基斯坦413，中國四川的桔櫞杧。I-4亞群包括10份材料，來自中國四川的金龍、龍眼香杧、乳杧，中國云南的大頭香杧、三年杧1號、碩帥杧，中國廣西的柳州呂宋、桂熱4號，緬甸的秋杧，印度的椰香；I-5亞群包括10份種質，扁桃1份，美國布魯斯，印度杧7號、澳大利亞肯盛頓、spooer，巴基斯坦44，泰國金水仙，中國云南小菲杧，中國海南黃玉，中國廣西桂熱杧07-2。

遺傳相似性系數(shù)是反映種質親緣關系遠近的重要指標。本研究計算得到各種質間遺傳相似性系數(shù)變化范圍為0.5676～1.000，平均為0.7417。其中愛文與印度杧1號遺傳相似性系數(shù)為1.000，說明在145份材料中愛文和印度杧1號之間親緣關系最近，遺傳差異很?。槐馓姨镪?0-2與大頭香杧和碩帥杧、金煌杧與桂熱杧10-1的遺傳相似性系數(shù)最小，都為0.5676，說明在145份材料中扁桃田陽20-2與大頭香杧和碩帥杧、金煌杧與桂熱杧10-1之間親緣關系最遠，遺傳差異相對較大。

2.3杧果種質分子身份證構建

將每對引物獲得的等位基因數(shù)按從小到大順序排列，依次從阿拉伯數(shù)字1開始賦值，超過9的從英文字母A開始賦值，未獲得等位基因位點的標記為0，將每份種質在12個位點獲得的等位基因按照賦值編碼表（表4）賦值，獲得每份種質特有的字符串即分子身份證。例如熒光引物Mgi154在供試材料中共獲得8個等位基因片段，其中最小片段為212bp標記為1，最大片段274bp標記為8，即可得到每份材料在引物Mgi154的字符串。以供試材料臺農(nóng)1號為例，在12個位點獲得的等位基因為別119、124、158/167、177、113/131、216/219、152/155、216/222、293、233/239、253/274、296，其對應賦值為44、22、34、11、15、34、23、13、11、24、28、11，即臺農(nóng)1號的分子身份證為442234111534231311242811，各供試材料的分子身份證見表5。12對熒光引物可區(qū)分145份供試材料，鑒定率達到100%。

3討論

TP-M13-SSR技術是近年發(fā)展起來的最新檢測技術，它結合了SSR技術和熒光檢測技術的特點，解決了傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測精度和效率低的問題。該技術已成功運用于蘋果[20]、梨[21]等果樹的親緣關系及種質鑒定領域，目前尚未見此技術應用于杧果研究。本研究利用12對TP-M13-SSR熒光引物對145份杧果種質及其近緣野生種進行擴增，引物多態(tài)性分析結果顯示12對引物PIC分布范圍在0.5036～0.7827之間。PIC是衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標，當PIC>0.5時，該引物為高度多態(tài)基因座[22]。本研究選取的12對熒光引物PIC值均高于0.5，所有引物為高度多態(tài)性位點，12對引物PIC平均值為0.6396，此結果高于王明等[16]（0.49）和NAZISH等[23]（0.398）的研究結果，低于周立等[8]（0.661）和DILLON等[24]（0.720）的研究結果，說明TP-M13-SSR熒光引物可以為杧果的親緣關系分析及種質鑒定提供研究數(shù)據(jù)。

本研究利用12對SSR熒光引物對145份材料進行擴增，計算得到各種質間遺傳相似性系數(shù)變化范圍為0.5676～1.000，平均為0.7417，可見種質間的遺傳差異較大，親緣關系較遠。扁桃是我國特有的杧果近緣野生種，其表型性狀與杧果不同。在遺傳相似性系數(shù)為0.7060時，17份扁桃獨聚為Ⅱ類，其余19份未按照種屬關系聚在一起，而是與來自中國廣西和云南的杧果交叉相聚于I類群，這與謝江輝等[25]和羅海燕等[26]的研究結果相似，究其原因可能是杧果存在適應性進化，其與不同種源的扁桃基因相互滲透，引起種源基因的異質性。在遺傳相似性系數(shù)為0.7330時，可進一步將I類群分為5個亞群，其中I-1（包含51份杧果種質）和I-3（包含40份杧果種質）2個亞群種質數(shù)量最多，占所有杧果種質（共計99份）的91.92%。I-1亞群中杧果種質主要來自美國、印度、緬甸、中國廣西和云南（共計42份，占82.35%），I-3亞群主要來自中國臺灣、泰國、越南、印度、中國廣西和云南（共計29個，占80.56%），可見供試種質的整體聚類結果與其地理來源基本一致。聚類結果也同時反映了杧果品種（系）的選育歷史，愛文來自美國佛羅里達州，其親本未知，本研究中愛文和印度杧1號之間的相似性系數(shù)為1.000，說明二者之間的遺傳差異很小，美國佛羅里達州杧果品種多是從印度品種后代選育而來，推測愛文可能是印度杧1號的后代；臺農(nóng)1號是美國海頓和愛文的雜交后代，三者親緣關系很近，相似性系數(shù)分別為0.7838、0.8243、0.8514，一起聚在I-1亞群；乳杧是龍眼香杧的實生后代，二者相似性系數(shù)為0.8373，共同聚在I-4亞群，這一結果與羅世杏等[27]的研究結果相同；臺灣蜜桃杧是愛文的雜交后代，本研究中二者聚在不同亞群，蜜桃杧與其他來自中國臺灣的品種如臺農(nóng)2號、臺牙杧、金煌杧、貴妃杧等聚在I-3亞群，愛文與其來源相同的美國品種圣心、紅凱特等聚在I-1亞群，出現(xiàn)這一結果的原因可能是杧果在長期開放授粉和自然選擇的條件下，培育的新品種在很好適應各個育種地自然條件的同時，也擁有了相似的遺傳基礎，因而形成了因地而異的品種群[28]。

分子身份證是在DNA指紋圖譜的基礎上提出的一個概念，即將指紋圖譜進行編碼賦值，可以更加簡單明了地識別和檢索種質資源，是鑒定種質資源的一種方法。目前，果樹種質資源的分子身份證研究較少[29-31]，關于杧果分子身份證研究僅見2項，即王明等[16]利用7對SSR引物產(chǎn)生的指紋圖譜信息區(qū)分30個杧果品種，每一對引物可平均區(qū)分4.28個品種；姚全勝等[17]以4對核心SSR引物指紋圖譜鑒別11個杧果品種，每一對引物可平均區(qū)分2.75個品種。TP-M13-SSR是近年發(fā)展起來的最新檢測技術，結合了SSR技術和熒光檢測技術的特點，具有高檢測精度、高效率等優(yōu)點，前人研究表明該技術比目前廣泛采用的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測技術準確性更高、重復性更好、效率更高[32-34]。本研究利用12對SSR熒光引物對145份材料進行擴增獲得指紋圖譜，采用數(shù)字和字母相結合的編碼方式獲得分子身份證，通過分子身份證進行種質鑒定，每一對引物可平均區(qū)分12.4份種質，鑒定率明顯高于王明和姚全勝，由此可見熒光SSR引物在杧果種質鑒定上更具優(yōu)勢。