李博勛 黃貴修 和麗崗 蔡吉苗 馮艷麗 余文才 劉忠亮

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù)；棒孢霉落葉?。浑s交F1代；鑒選；抗病性

橡膠樹(shù)（Heveabrasiliensis）原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域，是典型的多年生熱帶高大喬木，主要種植在22?0150N，100?7811E，海拔549m的熱帶地區(qū)，我國(guó)橡膠樹(shù)種植突破了傳統(tǒng)的植膠區(qū)，主要分布在海南省、云南省南部和廣東省雷州半島等區(qū)域[1]。橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病是繼南美葉疫病之后的第二個(gè)威脅世界天然橡膠產(chǎn)業(yè)的重要葉部病害，在南亞、東南亞以及中非等植膠國(guó)的成齡膠園暴發(fā)流行，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可導(dǎo)致干膠產(chǎn)量損失20%～25%，并且種苗芽接成活率不足20%[2]。該病主要為害橡膠樹(shù)葉片、嫩梢、嫩枝，并形成最具代表性的“魚(yú)骨狀”病斑，其病原多主棒孢病菌（Corynesporacassiicola）釋放的寄主專(zhuān)化性毒素能延葉脈傳導(dǎo)，導(dǎo)致葉片大量脫落，只剩光禿禿的樹(shù)枝，嚴(yán)重影響膠樹(shù)的長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量[3]。該病于2006年首次在我國(guó)報(bào)道發(fā)生[4]，目前已經(jīng)在云南、海南、廣東等植膠區(qū)的實(shí)生苗、幼齡膠樹(shù)及部分開(kāi)割成齡膠樹(shù)上普遍發(fā)生，潛在威脅巨大[5]。國(guó)際上，對(duì)于棒孢霉落葉病的防治主要采取抗病種質(zhì)選育。20世紀(jì)80年代，斯里蘭卡遭受棒孢霉落葉病的為害，致使許多高產(chǎn)的橡膠品種（系）大面積停割和死亡，通過(guò)9年時(shí)間，該國(guó)選育出RRIC100、RRIC102、RRIC121、RRISL203、RRISL205、RRISL211等18個(gè)抗病品種（系），并逐漸替代當(dāng)時(shí)主栽的感病品種（系），挽救了斯里蘭卡的天然橡膠產(chǎn)業(yè)。隨著棒孢霉落葉病在亞洲植膠國(guó)大面積暴發(fā)流行，馬來(lái)西亞篩選出PB86、PB213、RRIM712、RRIM628；泰國(guó)篩選出PB260、RRIC101、KRS156；印度尼西亞篩選出IRR100和IRR200，印度篩選出IAN873、GT1、IIRR208等一系列的品種（系）在田間都表現(xiàn)出較好的抗病性，并在一定程度上控制了病害所造成的產(chǎn)量損失[6-7]。之后由于多主棒孢病菌優(yōu)勢(shì)種群和生理小種的變異，一些表現(xiàn)為抗病的品種（系），在種植過(guò)程中也變得感病，許多國(guó)家也嘗試著采用化學(xué)防治和生物防治等措施來(lái)控制該病的發(fā)生與流行，但防治效果均不理想[8-10]。為此，對(duì)于橡膠樹(shù)這種多年生的高大喬木來(lái)說(shuō)，抗病種質(zhì)資源的收集、評(píng)價(jià)與創(chuàng)制利用是防治該病最為經(jīng)濟(jì)有效且綠色環(huán)保的途徑。

長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)一直把高產(chǎn)、耐寒、抗風(fēng)、幼態(tài)性狀良好、膠木兼優(yōu)等農(nóng)藝性狀作為橡膠樹(shù)育種的目標(biāo)[11]，卻忽略了抗病種質(zhì)的鑒選與創(chuàng)制利用。先后引進(jìn)和選育的近80個(gè)品種（系），以及生產(chǎn)上大面積種植的PR107、RRIM600、GT1、熱研7-33-97等主栽橡膠品種（系）對(duì)棒孢霉落葉病的抗病性明顯不足[12]。目前，我國(guó)收集保存有6185份橡膠樹(shù)種質(zhì)資源，其中野生種質(zhì)資源5710份[13]，如何利用這些豐富的種質(zhì)資源，在保證上述選育種目標(biāo)的同時(shí)還兼具抗病性，將為優(yōu)質(zhì)橡膠樹(shù)選育以及抗病種質(zhì)的鑒選與創(chuàng)制利用提供有力支撐。2009—2013年，云南省熱帶作物科學(xué)研究所利用國(guó)內(nèi)外高產(chǎn)、速生的魏克漢種質(zhì)與1981IRRDB種質(zhì)作為父母本，采用人工授粉方式獲得28個(gè)組合的5616株雜交F1代群體（內(nèi)部資料未發(fā)表）。本研究從這28個(gè)組合中，根據(jù)父母本的抗病性水平，挑選了其中3個(gè)雜交組合云研277-5×IAN873、云研277-5×熱墾525、RRIC103×熱研8-79共821份F1代群體，采取初篩和復(fù)篩2輪評(píng)價(jià)，利用3個(gè)類(lèi)群的多主棒孢病菌，對(duì)這些F1代群體進(jìn)行抗病性早期鑒定，最終獲得5份F1代抗病新種質(zhì)。本研究旨在分析不同雜交組合選育出的橡膠樹(shù)新種質(zhì)的抗病性水平，以期獲得一批具有抗病性潛力的種質(zhì)材料，為橡膠樹(shù)抗病種質(zhì)的鑒選、早期抗病性診斷以及創(chuàng)制利用提供良好的種質(zhì)材料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1橡膠樹(shù)種質(zhì)材料供試親本為橡膠樹(shù)優(yōu)良品種無(wú)性系IAN873、RRIC103、云研277-5、熱墾525、熱研8-79，橡膠樹(shù)雜交組合是由云南省熱帶作物科學(xué)研究所于2009—2011年春花期進(jìn)行人工雜交授粉，同年8—9月采種并播種于沙床催芽，待小苗古銅期移栽至營(yíng)養(yǎng)袋培育。供試的3個(gè)雜交組合及其F1代種質(zhì)材料均由云南省熱帶作物科學(xué)研究所和麗崗研究員團(tuán)隊(duì)提供。親本信息、品種特性和雜交后代株數(shù)詳見(jiàn)表1。

1.1.2供試病原菌供試的多主棒孢病原菌為不同遺傳類(lèi)群的代表性菌株HCcYN49（Cas5亞型）、CC01（Cas2亞型）和HCcJPZ01（Cas0亞型）均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所黃貴修研究團(tuán)隊(duì)分離、鑒定和保存。

1.1.3培養(yǎng)基和試劑用于培養(yǎng)病原菌的PDA培養(yǎng)基和用于多主棒孢粗毒素發(fā)酵的Fries3號(hào)改良的培養(yǎng)液參照李博勛等[12]的研究方法配制。用于實(shí)施熒光定量分析的HbNPR1和HbGLP01基因引物（表2）均由深圳華大基因科技有限公司合成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需的Buffer、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAMarker等購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。植物總RNA提取試劑盒（DP441）、FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒（KR106）、SYBRGreenSuperReal熒光定量預(yù)混試劑（FP205）均購(gòu)自天根生化（北京）科技有限公司。過(guò)氧化物酶（POD）測(cè)試盒（ml092949）、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（mlsh0386）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。其他化學(xué)試劑、藥品等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4儀器設(shè)備Bio-RadT100型梯度PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；UVIFireReader凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)UVItec公司；ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500型，美國(guó)ABI公司。

1.2方法

1.2.1橡膠樹(shù)F1代種質(zhì)抗病性評(píng)價(jià)本研究采用病原菌菌餅接種、粗毒素生物萎蔫和田間活體接種3種方法，以及抗病性方案設(shè)計(jì)、評(píng)價(jià)方法和病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)均參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T3195—2018《熱帶作物種質(zhì)資源抗病蟲(chóng)鑒定技術(shù)規(guī)程橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病》[18]，抗病性評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)表3。

1.2.2防御酶活性測(cè)定為分析抗、感F1代種質(zhì)防御酶活性的變化情況，選取淡綠期的抗、感種質(zhì)葉片，采用濃度為1×106個(gè)孢子/mL的HCcYN-49菌株孢子懸浮液噴霧接種到橡膠樹(shù)葉片背面，每個(gè)種質(zhì)接種3片復(fù)葉，每片復(fù)葉為1個(gè)重復(fù)，以接種無(wú)菌水的作為空白對(duì)照。分別于接種后0、12、24、48、72h取樣。過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）提取方法及注意事項(xiàng)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3RNA提取及反轉(zhuǎn)錄參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)抗、感橡膠葉片的總RNA進(jìn)行提取，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，紫外分光光度計(jì)下測(cè)定其260、280nm處的吸光值，確保RNA樣品的純度。參照FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄第一鏈。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量分析參照SYBRGreenSuperReal熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)，以組成型表達(dá)基因18srRNA做為內(nèi)參基因，分析HbNPR1和HbGLP01基因在橡膠樹(shù)抗、感F1代葉片受多主棒孢病菌（HCcYN49）接種不同時(shí)間段（0、12、24、48、72h）的差異表達(dá)情況。每個(gè)樣品均重復(fù)3次，在ABI7500實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行，采用2–ΔΔCT法計(jì)算分析。2–ΔΔCT＝2–[（CtE-CtF）-（CtA-CtB）]=2（CtF-CtB）-（CtE-CtA），其中CtA為處理前待測(cè)基因Ct值；CtB為處理前參照基因Ct值；CtE為處理后待測(cè)基因Ct值；CtF為處理后參照基因Ct值。

1.3數(shù)據(jù)處理

橡膠樹(shù)雜交F1代群體的抗病性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)采用WPSOfficeExcel軟件統(tǒng)計(jì)病斑直徑和萎蔫指數(shù)，采用SPSSStatistics20軟件中的Kolmogorov-Smirmovtest進(jìn)行變量分布形態(tài)檢測(cè)與分析。實(shí)時(shí)熒光定量的數(shù)據(jù)利用SPSSStatistics20軟件中的單因素方差分析（One-wayANOVA）和Duncans多重比較進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1橡膠樹(shù)3個(gè)雜交組合F1代群體的抗病性評(píng)價(jià)

基于前期對(duì)我國(guó)橡膠樹(shù)多主棒孢病菌遺傳類(lèi)群的劃分依據(jù)[19]，先選用國(guó)內(nèi)橡膠樹(shù)多主棒孢優(yōu)勢(shì)種群Cas5亞型的代表性菌株HCcYN49對(duì)3個(gè)雜交組合的821份F1代群體進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)，并對(duì)平均病斑直徑進(jìn)行了正態(tài)分布檢驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親本的抗病性水平依次表現(xiàn)為：IAN873>云研277-5>RRIC103>熱研8-79>熱墾525，對(duì)于父母本均表現(xiàn)出較高抗病水平的雜交組合IAN873×云研277-5，其268份F1代群體中抗病的植株數(shù)占87.68%，高抗植株70份，顯著高于其他2個(gè)雜交組合的后代群體，群體的平均抗病級(jí)次為中抗（MR）（表4）。雜交組合IAN873×云研277-5F1代群體中病斑直徑最大值為1.33cm，最小值為0.11cm，平均值0.68cm，變異系數(shù)38.23%（表5），抗病性呈現(xiàn)正偏態(tài)分布（圖1、圖2），說(shuō)明該雜交組合的F1代群體表現(xiàn)出較高抗病性，群體樣本趨于抗病遺傳趨勢(shì)。

雜交組合RRIC103×熱研8-79的210份F1代群體中抗病植株樹(shù)占56.19%，高抗植株7份，群體平均抗病級(jí)次為輕感（S）（表4）。F1代群體中病斑直徑最大值為2.30cm，最小值為0.33cm，平均值1.02cm，變異系數(shù)32.35%（表5、圖3），群體的抗病性符合標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布（圖4、圖5），總體分布趨勢(shì)及平均抗病級(jí)次在3個(gè)雜交組合中最平穩(wěn)，在一定程度上代表了總體的抗病期望值，說(shuō)明當(dāng)群體數(shù)量足夠大時(shí)，其抗病分布應(yīng)符合正態(tài)分布。

雜交組合云研277-5×熱墾525的343份F1代群體中抗病植株數(shù)占20.69%，高抗植株6份，群體平均抗病級(jí)次為輕感（S）（表4），F(xiàn)1代群體中病斑直徑最大值為2.23cm，最小值為0.40cm，平均值1.29cm，變異系數(shù)28.68%（表5），群體的抗病性同樣符合正態(tài)分布（圖6、圖7），該組合的F1代群體可作為候選抗病種質(zhì)進(jìn)入到無(wú)性系的高級(jí)系比。

2.2候選抗病F1代種質(zhì)的鑒定

橡膠樹(shù)雜交F1代種質(zhì)早期抗病性鑒定是根據(jù)目標(biāo)性狀評(píng)價(jià)篩選出抗病性較好的優(yōu)良單株，再將優(yōu)良單株繁殖成無(wú)性系進(jìn)入高一級(jí)系比試驗(yàn)。因此，根據(jù)3個(gè)雜交組合共821份F1代群體的抗病性評(píng)價(jià)結(jié)果，選擇符合正態(tài)分布的RRIC103×熱研8-793和云研277-5×熱墾525兩個(gè)雜交組合中病斑直徑小于對(duì)照IAN873的32份優(yōu)良單株為候選抗病F1代種質(zhì)，并將其進(jìn)行芽接，每個(gè)單株編號(hào)芽接不少于10株，共獲得297株F1代無(wú)性系種苗（表6）。利用多主棒孢病菌3個(gè)亞型的代表性菌株HCcYN49（Cas5亞型）、CC01（Cas2亞型）和HCcJPZ01（Cas0亞型），致病力強(qiáng)弱依次為：HCcYN49>CC01>HCcJPZ01，對(duì)32份候選F1代無(wú)性系種苗進(jìn)行抗病性復(fù)篩。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜交組合RRIC103×熱研8-79中的265、129、134三個(gè)F1代單株（表7），以及雜交組合云研277-5×熱墾525中的3162、3528兩個(gè)F1代單株（表8）不管是采用粗毒素生物萎蔫法還是田間活體接種法，在3個(gè)亞型多主棒孢病菌的接種下均表現(xiàn)出較好的抗病性水平。其中265和129這2個(gè)F1代種質(zhì)在田間活體接種后，其病斑出現(xiàn)的時(shí)間較晚，病情指數(shù)也顯著低于其他種質(zhì)（表7）。在這些F1代種質(zhì)中，對(duì)3個(gè)亞型多主棒孢的抗病性也存在明顯差異，如167和3262等種質(zhì)表現(xiàn)出對(duì)Cas2亞型的高度感病性，對(duì)Cas0亞型較為免疫；而125和3303等種質(zhì)表現(xiàn)出對(duì)Cas5亞型的高度感病性，不同的種質(zhì)對(duì)不同亞型的病原菌敏感性不同（表7、表8）。

2.3抗病F1代種質(zhì)的抗病關(guān)聯(lián)性分析

2.3.1防御酶活性測(cè)定已有研究表明，POD、SOD等酶活作用能迅速降低體內(nèi)活性氧積累給植物帶來(lái)的損傷，從而提高植物對(duì)病原菌的防御能力[20]。為了進(jìn)一步分析復(fù)篩結(jié)果得到的5個(gè)高抗F1代種質(zhì)其防御酶活性變化與病原菌侵染之間的關(guān)系，本研究對(duì)265、129、134、3162、3528五個(gè)抗病F1代種質(zhì)和對(duì)照種質(zhì)PR107的POD和SOD活性變化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)F1代抗病種質(zhì)以及對(duì)照品種PR107在多主棒孢病菌（HCcYN49）接種后均能引起POD和SOD防御酶活性的升高，在接種24h時(shí)POD防御酶活性達(dá)到峰值，134種質(zhì)的峰值最高，48h后呈逐漸下降的趨勢(shì)，相對(duì)于對(duì)照PR107，5個(gè)抗病F1代種質(zhì)的防御酶活性普遍較高，72h后活性整體下降（圖8），而SOD防御酶活性的峰值在5個(gè)抗病種質(zhì)中均不相同，129和134在接種12h時(shí)SOD活性達(dá)到峰值，265、3162和3528在接種24h達(dá)到峰值，48h后整體均呈下降趨勢(shì)，72h又有所升高（圖9）。通過(guò)對(duì)POD和SOD兩個(gè)防御酶活性的變化可以看出，5個(gè)抗病F1代種質(zhì)受病原菌侵染后，均能誘導(dǎo)POD和SOD活性顯著升高，并在接種不同時(shí)間段，通過(guò)防御酶活性的變化來(lái)抵御病原菌的進(jìn)一步侵染。

2.3.2抗病相關(guān)基因表達(dá)分析前期研究發(fā)現(xiàn)HbNPR1和HbGLP01基因是橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病的2個(gè)抗病相關(guān)基因，在多主棒孢病菌侵染后能引起其表達(dá)量的明顯變化，并且這2個(gè)基因在橡膠樹(shù)抗、感種質(zhì)中的表達(dá)模式存在顯著差異[21-22]。因此，分析這2個(gè)基因在5個(gè)抗病F1代種質(zhì)中的表達(dá)情況，將從基因水平明確種質(zhì)的抗病關(guān)聯(lián)性。從結(jié)果可以看出，當(dāng)多主棒孢病菌（HCcYN49）接種后6h就能誘導(dǎo)HbNPR1基因表達(dá)量的升高，并且在24h時(shí)表達(dá)量均達(dá)到峰值，265和3162兩個(gè)種質(zhì)中HbNPR1基因的誘導(dǎo)表達(dá)量要高于其他幾個(gè)種質(zhì)，在48h時(shí)有所下降，72h時(shí)表達(dá)量降至最低，與對(duì)照PR107相比，5個(gè)抗病F1代種質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量都高于對(duì)照，表達(dá)模式基本一致（圖10）。對(duì)于HbGLP01基因，265、129、134在多主棒孢病菌接種12h時(shí)表達(dá)量就達(dá)到峰值，而134、3162、3528三種質(zhì)以及對(duì)照PR107在24h達(dá)到峰值，48h之后表達(dá)量均下降，5個(gè)F1代種質(zhì)中HbGLP01基因的表達(dá)模式存在一定差異（圖11）。研究表明，NPR1是植物中廣譜抗性的基因，參與水楊酸抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與TGA轉(zhuǎn)錄因子相互作用，引起下游抗病基因的表達(dá)[23]。而GLP是一類(lèi)重要的結(jié)構(gòu)性蛋白，具有草酸氧化酶（OXO）和SOD活性，能抑制活性氧的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞壁的穩(wěn)定性，在病原菌侵染早期起到關(guān)鍵作用[24-25]。

3討論

橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病是主要植膠國(guó)家橡膠樹(shù)上暴發(fā)流行最為嚴(yán)重的病害之一，也是國(guó)際天然橡膠產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的主要生物限制因素[26]。國(guó)際上，對(duì)該病的防治主要采用抗病育種的方式，而抗病品種的鑒選和創(chuàng)制利用是抗病種質(zhì)選育的關(guān)鍵。

橡膠樹(shù)是一種基因型高度雜合且育種周期長(zhǎng)達(dá)30年的熱帶高大喬木，雜交育種是橡膠樹(shù)最常規(guī)也是選育優(yōu)良橡膠樹(shù)種質(zhì)常用的方法[27]，從具有優(yōu)良性狀的親本雜交組合中選擇F1代優(yōu)良單株，并進(jìn)行無(wú)性系的繁育，是橡膠樹(shù)優(yōu)良種質(zhì)創(chuàng)制的基本策略[28]。近年來(lái)，通過(guò)雜交育種選育出如速生高產(chǎn)的熱墾525和云研277-5[16]、抗寒性狀良好的湛試327-13[29]等優(yōu)良品種（系），都較好地遺傳了親本的性狀特征，反映了親本雜交的有效性，縮短了育種進(jìn)程。因此，建立橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病的早期抗病性鑒定技術(shù)體系，通過(guò)對(duì)雜交組合F1代群體早期抗病性的評(píng)價(jià)以及抗病表型特征的觀(guān)察，從中選出抗病性較好的優(yōu)良F1代單株并進(jìn)行無(wú)性系的繁育，將有助于獲得抗病的無(wú)性系種質(zhì)材料，對(duì)橡膠樹(shù)優(yōu)良品種（系）的選育具有重要意義。

抗病性鑒定在實(shí)施過(guò)程中的方案設(shè)計(jì)、評(píng)價(jià)方法、病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)以及接種的病原菌對(duì)抗病性評(píng)價(jià)結(jié)果都至關(guān)重要。本研究嚴(yán)格按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T3195—2018《熱帶作物種質(zhì)資源抗病蟲(chóng)鑒定技術(shù)規(guī)程橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病》實(shí)施，選用的病原菌是來(lái)自3個(gè)亞型的多主棒孢病菌代表性菌株。由于多主棒孢病菌與橡膠樹(shù)上的其他真菌性病害的病原在致病機(jī)制上存在明顯差異，它是一種死體營(yíng)養(yǎng)型的病原真菌，在侵染初期能產(chǎn)生寄主專(zhuān)化性毒素cassiicolin，該物質(zhì)是導(dǎo)致橡膠葉片壞死的重要致病因子，根據(jù)cassiicolin的毒素類(lèi)型，將多主棒孢病菌劃分成了不同的亞型（Cas1～Cas6），我國(guó)存在Cas0、Cas2和Cas5三種亞型，其中Cas5亞型為橡膠樹(shù)上的優(yōu)勢(shì)種群[30]。不同的橡膠種質(zhì)對(duì)這3個(gè)亞型多棒孢病菌的抗病性存在明顯差異[19]。為了客觀(guān)全面地分析橡膠樹(shù)雜交F1群體的抗病性水平，進(jìn)而選出抗病性較好的優(yōu)良F1代種質(zhì)，本研究采取2輪抗病性評(píng)價(jià)，第一輪評(píng)價(jià)是利用多主棒孢病菌優(yōu)勢(shì)種群Cas5亞型的代表性菌株，采用離體菌餅接種法，對(duì)3個(gè)雜交組合共821份F1代種質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的抗病性評(píng)價(jià)，從中獲得32份候選抗病F1代單株，并對(duì)每個(gè)單株進(jìn)行基部芽接，獲得F1代無(wú)性系種苗；第二輪評(píng)價(jià)是利用Cas0、Cas2和Cas5三個(gè)亞型多主棒孢病菌的代表性菌株，分別采用粗毒素生物萎蔫和田間活體接種2種方法對(duì)候選的32份F1代無(wú)性系種苗進(jìn)行抗病性復(fù)篩，經(jīng)過(guò)2輪評(píng)價(jià)、不同亞型的多主棒孢病菌接種以及多種評(píng)價(jià)方法，最終獲得5份抗病性較好的F1代種質(zhì)，并從防御酶水平和抗病相關(guān)基因的角度進(jìn)一步驗(yàn)證了5份F1代種質(zhì)的抗病關(guān)聯(lián)性。通過(guò)上述的抗病性鑒定技術(shù)，得到的抗病性評(píng)價(jià)結(jié)果以及獲得的F1代抗病種質(zhì)都具有較強(qiáng)的可靠性，客觀(guān)反映出3個(gè)雜交組合F1代群體的抗病性。該技術(shù)體系能為后續(xù)橡膠樹(shù)種質(zhì)的選育提供較好的技術(shù)方案，評(píng)價(jià)結(jié)果也能為橡膠樹(shù)優(yōu)良品種的選育與創(chuàng)制利用提供較好的種質(zhì)材料。

寄主植物與病原微生物相互作用的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)，特別是引起酚類(lèi)代謝相關(guān)酶活性增強(qiáng)，如SOD、POD、CAT以及PAL等，都是參與寄主防御反應(yīng)的關(guān)鍵因子，而超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶是細(xì)胞內(nèi)減輕活性氧傷害的保護(hù)酶[31]。本研究中，當(dāng)多主棒孢病菌侵染初期，在5個(gè)抗病F1代種質(zhì)中就能引起超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶活性的升高，在一定程度上說(shuō)明，多主棒孢病菌侵染能誘導(dǎo)這2個(gè)酶的活性進(jìn)而增強(qiáng)寄主的抗病性，但這并不是在所有的種質(zhì)中都有明顯的相關(guān)性，因?yàn)榇x過(guò)程中的酶活性變化是根據(jù)寄主植物和病原微生物互作體系的不同而不同[31]，比如同一個(gè)品種與不同病原生理小種（或種群）之間的互作體系，以及不同品種與同一個(gè)病原生理小種（或種群）之間的互作體系，都會(huì)導(dǎo)致病原菌在侵染過(guò)程中防御酶活性的變化。此外，植物的抗病性還與病原微生物關(guān)聯(lián)分子模式引發(fā)的免疫反應(yīng)（PTI）以及由病原效應(yīng)子引發(fā)的免疫反應(yīng)（ETI）密切相關(guān)，并且是由水楊酸、乙烯、茉莉酸等植物激素介導(dǎo)的抗病性[32]。橡膠樹(shù)HbNPR1基因在水楊酸抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到了十分關(guān)鍵的作用，它能激活下游防御反應(yīng)基因的表達(dá)，正向調(diào)控寄主的抗病性[21]。HbGLP01是一種類(lèi)萌發(fā)素蛋白，在植物基礎(chǔ)抗性方面發(fā)揮著重要作用，具有OXO和SOD活性，能催化草酸氧化，增強(qiáng)植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，觸發(fā)過(guò)氧化脂質(zhì)反應(yīng)和乙烯的合成[22]。本研究中這2個(gè)基因在參與橡膠樹(shù)與多主棒孢病菌相互作用初期都發(fā)揮著重要作用，在不同抗性水平F1代種質(zhì)中的表達(dá)量明顯不同，具有作為橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病抗病性早期分子鑒定靶標(biāo)基因的潛力。