高 也,蘆 帥,孫 勇

(1.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院,四川瀘州 646000;2.蒲江縣人民醫(yī)院口腔科,成都 611630;3.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院口腔科,成都 610083)

β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate,β-TCP)屬于陶瓷磷酸鈣類人工骨材料,具有良好的骨傳導(dǎo)性能和生物降解性能,還具有一定的骨誘導(dǎo)性[1-3]。改良型富血小板纖維蛋白(advanced platelet-rich fibrin,A-PRF)來源于自體血液,包含較多白細(xì)胞、骨祖細(xì)胞、血小板和細(xì)胞因子,具有良好的骨誘導(dǎo)性[4],能有效促進(jìn)軟硬組織的創(chuàng)傷愈合和修復(fù)重建[5-6],并通過促進(jìn)血管形成來刺激骨缺損愈合[7-8]。上述兩種材料聯(lián)合應(yīng)用,不僅可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)骨支架材料骨誘導(dǎo)性能欠佳的問題,而且在滿足骨替代材料支架作用的同時(shí),可以增加材料的骨誘導(dǎo)和成骨性能;此外,還可以避免異體骨和異種骨導(dǎo)致的疾病傳播和倫理風(fēng)險(xiǎn),有望成為理想的骨移植材料。本研究旨在探討β-TCP和A-PRF復(fù)合材料對(duì)成骨細(xì)胞的影響,為后期研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性新西蘭大白兔6只,3月齡,體重(2 500±500)g,清潔級(jí);新西蘭乳兔同胎4只,出生24 h內(nèi),體重20～25 g,清潔級(jí),均購于成都達(dá)碩生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)操作遵循《關(guān)于善待動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.1.2主要儀器與試劑

β-TCP(上海貝奧路生物材料有限公司),A-PRF工具盒(法國Nice公司),A-PRF真空塑料管(德國Greiner bio-one公司),細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8,日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所),兔Ⅰ型膠原蛋白(collagen-Ⅰ,Col-Ⅰ)、兔堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、兔骨鈣素(osteocalcin,OCN)ELISA試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司),茜素紅染劑(北京索萊寶科技有限公司);掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司),電子分析天平(德國Sartorius公司),倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司),酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Themor公司),低速離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1兔成骨細(xì)胞的制取

取新西蘭乳兔(出生<24 h)4只,頸椎脫臼法快速處死后,浸泡于75%乙醇內(nèi)10 min,移至無菌培養(yǎng)皿內(nèi),于無菌操作臺(tái)分離取出兔顱頂骨,采用組織塊貼壁培養(yǎng)法聯(lián)合改良二次酶消化法[9]的復(fù)合培養(yǎng)方法培養(yǎng),經(jīng)傳代培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長期的第3代細(xì)胞(P3)備用。

1.2.2β-TCP的預(yù)備

將包裝完整的無菌β-TCP顆粒(直徑<0.1 mm)和β-TCP圓片(直徑6 mm,高度2 mm)去包裝后,分別緩慢浸沒于完全培養(yǎng)基中,輕柔震蕩,進(jìn)行濕潤處理,24 h后取出,見材料完全浸沒并沉淀于培養(yǎng)皿底部。移液管輕輕吸取多余培養(yǎng)基,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后,最后一次吸干液體,收集剩余濕潤β-TCP材料,備用。

1.2.3兔A-PRF的制備

取成年雄性新西蘭大白兔6只,稱重后固定制動(dòng),聚維酮碘消毒,使用A-PRF專用離心管Vacuette(A-PRF不抗凝真空玻璃涂層塑料管)快速采集兔耳中央動(dòng)脈血4管,每管約10 mL。迅速將A-PRF離心管放入離心機(jī)內(nèi),配平后2 000 r/min離心24 min,取出室溫下靜置5 min。棄上清液,輕柔剝離下部紅細(xì)胞層后,獲得中間A-PRF凝膠層,并于A-PRF專用工具盒內(nèi)壓制成約1.0 mm厚的膜,制備成大小約1.0 mm×1.0 mm的碎屑,備用。另將A-PRF壓制成約2 mm厚的膜,并修剪為直徑約6 mm的膜片,備用。

1.2.4材料復(fù)合

將上述完成制備的β-TCP顆粒/圓片和兔A-PRF碎屑以1∶1的質(zhì)量比進(jìn)行混合[10],備用。

1.2.5實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為4組,包括無材料對(duì)照組(空白組)和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別為β-TCP組(β-TCP顆粒/圓片)、A-PRF組(A-PRF碎屑/膜片)及復(fù)合組(β-TCP顆粒/圓片+A-PRF碎屑),將預(yù)先制備的材料移至孔板內(nèi),要求3個(gè)實(shí)驗(yàn)組材料重量一致。每組設(shè)置3個(gè)副孔,依次加入P3細(xì)胞,共培養(yǎng)。

1.2.6掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和黏附

取濕潤β-TCP圓片和A-PRF膜片,分別行掃描電鏡檢測,以觀察β-TCP和A-PRF樣品的表面形貌及納微結(jié)構(gòu)特征。分別在各實(shí)驗(yàn)組材料與細(xì)胞共培養(yǎng)第1、3、5天同一時(shí)間點(diǎn)取出培養(yǎng)板中β-TCP圓片和A-PRF膜片,進(jìn)行掃描電鏡檢測。操作時(shí)注意正反面,貼近培養(yǎng)板底部為反面,遠(yuǎn)離培養(yǎng)板底部為正面,正面為檢測面。

1.2.7CCK-8檢測細(xì)胞增殖

取24孔板,按照上述實(shí)驗(yàn)分組將各實(shí)驗(yàn)組材料均勻覆蓋于孔板底部,材料與細(xì)胞共培養(yǎng)(空白組不放置任何材料,純細(xì)胞培養(yǎng)),第1、3、5、7、9、14天分別取上清液加入CCK-8試劑檢測細(xì)胞增殖情況,測得450 nm處吸光度[A(450)]值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8ELISA檢測成骨相關(guān)蛋白分泌

同1.2.7材料與細(xì)胞共培養(yǎng)(空白組不放置任何材料,純細(xì)胞培養(yǎng)),采用ELISA試劑盒于第2、4、8天分別檢測各組細(xì)胞Col-Ⅰ、ALP的分泌量,第12、14、16、18天檢測各組細(xì)胞OCN的分泌量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9茜素紅染色及礦化結(jié)節(jié)定量分析

取24孔板,預(yù)先在孔板內(nèi)放置無菌玻片,同1.2.7材料與細(xì)胞共培養(yǎng)(空白組不放置任何材料,純細(xì)胞培養(yǎng)),每組3個(gè)副孔,同時(shí)4組分別加設(shè)空白材料對(duì)照(即不接種任何細(xì)胞),消除材料導(dǎo)致的干擾因素。材料與細(xì)胞共培養(yǎng),第4周時(shí)鏡下各組均見無定形物質(zhì)形成,即礦化結(jié)節(jié),取出玻片經(jīng)茜素紅染色后,各組礦化結(jié)節(jié)呈形態(tài)不一的橘紅色結(jié)節(jié)狀。采用10%十六烷基氯化吡啶溶解著色礦化結(jié)節(jié)染料,測得570 nm處吸光度[A(570)]值,定量分析礦化結(jié)節(jié)生成情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和黏附

β-TCP和實(shí)驗(yàn)制得A-PRF樣品的表面形貌及納微結(jié)構(gòu)特征見圖1。A-PRF圓片、β-TCP圓片及復(fù)合物(β-TCP圓片和A-PRF碎屑復(fù)合)分別與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后,掃描電鏡檢測可見少量細(xì)胞在材料表面及孔隙中黏附,伸出多個(gè)長短不一的包漿突起緊緊黏附在材料表面及孔隙內(nèi),細(xì)胞形態(tài)為不規(guī)則多邊形;培養(yǎng)第3天時(shí),細(xì)胞形態(tài)變大,細(xì)胞繼續(xù)伸展,伸出更多偽足并相互連接,與材料黏附更加緊密;培養(yǎng)第5天,細(xì)胞數(shù)目繼續(xù)擴(kuò)增,細(xì)胞邊緣伸出較多突起、偽足,并向四周伸展與相鄰細(xì)胞間突起偽足相互連接,融合成片,橫跨材料孔隙,細(xì)胞及細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋材料表面。4組觀察結(jié)果顯示,兔成骨細(xì)胞在β-TCP與A-PRF材料表面及多孔β-TCP內(nèi)部孔隙內(nèi)黏附、生長、增殖,形態(tài)多樣。隨時(shí)間延長,材料上細(xì)胞數(shù)量增加,并大量分泌細(xì)胞外基質(zhì),細(xì)胞與基質(zhì)逐漸融合成片狀,覆蓋支架材料表面。單位觀察視野內(nèi)復(fù)合組與A-PRF組細(xì)胞數(shù)目較多,其中復(fù)合組增殖最明顯,β-TCP組細(xì)胞數(shù)目相對(duì)較少,見圖2。

A:A-PRF;B:β-TCP。

2.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞增殖曲線圖顯示:除β-TCP組,其余3組細(xì)胞培養(yǎng)第1～5天,細(xì)胞數(shù)量呈對(duì)數(shù)增長;培養(yǎng)第5天開始,細(xì)胞增殖速度略微減慢;培養(yǎng)第10天后生長逐漸進(jìn)入平臺(tái)期。β-TCP組在培養(yǎng)的前5天,細(xì)胞增殖稍受抑制,培養(yǎng)5 d后進(jìn)入快速增殖期,見圖3A。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:同一時(shí)間點(diǎn)復(fù)合組和A-PRF組細(xì)胞數(shù)量明顯高于β-TCP組(P<0.05),且復(fù)合組最高,見圖3B。

2.3 ELISA檢測成骨相關(guān)蛋白分泌量

各組成骨細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ、ALP、OCN分泌量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而逐漸增多。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:各組成骨細(xì)胞同一時(shí)間點(diǎn)Col-Ⅰ、ALP、OCN分泌量β-TCP組最高,復(fù)合組和A-PRF組次之,空白組最低(P<0.05),見圖4。

A:Col-Ⅰ分泌量的統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖;B:ALP分泌量的統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖;C:OCN分泌量的統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖;a:P<0.05,與空白組比較;b:P<0.05。

2.4 茜素紅染色

材料與細(xì)胞共培養(yǎng)4周后,鏡下各組均見無定形物質(zhì)形成,即礦化結(jié)節(jié),經(jīng)茜素紅染色后,各組礦化結(jié)節(jié)呈形態(tài)不一的橘紅色結(jié)節(jié)狀,復(fù)合組生成結(jié)節(jié)最多,β-TCP組和A-PRF組次之,空白組最少(P<0.05),見圖5。

A:茜素紅染色后肉眼觀(左上順時(shí)針依次為空白組、A-PRF組、β-TCP組和復(fù)合組);B:茜素紅染色鏡下觀(40×,左上順時(shí)針依次為空白組、A-PRF組、β-TCP組和復(fù)合組);C:礦化結(jié)節(jié)的統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖;a:P<0.05,與空白組比較;b:P<0.05。

3 討 論

骨移植材料在臨床上用以恢復(fù)骨缺損空間,促進(jìn)缺損區(qū)恢復(fù)良好的骨量和較高的骨密度。理想的骨移植材料應(yīng)具備以下4個(gè)重要性質(zhì):生物相容性、良好的機(jī)械性能、生物可吸收性和三維高孔隙率結(jié)構(gòu)[11]。β-TCP屬于目前研究較多的人工骨替代材料,具有良好的骨引導(dǎo)作用和一定的骨誘導(dǎo)性能。但是由于β-TCP降解速度過快,與成骨速度不相匹配,常常需要與其他材料相結(jié)合,本實(shí)驗(yàn)中β-TCP與自體來源、新鮮制備的A-PRF材料復(fù)合,不存在任何疾病傳播、免疫原性和致畸致癌風(fēng)險(xiǎn),復(fù)合后用骨水泥的方式進(jìn)行骨缺損注射填充,引導(dǎo)和誘導(dǎo)骨組織再生,是一種安全有效的骨缺損再生方法。

骨移植材料的作用本質(zhì)為刺激周圍骨相關(guān)細(xì)胞在材料表面定植增殖和分化成骨,移植材料的化學(xué)成分、晶體結(jié)構(gòu)和表面形態(tài)是調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附生長、增殖分化、鈣鹽沉積和新骨形成的關(guān)鍵[12-13]。磷酸鈣材料在接觸培養(yǎng)溶液后釋放出鈣離子,使得材料表面帶有正電的Zeta電勢增加[14-15],吸引帶負(fù)電荷的纖維連接蛋白(fibronectin,FN)結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)整合素附著[16-17]。整合素是一種跨膜受體,能與特定的細(xì)胞基質(zhì)蛋白組分,如Ⅰ型膠原蛋白和FN等結(jié)合形成細(xì)胞黏附位點(diǎn),從而介導(dǎo)細(xì)胞黏附[18],增加材料表面對(duì)成骨的增殖和分化作用[19-20]。除了磷酸鈣材料表面蛋白吸附作用,材料周圍滲透壓和pH值的變化也是影響細(xì)胞生物特性的重要因素。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境在一定范圍內(nèi)適當(dāng)堿化,能促進(jìn)體外細(xì)胞黏附和生長,增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化和成骨功能[21]。然而,隨著材料溶解增加,培養(yǎng)環(huán)境中滲透壓和pH值過高時(shí),細(xì)胞運(yùn)動(dòng)明顯減少,甚至產(chǎn)生完全不可逆的運(yùn)動(dòng)抑制,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。而A-PRF來自身血液,對(duì)成骨細(xì)胞具有較好的親和性,培養(yǎng)過程中緩慢釋放生長因子、細(xì)胞因子等成分[23],具有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞、促進(jìn)成骨細(xì)胞的趨化和增強(qiáng)有絲分裂的作用,進(jìn)而促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖和合成活性,調(diào)節(jié)骨折愈合和缺損重塑[24]。

本實(shí)驗(yàn)中,成骨細(xì)胞分別與β-TCP、A-PRF及二者的復(fù)合材料進(jìn)行共培養(yǎng),在細(xì)胞共培養(yǎng)早期主要由整合素介導(dǎo)進(jìn)行細(xì)胞黏附,特異性基質(zhì)蛋白成分主要來源于培養(yǎng)基,β-TCP的Zeta電位作用與A-PRF的蛋白親和性使得各組之間蛋白定植情況基本相似[25],細(xì)胞的黏附也無明顯差異,細(xì)胞形態(tài)符合正常成骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu),細(xì)胞生物相容性良好。

隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,因β-TCP材料析出鈣磷離子增加,材料周圍滲透壓和pH值升高,細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的適當(dāng)堿化能一定程度上促進(jìn)體外細(xì)胞黏附和生長,增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化和成骨功能。然而,當(dāng)β-TCP材料繼續(xù)溶解時(shí),過多的溶解產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境滲透壓和pH值進(jìn)一步增加,當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中滲透壓和pH值過高時(shí),細(xì)胞不能適應(yīng)這種培養(yǎng)條件,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖明顯減少;而A-PRF能持續(xù)釋放生長因子等活性成分,促進(jìn)糖酵解和細(xì)胞增殖[26],因此A-PRF組細(xì)胞增殖呈現(xiàn)穩(wěn)步快速上升,且見細(xì)胞外基質(zhì)的形成和堆積。復(fù)合組各含一半質(zhì)量的β-TCP和A-PRF,結(jié)合兩種材料的優(yōu)勢,避免高滲透壓和pH值,細(xì)胞增殖效應(yīng)大于單一材料組,因此觀察到成骨細(xì)胞的快速增殖且分泌功能旺盛。此外,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,培養(yǎng)基的更換,滲透壓升高抑制鈣離子析出,成骨細(xì)胞釋放酸性代謝物質(zhì),培養(yǎng)基的滲透壓和pH值得到改善,因此觀察到β-TCP組在經(jīng)歷培養(yǎng)初期細(xì)胞生長增殖抑制后,開始快速增殖,但是相對(duì)于其他3個(gè)組,β-TCP組細(xì)胞增殖仍然較慢。在整個(gè)增殖過程中,復(fù)合組細(xì)胞增殖最明顯,A-PRF組次之,這與細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

β-TCP材料具有較粗糙的多孔材料表面,鈣離子的析出使得培養(yǎng)基適當(dāng)堿化,可促進(jìn)細(xì)胞糖酵解,促進(jìn)膠原蛋白合成,ALP活性增加,也可促進(jìn)后期鈣沉積和礦化結(jié)節(jié)生成[15]。A-PRF內(nèi)存在的生長因子對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化作用并不是單一促進(jìn)作用,具有雙向多效性,能促進(jìn)ALP等蛋白分泌,也可抑制成骨細(xì)胞終末分化,即礦化結(jié)節(jié)的形成[6]。但A-PRF的生長因子釋放主要集中在細(xì)胞培養(yǎng)前10 d,而鈣結(jié)節(jié)的沉積主要在細(xì)胞培養(yǎng)3周后[8],所以其最終對(duì)鈣結(jié)節(jié)沉積沒有明顯的抑制作用。復(fù)合培養(yǎng)組中β-TCP含量減少,相關(guān)蛋白分泌稍有減弱,但由于加入了A-PRF,在細(xì)胞培養(yǎng)后期降解產(chǎn)物酸化培養(yǎng)基時(shí)可促進(jìn)β-TCP的鈣離子釋放,從而促進(jìn)鈣沉積和礦化結(jié)節(jié)形成。

綜上所述,β-TCP聯(lián)合A-PRF材料復(fù)合組綜合了兩種材料的優(yōu)勢,能有效促進(jìn)兔成骨細(xì)胞的增殖、成骨相關(guān)蛋白及礦化結(jié)節(jié)的形成,有望成為一種良好的骨替代材料。