蔡瑤瑤,蔡麗君,夏維婷

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院:1.產(chǎn)科;2.生殖中心;3.婦科,浙江溫州 325000)

宮腔粘連(intrauterine adhesion,IUA)是指各種因素導(dǎo)致子宮內(nèi)膜基底層受到損傷,引起宮腔部分或全部堵塞所致的一系列綜合征,主要由醫(yī)源性宮腔操作引起,臨床上主要表現(xiàn)為育齡期女性出現(xiàn)閉經(jīng)、下腹痛、繼發(fā)不孕、反復(fù)流產(chǎn)、生育能力降低等,其所致的并發(fā)癥嚴重威脅女性生殖健康,且目前尚無有效及統(tǒng)一的治療方法[1-3]。由此,深入研究宮腔粘連的病因及內(nèi)膜修復(fù)機制,探索可能的干預(yù)措施具有重大意義。目前相關(guān)研究主要集中于動物實驗,而在動物實驗過程中,動物模型評價方法十分有限,本文通過對比傳統(tǒng)大鼠形態(tài)學(xué)檢查及超聲檢查評價宮腔粘連模型,探討超聲檢查評價大鼠宮腔粘連模型的可行性及優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

SD雌性大鼠16只,體重230～250 g;雄性大鼠4只,體重250～280 g。所有實驗動物由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供,實驗大鼠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心無特殊病原體(SPF)屏障環(huán)境中,實驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2015-0009。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,保障動物自由飲水和攝食。

1.1.2主要儀器與試劑

蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);Olympus43光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);RM2245輪轉(zhuǎn)切片機(德國萊卡公司);DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司),探頭頻率1.5～9.8 MHz。

1.2 方法

1.2.1造模方法

采用機械法損傷大鼠單側(cè)子宮腔內(nèi)膜建立宮腔粘連模型(模型側(cè)/模型組),對側(cè)子宮作為對照側(cè)(對照組)。每天觀察大鼠陰道涂片,處于動情間期的雌鼠用于模型構(gòu)建。1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠后,下腹部消毒,于尿道上端1 cm處切開皮膚進入腹腔,暴露子宮,Y型子宮分叉處切口,利用刮勺刮除子宮內(nèi)膜造成病理性子宮內(nèi)膜損傷。其中8只大鼠用于進行形態(tài)學(xué)分析,其余8只大鼠用于功能學(xué)評價。相關(guān)動物實驗操作經(jīng)由倫理委員會批準(倫理號wydw2016-0213)。

1.2.2病理學(xué)評價

8只雌性大鼠處死后取子宮組織,多聚甲醛固定標本24 h后乙醇梯度脫水,行石蠟包埋,5 μm厚度連續(xù)切片,行HE和Masson染色,在高倍顯微鏡下選取視野,每張切片3個視野。HE染色切片行子宮內(nèi)膜腺體計數(shù),Masson染色后計算各側(cè)子宮內(nèi)膜纖維化的面積比,根據(jù)上述2個參數(shù)進行子宮內(nèi)膜纖維化半定量評分[4]。

1.2.3生殖能力評估

另8只雌性大鼠術(shù)后2周開始以2∶1的比例與雄鼠合籠,以見交配栓當(dāng)天為妊娠第0.5天,妊娠第17.5天開腹計數(shù)子宮內(nèi)胚胎數(shù)目。

1.2.4超聲檢查

(1)大鼠內(nèi)膜情況判斷:子宮內(nèi)膜線模糊、局部內(nèi)膜線連續(xù)性差、回聲中斷等表現(xiàn)提示內(nèi)膜異常,判斷為宮腔粘連陽性;而宮腔內(nèi)膜線完整、連續(xù)、光滑則提示內(nèi)膜正常,判斷為宮腔粘連陰性。(2)合籠后妊娠第17.5天超聲下動態(tài)觀察并計數(shù)每側(cè)大鼠子宮胎鼠數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠子宮超聲檢查結(jié)果分析

建模后2周行常規(guī)超聲檢查(圖1),可見造模側(cè)子宮內(nèi)膜線模糊、局部內(nèi)膜線連續(xù)性差、回聲中斷等表現(xiàn)(圖2B、C),而對照側(cè)大鼠宮腔內(nèi)膜線均完整、連續(xù)、光滑(圖2A)。

圖1 大鼠建模后2周行常規(guī)超聲檢查

A:大鼠對照側(cè)子宮超聲(箭頭所示:子宮內(nèi)膜線光滑連續(xù));B:大鼠模型側(cè)子宮超聲(箭頭所示:子宮內(nèi)膜局部連續(xù)性差,回聲中斷);C:大鼠模型側(cè)子宮超聲(箭頭所示:子宮局部內(nèi)膜線消失);D:大鼠髂骨位置(箭頭處);E:大鼠宮頸處(箭頭處);F:大鼠宮頸上方分為兩側(cè)宮角處(箭頭處)。

2.2 大鼠子宮病理學(xué)檢查結(jié)果分析

通過組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):與對照側(cè)比較,模型側(cè)子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目明顯減少,纖維化面積比例增加(圖3);模型側(cè)子宮內(nèi)膜纖維化半定量評分為(5.50±2.12)分,對照側(cè)為0分,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A、B:分別為大鼠對照側(cè)及模型側(cè)子宮內(nèi)膜HE染色;C、D:分別為大鼠對照側(cè)及模型側(cè)子宮內(nèi)膜Masson染色。

2.3 大鼠子宮超聲與病理檢查結(jié)果對比分析

妊娠第17.5天超聲與開腹計數(shù)兩組子宮胚胎數(shù)目,模型側(cè)均明顯少于對照側(cè)(P<0.05);而同組兩種方法計數(shù)結(jié)果均無明顯差異(P>0.05),見表1、圖4。模型組超聲檢查宮腔粘連陽性率為75.0%(6/8),對照組為0,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);點二系列相關(guān)分析顯示,超聲檢查宮腔粘連陽性率與大鼠子宮內(nèi)膜纖維化半定量評分呈正相關(guān)(r=0.927,P<0.01)。

表1 超聲與開腹計數(shù)胚胎數(shù)目比較

A、B:大鼠妊娠第17.5天剖腹探查所見(箭頭所示:模型側(cè)宮角妊娠情況);C、D:分別為大鼠妊娠第17.5天超聲所見對照側(cè)及模型側(cè)宮角妊娠情況(箭頭所示:胚胎)。

3 討 論

宮腔粘連是婦科常見病之一,我國由于人工流產(chǎn)數(shù)逐年增加,宮腔粘連發(fā)生率較高[5]。宮腔鏡是目前診斷和治療宮腔粘連的主要方法,但中、重度宮腔粘連術(shù)后再粘連發(fā)生率較高,治療困難,影響育齡期婦女生殖及身心健康[6]。雖然宮腔粘連病因?qū)W研究不斷深入,但其發(fā)生機制至今未完全闡明。由于臨床宮腔粘連患者病理標本取材困難,大大限制了宮腔粘連的治療研究進展,因此建立穩(wěn)定可靠的動物模型是研究宮腔粘連發(fā)生機制、預(yù)防和治療方法的關(guān)鍵[7]。目前,宮腔粘連的建模方法主要有機械損傷、化學(xué)損傷和電燒傷等[8]。大鼠宮腔粘連模型因與臨床子宮內(nèi)膜損傷及宮腔粘連病理狀況相似,被廣泛用于研究[9-10]。目前宮腔粘連動物模型的評價主要通過處死動物后的組織病理形態(tài)[8,11-12],表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜組織萎縮,腺體減少且大多無活性,內(nèi)膜纖維化程度增加,宮腔纖維組織黏稠,血管堵塞造成粘連部位缺血等[13-14]。該評價方法無法后續(xù)觀察活體動物模型的病灶動態(tài)變化,限制了宮腔粘連在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深入研究。超聲檢查以無創(chuàng)、方便和可反復(fù)進行的優(yōu)點在動物實驗中逐漸得到廣泛應(yīng)用[15-17],但目前較少有文獻報道將超聲評價應(yīng)用于宮腔粘連相關(guān)的動物研究中,本研究通過對比傳統(tǒng)大鼠形態(tài)學(xué)檢查及超聲檢查結(jié)果,探討超聲檢查評價大鼠宮腔粘連模型的可行性。

檢測病理組織的腺體數(shù)量和纖維化程度是目前大多數(shù)研究評價宮腔粘連動物模型的主要標準。陳醒等[8]通過子宮內(nèi)膜刮除法建立大鼠宮腔粘連模型,發(fā)現(xiàn)模型組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量較對照組減少,纖維化面積增加。徐倩等[4]利用兩種機械損傷法分別建立宮腔粘連模型,同樣通過上述病理學(xué)評價模型的有效性。張璐等[18]則在上述評價指標的基礎(chǔ)上,增加了細胞角蛋白-19(CK-19)和波形蛋白(vimentin)免疫組織化學(xué)評價。韓華等[19]通過注射95%乙醇溶液建立宮腔粘連大鼠模型,發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜胞飲突的形成和整合素β3表達均受到明顯抑制。還有學(xué)者聯(lián)合運用多種發(fā)病機制建立宮腔粘連模型,常使用的方法有機械損傷聯(lián)合不同感染,其穩(wěn)定性及成模率較單一機制形成的模型更佳[20-21]。總而言之,目前大部分對于宮腔粘連動物模型的評價都是依賴于病理學(xué)檢查。

超聲在動物實驗中應(yīng)用較為廣泛,較為常見的有心臟超聲無創(chuàng)評價心功能[22-23],以及對于肝臟、腦血管等的評價[24-25],而關(guān)于小動物子宮疾病的研究應(yīng)用較少。李秀梅等[26]發(fā)現(xiàn)超聲測量大鼠子宮體厚度可作為判斷大鼠子宮腺肌病建模是否成功的無創(chuàng)手段。在臨床上超聲檢查已被廣泛用于宮腔粘連的診斷[27],宮腔粘連患者超聲影像通常表現(xiàn)為宮腔線模糊,局部連續(xù)性不佳,內(nèi)膜回聲中斷,局部“三線征”消失,內(nèi)膜與肌層分界不清,局部毛糙;三維超聲顯示局部呈低回聲或者缺損[28]。本研究中宮腔粘連大鼠的子宮超聲形態(tài)表現(xiàn)與上述表現(xiàn)相似,且超聲檢查宮腔粘連陽性率與大鼠子宮內(nèi)膜纖維化半定量評分呈正相關(guān)性,表明超聲檢查能較好地對模型大鼠進行判斷。此外,本研究運用超聲計數(shù)孕晚期妊娠大鼠的胚胎數(shù)目,并與開腹計數(shù)胚胎數(shù)目進行比較,結(jié)果顯示二者無明顯差異,提示超聲檢查能較為準確地計數(shù)胎鼠數(shù)目,對宮腔粘連模型進行生育力評價。

綜上所述,本研究結(jié)果提示超聲檢查可通過形態(tài)學(xué)評價及生殖功能評價兩方面全面評價宮腔粘連大鼠模型,能對活體動物模型進行較為準確的評價,避免了處死動物才能評價模型的局限性,這對于采用宮腔粘連動物實驗進行的基礎(chǔ)研究具有重要意義。