董巖,周迪,謝亞書,程昭錦,范耀東△

1云南省腫瘤醫(yī)院病理科(云南昆明 650118); 2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科(湖北十堰 442000); 3云南省腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科(云南昆明 650118)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是臨床上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,死亡率居第3位[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與生活方式(包括飲食、身體肥胖、營養(yǎng)因素等)的改變密切相關(guān),其中,與ω-3/ω-6多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的比值呈正相關(guān)[2]。ω-3 和 ω-6 PUFAs是人體的必需脂肪酸[3]。兩種不飽和脂肪酸是構(gòu)成細(xì)胞膜中脂肪酸的成分,具有不同的生物學(xué)功能[4-5]。ω-6 PUFAs及代謝產(chǎn)物形成促進(jìn)炎癥發(fā)生及腫瘤生長的微環(huán)境,而ω-3 PUFAs則是抵抗炎癥的介質(zhì),抑制腫瘤細(xì)胞生長,在輔助治療、營養(yǎng)治療中發(fā)揮積極作用[6-8]。ω-3 PUFAs產(chǎn)生下游代謝產(chǎn)物二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA,C20:4 n-6)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA,C22:6 n-3),花生四烯酸(arachidonic acid,AA,C20:4 n-6)是ω-6 PUFAs核心代謝產(chǎn)物[9]。本研究于2020年6月至2022年3月完成擬比較分析三種代謝產(chǎn)物AA、DHA、EPA對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能及信號通路的影響、化療藥物的協(xié)同作用,探討PUFA與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,為臨床應(yīng)用PUFA營養(yǎng)治療腫瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO和HT29均為云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所饋贈。RPMI 1640、胎牛血清購自Hyclon,細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、PI細(xì)胞周期檢測試劑盒、qRT-PCR相關(guān)試劑購自北京碧云天生物公司,AA、DHA、EPA購自Sigma公司,奧沙利鉑(OXA)購自Solarbio公司,RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)試劑盒購自北京天根生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HT29和RKO細(xì)胞孵育在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,于37℃含5%CO2孵箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液,細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活力檢測 接種100 μL細(xì)胞懸液(5×103個/孔)于96孔板,分為AA、DHA、EPA組及對照組,每組三個重復(fù)。AA、DHA、EPA處理組的濃度梯度為:50、100、150 μmol/L。待12 h細(xì)胞完全貼壁后,吸出培養(yǎng)基更換為上述濃度的AA、DHA、EPA。在培養(yǎng)0、24、48、72 h時每孔加入10 μL CCK-8試劑在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。

1.4 OXA聯(lián)合處理檢測細(xì)胞活力 RKO和HT29細(xì)胞均分為4個組,AA組、DHA組、EPA組,選取40%IC50濃度的AA、DHA、EPA與0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L的奧沙利鉑(Oxaliplatin,OXA)聯(lián)合處理HT29和RKO細(xì)胞,CCK-8檢測細(xì)胞活力。

1.5 PI染色法細(xì)胞周期檢測 取2 mL(細(xì)胞數(shù)量約8×105個)對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),待細(xì)胞融合至約40%時,對照組加入2 mL完全培養(yǎng)基,實驗組分別加入48 h IC50濃度的AA、DHA、EPA處理液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,按照PI細(xì)胞周期檢測試劑盒說明處理細(xì)胞,24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.6 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測 取2 mL(細(xì)胞數(shù)量約8×105個)對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),待細(xì)胞生長至約50%時,對照組加入2 mL完全培養(yǎng)基,實驗組分別加入50、100、150 μmol/L的AA、DHA、EPA處理液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明處理細(xì)胞,于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 生物芯片結(jié)果分析及驗證 以HT29細(xì)胞為研究對象,待細(xì)胞長到50%用50 μmol/L的PBS(對照)、AA、EPA處理細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞提取RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行生物芯片分析。差異 mRNA 的篩選標(biāo)準(zhǔn):AA、EPA實驗組的組間差異mRNA篩選依據(jù)|log2FoldChange|>4,P值<0.05標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因集。芯片的數(shù)據(jù)分析聚類分析所用的軟件為Gen Cluster 3.0;通路分析所采用的數(shù)據(jù)庫為KEGG(http://www.pantherdb.org/tools/)。向HT-29細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入40%IC50濃度AA、DHA和EPA培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于SYBRTMGreen試劑盒進(jìn)行qRT-PCR驗證。qRT-PCR檢測各組中的MCAT、FASN、ACACB、NF-κB1、NF-κB3、FADD在mRNA水平的表達(dá),GAPDH作為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 多不飽和脂肪酸對HT29和RKO細(xì)胞存活率的影響 選用50、100、150 μmol/L濃度的AA、DHA、EPA處理結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29和RKO細(xì)胞,進(jìn)行CCK8細(xì)胞活力實驗。HT29和RKO細(xì)胞活力隨著AA、DHA、EPA濃度增加而降低(表2、3),與對照組相比,除50 μmol/L的AA外,其他濃度的PUFAs與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 RKO細(xì)胞中AA、DHA、EPA處理組的72 h吸光度

表3 HT29細(xì)胞中AA、DHA、EPA處理組的72 h吸光度

2.2 PUFAs聯(lián)合OXA協(xié)同抑制結(jié)直腸細(xì)胞的增殖 結(jié)直腸癌根治性治療后的OXA為基礎(chǔ)的化療是結(jié)直腸癌患者常見的治療方案[10]。為了探究PUFAs是否可以協(xié)同OXA抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。通過IC50實驗,選取AA、DHA、EPA合適濃度(40%IC50濃度),見表4,與0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L的OXA聯(lián)合處理HT29和RKO觀察細(xì)胞的增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種PUFAs均可以協(xié)同OXA抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,其中,EPA效果最顯著(圖1)。

注:*與OXA比較P<0.01

表4 RKO和HT29細(xì)胞中AA、DHA、EPA 48hIC50及40%IC50值

2.3 PUFAs對結(jié)直腸癌細(xì)胞周期的影響 為了分析PUFAs是否通過影響細(xì)胞周期而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖,進(jìn)行細(xì)胞周期實驗進(jìn)行驗證。結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29和RKO經(jīng)IC50濃度的AA、DHA、EPA分別作用48 h后細(xì)胞周期結(jié)果及對照組細(xì)胞周期結(jié)果見表5、6及圖2。在HT29細(xì)胞中,DHA、EPA處理組與對照組相比,G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01),S期和G2期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01),AA處理組對細(xì)胞周期的影響與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RKO細(xì)胞中,AA、DHA、EPA處理組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01),S期和G2期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01),提示DHA、EPA能夠使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,而AA在HT29細(xì)胞中作用不顯著,在RKO細(xì)胞中使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,說明PUFAs對細(xì)胞周期的影響可能與細(xì)胞本身特性相關(guān)。

注:A:RKO細(xì)胞;B:HT29細(xì)胞

表5 RKO細(xì)胞中PUFAs處理后細(xì)胞周期比例

表6 HT29細(xì)胞中PUFAs處理后細(xì)胞周期比例

2.4 PUFAs對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響 為了分析PUFAs是否影響細(xì)胞凋亡,結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29和RKO經(jīng)AA、DHA、EPA(50、100、150 μmol/L)分別作用48 h后細(xì)胞凋亡結(jié)果見表7、8及圖2。HT29和RKO在對照組中未見明顯的凋亡,活細(xì)胞比例為94.34%。在HT29和RKO中,50 μmol/L的DHA和EPA處理組的凋亡細(xì)胞較對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),AA處理組(50 μmol/L)較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);100、150 μmol/L的AA、DHA、EPA處理組較對照組均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);HT29和RKO凋亡細(xì)胞比例與AA、DHA、EPA濃度呈依賴關(guān)系。三種PUFAs產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞比例為EPA>DHA>AA。

表7 不同處理組RKO細(xì)胞凋亡的比例

表8 不同處理組HT29細(xì)胞凋亡的比例

2.5 基因芯片檢測AA/EPA干預(yù)引起HT29結(jié)腸癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化 依據(jù)|log2FoldChange|>4且P值<0.05標(biāo)準(zhǔn),cDNA芯片分析結(jié)果顯示差異基因2 475個,其中2 023個基因上調(diào),452個基因下調(diào)(圖3)。如圖3,使用KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫分析差異基因功能,顯示這些基因共參與34個信號通路包括脂肪代謝通路、與腫瘤發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等信號通路,其中差異基因富集最多的信號通路為癌癥相關(guān)信號通路(hsa05200:Pathways in cancer),共40個差異基因(表9)。AA、EPA干預(yù)引起HT29脂肪酸代謝基因譜廣泛改變,包括:脂肪酸生物合成、脂肪酸延長、脂肪代謝、脂肪消化與吸收通路。對主要通路差異基因進(jìn)行熒光定量PCR測定驗證基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示:FADD在AA組、DHA組和EPA組中表達(dá)水平逐漸上調(diào),MCAT、FASN、ACACB、NF-κB1、NF-κB3在AA組、DHA組和EPA組中表達(dá)水平逐漸下降(圖4)。驗證結(jié)果與芯片表達(dá)結(jié)果一致,表明基因芯片結(jié)果可信。

注:A、B圖中紅色為上調(diào)基因,綠色為下調(diào)基因,C圖藍(lán)色點表示按照|log2FoldChange|> 4標(biāo)準(zhǔn)篩選的差異基因

表9 ω-6 AA/ω-3 EPA處理組中的10個差異信號通路

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。生活習(xí)慣及飲食成分與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11-13]。OXA是結(jié)直腸癌具有顯著抑制活性的鉑類藥物,約有30%～50%的結(jié)直腸癌患者對該藥物的應(yīng)答不敏感,容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及病情惡化的現(xiàn)象[14-15]。如將多種藥物聯(lián)合使用能夠輔助提高抗腫瘤效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)AA、EPA、DHA與OXA協(xié)同抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖方面,EPA作用效果最明顯,提示EPA在結(jié)直腸癌細(xì)胞中對OXA增敏效果最佳?；虮磉_(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)FADD mRNA表達(dá)水平在EPA處理組中較AA、DHA處理組顯著提高,FADD蛋白又名Fas相關(guān)死亡功能域蛋白,主要通過Fas/FasL途徑參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。以往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),通過額外補充ω-3 PUFA或體內(nèi)轉(zhuǎn)化增加ω-3/ω-6 PUFAs能顯著抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。同時,對凋亡的調(diào)控是影響化療藥物發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵[18]。本研究表明EPA聯(lián)合OXA抑制增殖可能與上調(diào)FADD介導(dǎo)的凋亡信號通路有關(guān)。

KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫分析顯示差異基因共參與34個信號通路,其中代謝及腫瘤相關(guān)信號通路的差異基因數(shù)量居多。qRT-PCR實驗進(jìn)行芯片結(jié)果驗證時,EPA、DHA對比AA干預(yù)下,FASN基因表達(dá)被顯著抑制,其中EPA作用效果最明顯。以往研究發(fā)現(xiàn),FASN在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)高于健康人群,并與淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān);FASN的表達(dá)對Wnt信號通路中腫瘤干細(xì)胞移動性相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的基因表達(dá)有影響[19]。EPA、DHA較AA能顯著抑制FASN的表達(dá),提示EPA可能通過降低FASN表達(dá)抑制其介導(dǎo)的Wnt信號通路進(jìn)而降低腫瘤的發(fā)生。

PUFAs作為強(qiáng)大的生物活性媒介物,影響胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、修飾基因的表達(dá)水平,進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,其中一部分抗腫瘤作用及機(jī)制仍未完全闡明,因此還需要補足實驗不斷探索PUFAs代謝與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性,闡述其作用機(jī)制,推動PUFAs在結(jié)直腸癌高風(fēng)險人群的預(yù)防、輔助治療方面的應(yīng)用。

利益相關(guān)聲明:所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:范耀東進(jìn)行實驗設(shè)計;董巖負(fù)責(zé)藥物濃度的篩查和預(yù)實驗及查閱相關(guān)文獻(xiàn);周迪負(fù)責(zé)細(xì)胞功能實驗、化療敏感性實驗;謝亞書進(jìn)行生物芯片結(jié)果驗證;程昭錦負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)處理,統(tǒng)計學(xué)分析;董巖進(jìn)行論文撰寫及審核。