牛 姝, 董麗娜, 吳 笛, 馮 嵐, 張夢瑤, 孫 政, 趙志剛, 郝慧斌

(1.河北省石家莊市人民醫(yī)院, 河北 石家莊 050011 2.河北省石家莊市中醫(yī)院質(zhì)控科, 河北 石家莊 050000)

結(jié)直腸癌的發(fā)病呈現(xiàn)越來越年輕的趨勢,其死亡率亦逐年上升。有研究顯示,與一般人群相比,患有2型糖尿病的人群患結(jié)直腸癌的風(fēng)險明顯增加,并且血糖控制情況會影響結(jié)直腸癌的發(fā)展和預(yù)后[1]。我們前期研究表明,結(jié)直腸癌的發(fā)病及預(yù)后與是否合并糖尿病密切相關(guān)。但是,其潛在的機制尚不明確。Ras蛋白是一種小型GTP酶,其被認為是ERK/MAPK信號通路的控制開關(guān),Ras及其下游信號效應(yīng)器ERK/MAPK均可調(diào)節(jié)PI3K、mTOR和AMPK通路的激活[2]。因此,Ras、ERK1/2蛋白在調(diào)節(jié)多種細胞反應(yīng)中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用,如細胞增殖、分化、凋亡、衰老、代謝,甚至癌癥的發(fā)生和進展[3]。為進一步探究機體高血糖狀態(tài)與Ras、ERK1/2蛋白之間的關(guān)系,本文將檢測結(jié)直腸癌合并2型糖尿病患者Ras、ERK1/2蛋白的表達水平,以探究其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性以及其對生存期的影響。通過初步探討Ras、ERK1/2蛋白在結(jié)直腸癌合并2型糖尿病患者中的作用,從而為這類患者的診療提供了新的思路。

1 資料與方法

1.1研究對象:選擇石家莊市人民醫(yī)院2019年3月到2021年1月期間行結(jié)腸癌手術(shù)治療患者59例,女性22例,男性37例;其中有55例患者的年齡大于50歲,有4例患者的年齡小于50歲;有40例患者最大瘤徑大于或等于5cm;有19例患者最大瘤徑小于5cm;其中7例患者為T1～T2期,52例患者為T3～T4期;癌組織分化:47例患者為中高分化,12例患者為低分化;其中34例患者未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,25例患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。入選條件:①滿足2010《WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類》[4]中結(jié)直腸癌的診斷條件,且手術(shù)后病理證實為結(jié)直腸癌;②實施外科手術(shù)切除結(jié)直腸癌;③在手術(shù)之前沒有進行過放療、化療和其它抗癌藥物治療。排除條件:①有1型糖尿病的患者;②患有其它惡性疾病的患者;按照有共患無2型糖尿病,分為糖尿病組(n=29)和非糖尿病組(n=30)。

1.2臨床數(shù)據(jù)收集:收集患者年齡,性別,腫瘤直徑,臨床病理分期,病理分化程度,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等信息。

1.3免疫組織化學(xué)染色:ERK1/2鼠抗人單克隆抗體,RAS鼠抗人單抗((Ras1∶200、ERK1/2 1∶100,購自abcam公司),從北京中杉金橋生物股份有限公司采購了DAB顯色劑、SP試劑盒。取4微米厚結(jié)直腸的標(biāo)本,用乙二胺四乙酸作為緩沖劑,用3%雙氧水和5%～10%的普通羊血清作保護劑。一抗體(Ras 1∶200、ERK1/2 1∶100)可以在4℃的冷藏室中保存24h。依次滴入高分子增強劑-酶標(biāo)法標(biāo)記的抗鼠-兔多肽,DAB溶液顯色法,顯微鏡下觀察,陽性對照來自于已有的病理切片,陰性對照是磷酸鹽緩沖液。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):對所有切片會進行雙盲評估,這項工作由兩名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生完成評估。當(dāng)兩位病理科醫(yī)生的意見不一致,請第三位專家評估確定結(jié)果。ERK1/2的表達主要以細胞漿為主,呈棕黃色顆粒。Ras的表達主要以細胞漿為主,呈棕褐色顆粒。并以陽性細胞的百分數(shù)以及染色強度為依據(jù)來對其進行打分:0分為陽性細胞百分數(shù)<5%,1分為陽性細胞百分數(shù)<10%,2分為陽性細胞百分數(shù)<50%,3分為陽性細胞百分數(shù)<75%,4分為陽性細胞百分數(shù)>75%;染色強度:0分為無色,1分是淺黃色,2分是棕黃色,3分是棕褐色。評分用陽性細胞百分數(shù)與著色強度分數(shù)相乘,即可得出最終分值:陰性為分值≤3分,陽性為分值>3分。

1.5觀察指標(biāo):比較兩組患者病理組織標(biāo)本中Ras、ERK1/2蛋白表達情況;分析Ras、ERK1/2蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系;分析Ras、ERK1/2蛋白表達與生存期的相關(guān)性。

1.6隨訪:對患者隨訪術(shù)后3年的生存情況,截止至2023年1月,術(shù)后到患者的死亡的時間即生存時間。通過電話隨訪跟蹤以掌握患者的病情、預(yù)后情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法:數(shù)據(jù)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。采用χ2檢驗對兩組間計數(shù)數(shù)據(jù)進行比較,采用Log-rank法分析不同表達情況下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異,spearman相關(guān)性分析法分析Ras、ERK1/2表達與生存期相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12型糖尿病合并結(jié)直腸癌和單純結(jié)直腸癌組癌組織中Ras蛋白的表達水平:Ras蛋白的陽性表達主要以細胞漿為主,呈棕褐色顆粒(圖1)。在2型糖尿病合并結(jié)直腸癌組中,Ras蛋白的陽性表達率為(19/29),即65.5%(見表2)。在單純結(jié)直腸癌組癌組織中,Ras蛋白的陽性表達率為(11/30),即36.7%(見表1)。與單純結(jié)直腸癌組相比,2型糖尿病合并結(jié)直腸癌Ras的陽性率明顯升高(χ2=4.390, P=0.036)。

表2 2型糖尿病合并結(jié)直腸癌組癌組織中Ras-ERK1/2的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

圖1 2型糖尿病合并結(jié)直腸癌組和單純結(jié)直腸癌組癌組織Ras、ERK1/2的表達

2.22型糖尿病合并結(jié)直腸癌和單純結(jié)直腸癌組癌組織中ERK1/2蛋白的表達水平:ERK1/2蛋白的陽性表達主要以細胞漿為主,呈棕黃色顆粒(圖1)。在2型糖尿病合并結(jié)直腸癌組中,ERK1/2蛋白的陽性表達率為(21/29),即72.4%(見表2)。在單純結(jié)直腸癌組癌組織中,ERK1/2蛋白的陽性表達率為(5/30),即16.6%(見表1)。與單純結(jié)直腸癌組相比,2型糖尿病合并結(jié)直腸癌ERK1/2的陽性率明顯升高(χ2=18.592, P=0.000)。

2.32型糖尿病合并結(jié)直腸癌和單純結(jié)直腸癌組臨床資料情況比較:2型糖尿病合并結(jié)直腸癌組和單純結(jié)直腸癌組在年齡、性別、病理分期、腫瘤直徑、病理分化程度方面差異無顯著差異(P>0.05);在所有患者中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者總共25例,2型糖尿病合并結(jié)直腸癌組患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為62%(18/29)(見表2),單純結(jié)直腸癌組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為23.3%(7/30)(見表1),2型糖尿病合并結(jié)直腸癌組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較單純結(jié)直腸癌組明顯升高(χ2=7.766, P=0.005)。

2.4Ras-ERK1/2信號表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系:Ras-ERK1/2信號表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān):Ras陽性表達組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為60%(18/30),明顯高于陰性表達組的24.1%(7/29),(χ2=15.632, P=0.000)。ERK1/2陽性表達組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為61.5% (16/26),明顯高于陰性表達組的27.2%(9/33) ,(χ2=6.993, P=0.008)(見表3)。

表3 所有患者癌組織中Ras-ERK1/2的表達與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系(n)

2.5Ras-ERK1/2信號表達與生存期的相關(guān)性:結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存時間與Ras-ERK1/2信號表達呈負相關(guān):Ras陽性表達組術(shù)后生存時間(19個月)顯著小于Ras陰性表達組術(shù)后生存時間(26個月)(見表4);ERK1/2陽性表達組術(shù)后生存時間(18個月)顯著小于ERK1/2陰性表達組術(shù)后生存時間(24個月)(見表4);Ras-ERK1/2信號陽性表達術(shù)后生存時間明顯小于陰性表達組( P<0.05)。

表4 Ras-ERK1/2信號表達與生存期的相關(guān)性

3 討 論

2型糖尿病(diabetes mellitus,DM)是胰島素抵抗和/或胰島素分泌不足所致,以慢性高血糖為特征的慢性疾病。新診斷患者的增加表明需要提高對糖尿病的認識并防止慢性并發(fā)癥。 2型糖尿病不僅導(dǎo)致大血管和微血管的并發(fā)癥,還與不同類型癌癥的發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān),特別是內(nèi)分泌和胃腸道惡性腫瘤。最近一項納入了150項研究(包括3200萬人的數(shù)據(jù))的薈萃分析證實了糖尿病和結(jié)直腸癌之間存在很強的流行病學(xué)聯(lián)系[5]。糖尿病患者預(yù)防結(jié)直腸癌的挑戰(zhàn)之一是這兩種疾病之間復(fù)雜的病因?qū)W關(guān)系,例如久坐的生活方式,西方模式的飲食、肥胖和代謝綜合征[6]。有證據(jù)表明,糖尿病可能通過慢性高血糖和高胰島素血癥的影響CRC發(fā)展并且存在因果關(guān)系[7]。與沒有糖尿病的患者相比,患有糖尿病的結(jié)直腸癌、結(jié)腸癌和直腸癌患者的生存期縮短了5年。根據(jù)美國糖尿病協(xié)會和美國癌癥協(xié)會的聯(lián)合建議,糖尿病患者被確定為高危人群,應(yīng)進行定期癌癥篩查。

增殖的惡性腫瘤細胞具有高能量轉(zhuǎn)換和更大的葡萄糖需求[8]。在高血糖的情況下,結(jié)直腸癌組織的生長進一步加速。此外,糖尿病患者血糖控制不佳會激活多元醇和己糖胺代謝途徑,兩者都可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。Ras作為G蛋白家族的一員,由不同氨基酸構(gòu)成。在生理條件下,非活性Ras(GDP結(jié)合)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?GTP結(jié)合),并激活MEK激酶,MEK激酶進而激活ERK激酶。ERK1/2的激活隨后磷酸化許多底物,從而調(diào)節(jié)細胞代謝凋亡[9]。盡管Ras在許多信號通路的激活中充當(dāng)控制開關(guān),但ERK1/2似乎是Ras點突變可以激活的最重要的通路之一。近幾十年來的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了病理性過度激活的RAS-RAF-MEK-ERK1/2信號級聯(lián)與小細胞肺癌、結(jié)直腸癌之間的因果關(guān)系[10]。本研究中,通過對結(jié)直腸癌患者Ras-ERK1/2信號表達水平檢測發(fā)現(xiàn):結(jié)直腸癌合并2型糖尿病組中Ras、ERK1/2陽性表達率較結(jié)直腸癌組相比顯著升高。與上述研究結(jié)果一致:高糖環(huán)境下病理性過度激活的Ras蛋白進而啟動了ERK1/2信號傳導(dǎo),這個通路涉及多個級聯(lián)的激酶,包括Raf和MEK,最終導(dǎo)致ERK(絲/蘇氨酸蛋白激酶)的磷酸化。磷酸化ERK1/2進入細胞核,啟動控制腫瘤細胞侵襲能力的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。以往研究結(jié)果還表明,糖尿病合并結(jié)直腸癌患者的不良結(jié)局可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的增加有關(guān)[11]。我們研究與此一致:Ras-ERK1/2信號表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否和術(shù)后生存時間密切相關(guān)。這提示Ras-ERK1/2是2型糖尿病合并結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)原因。我們推測:結(jié)直腸癌合并2型糖尿病組中Ras、ERK1/2可能通過調(diào)節(jié)細胞代謝凋亡,導(dǎo)致了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的增加,從而縮短了患者的術(shù)后生存期。

這些研究結(jié)果為我們深入了解結(jié)直腸癌合并2型糖尿病的分子機制提供了重要線索,并為開發(fā)相關(guān)治療策略和預(yù)防措施提供了新的目標(biāo)。然而,需要進一步的研究來驗證這些發(fā)現(xiàn),并探索相關(guān)通路在治療中的潛在應(yīng)用價值。綜上所述,結(jié)直腸癌合并2型糖尿病組患者Ras-ERK1/2信號表達升高,與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存期密切相關(guān)。但本研究觀察指標(biāo)有限,今后應(yīng)深入研究2型糖尿病合并結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制。