郝夢啟, 姬佩雲(yún), 高秀娟, 莊新榮, 張桂香, 張雅麗

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科, 河北 承德 067000)

子宮內(nèi)膜異位癥是慢性炎癥性良性婦科疾病,具有惡性腫瘤的特點,且EMT患者罹患癌癥風(fēng)險較高[1]。目前人們對這種疾病的病因解釋不明確,免疫失衡現(xiàn)被提出以解釋異位子宮內(nèi)膜組織的起源[2]。NLRC3是先天免疫細胞炎癥信號通路的負調(diào)控因子,發(fā)揮免疫監(jiān)視作用,參與自身免疫調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前NLRC3在EMT患者中的表達研究較少。本研究通過比較Ⅲ期、Ⅳ期EMT患者卵巢異位內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織中NLRC3的表達水平,進一步討論其在EMT發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料:收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2020年12月至2022年4月進行手術(shù)的卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者。納入標準:患者經(jīng)組織病理學(xué)診斷為卵巢EMT,年齡26～48歲。排除標準:經(jīng)性激素類藥物治療的患者,患有自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、急慢性炎癥、惡性腫瘤的患者。EMT患者按照美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(American Society for Reproductive Medicine,ASRM)關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的分期(rASRM分期)分為:Ⅲ 期17例,年齡24～45歲,平均(35.4±6.2)歲;Ⅳ期17例,年齡26～48歲,平均(36.2±6.4)歲。痛經(jīng)NRA評分標準:0分:無痛經(jīng);1～3分:輕微痛經(jīng);4～6分:嚴重痛經(jīng),尚能忍受;7～10分:嚴重痛經(jīng),需口服止痛藥物。同時收集17例因異常子宮出血行診斷性刮宮或因子宮肌瘤行子宮切除患者的子宮內(nèi)膜作為對照組,經(jīng)組織病理學(xué)診斷為正常子宮內(nèi)膜組織,年齡25～42歲,平均(33.7±4.8)歲。三組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。收集的組織一部分置入4%多聚甲醛固定,剩余組織用0.9%生理鹽水沖洗后置入液氮中。

1.2主要試劑:SuPerbrilliant 6min高純RNA提取試劑盒購于中實基因科技有限公司。FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix Plus試劑盒均購于天根生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購于北京Solarbio科技有限公司。NLRC3蛋白抗體購于美國NOVUS生物技術(shù)公司。GAPDH抗體及山羊抗兔熒光二抗來自于ABclonal生物公司。免疫組化試劑盒和DAB顯色劑來自于北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3方 法

1.3.1免疫組化:所取組織經(jīng)石蠟固定包埋,檸檬酸鹽(pH=6.0)修復(fù)液進行抗原修復(fù),內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10min,封閉用山羊血清工作液進行封閉,37℃孵育20min,一抗(濃度為1∶50)孵育過夜,37℃孵箱復(fù)溫45min,二抗孵育20min,顯色劑顯色,蘇木素復(fù)染1min,1%鹽酸酒精分化30s,樹膠封片。

1.3.2Western Blot:高效RIPA裂解液提取組織獲得總蛋白,用BCA法對總蛋白進行定量檢測,取等量蛋白進行SDA-PAGE,分離膠濃度(10%),濃縮膠電泳80V 20min,分離膠電泳110V,按marker和loading buffer位置停止電泳。300mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5h。5%脫脂奶粉封閉1h,加入NLRC3抗體(1∶100),4℃冰箱孵育過夜,加入二抗,室溫孵育1h(GAPDH抗體,1∶5000)。使用掃描儀掃描目的條帶。

1.3.3qRT-PCR:采用SuPerbrilliant 6min高純RNA提取試劑盒提取組織中的RNA。在Nanodrop RNA定量測定儀中檢測樣品的OD值,要求1.8≤A260/A280≤2.0且1.8≤A260/A230≤2.3,間接計算出樣品中RNA含量以進行下一步實驗。根據(jù)Fastking一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒進行操作,條件:42℃ 2min,95℃ 3min。SupperRead熒光定量預(yù)混試劑按照說明進行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系:20μL。條件:95℃ 10min預(yù)變性,95℃ 15s,60℃ 1min,72℃ 30s進行45個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參,測量每個樣品的CT值,每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔,記錄并統(tǒng)計獲得的結(jié)果,計算目的基因在各組組織中相對于內(nèi)參的表達量Q。Q=2-ΔΔCT,△Ct目的基因= Ct目的基因-Ct β-actin基因,△△Ct=△Ct-Ct mean值(對照組平均值)。各引物序列如下:

β-actin F:5ˊ-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3ˊ

R:5ˊ-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3ˊ

NLRC3 F:5ˊ-TGGCAGTGAGAGAAAACCGCAC-3ˊ

R:5ˊ-CTAAGCTGGTGAGGCTCCTGTT-3ˊ

1.3.4免疫組化結(jié)果判讀:由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法對染色結(jié)果閱片。NLRC3表達的評分標準:每張切片隨機觀察5個高倍視野(×400),根據(jù)陽性細胞著色強度及染色面積進行評分。著色強度:無染色0分,淺黃色1分,棕黃2分,棕褐色3分。著色面積:<30%評1分,30%～60%評2分,>60%評3分。兩項相加結(jié)果:0分為陰性(-),1～2分為弱陽性(±),3～4分為陽性(+),5～6分為強陽性(++)。陰性及弱陽性均視為陰性,陽性及強陽性均視為陽性進行組間比較。

2 結(jié) 果

2.1NLRC3在正常子宮內(nèi)膜組、Ⅲ期EMT、Ⅳ期EMT中的表達:免疫組化結(jié)果顯示,NLRC3陽性表達主要位于細胞漿,胞核及間質(zhì)中無表達或較少表達。正常子宮內(nèi)膜、Ⅲ期EMT、Ⅳ期EMT組中NLRC3蛋白陽性表達率分別為:76.5%(13/17)、23.5%(4/17)、29.4%(5/17),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化、Western Blot、qRT-PCR結(jié)果均顯示:與正常子宮內(nèi)膜組相比,NLRC3表達水平在Ⅲ期、Ⅳ期EMT組中均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0125)。NLRC3的表達在Ⅲ期、Ⅳ期EMT組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1、2、3,表1、2)。

圖1 免疫組化結(jié)果:NLRC3在各組中的表達(放大倍數(shù):400×);A:正常子宮內(nèi)膜;B:Ⅲ期EMT;C:Ⅳ期EMT

圖2 Western Blot結(jié)果:各組中NLRC3的相對表達量

圖3 各組中NLRC3mRNA的相對表達量

表1 Western Blot結(jié)果:NLRC3在各組中的相對表達量

表2 各組中NLRC3mRNA的相對表達量[M(P25,P75)]

2.2NLRC3表達與EMT患者臨床病理特征的關(guān)系:病理切片分析顯示:不同年齡、不同分期、不同病灶大小、不同痛經(jīng)程度EMT患者中NLRC3陽性表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);CA125水平高者NLRC3表達陽性率更低(P<0.05),見表3。

表3 NLRC3表達與臨床病理特征的關(guān)系n(%)

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計,全世界約有1.76億女性患有EMT,其被認為是免疫相關(guān)的慢性炎癥性婦科良性疾病[3]。有關(guān)EMT的發(fā)病機制,已有許多學(xué)者提出相關(guān)假說,但均不能單獨解釋EMT的發(fā)生。研究顯示,EMT患者腹腔微環(huán)境中某些免疫信號通路及免疫細胞(如巨噬細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、輔助性T細胞1(Th1)、輔助性T細胞17(Th17)、腹膜液中多種炎癥介質(zhì)和生長因子等)的水平都發(fā)生了改變[4-5]。因此,EMT的發(fā)生可能與腹腔微環(huán)境免疫失衡有關(guān)。

核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸的重復(fù)性家族(NLR)蛋白是先天性免疫傳感器,可識別高度保守的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)。NLRC3是NLR家族中新發(fā)現(xiàn)且特征不完全的成員,其在T淋巴細胞中高表達,負調(diào)控炎癥信號通路。NLRC3在多種自身免疫性疾病及炎癥相關(guān)性腫瘤中異常表達,它可能是治療驅(qū)動自身免疫性疾病的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的潛在靶標,也能通過調(diào)節(jié)某些信號通路抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。Uchimura等[6]認為NLRC3對T淋巴細胞的抑制作用是適度的,其微調(diào)自身免疫反應(yīng),在病灶微環(huán)境中發(fā)揮免疫監(jiān)視的作用。Fu等[7]發(fā)現(xiàn),NLRC3降低了樹突狀細胞(DC)的抗原呈遞功能及其激活和促進CD4+T細胞分化為Th1和Th17亞群的能力,NLRC3的缺失促進致病性Th1和Th17的反應(yīng),從而罹患自身免疫性腦脊髓炎(EAE)。因此,靶向治療NLRC3可以作為減輕T細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病或自身免疫性疾病的治療策略。Kang等[8]通過敲低NLRC3證實肝細胞癌細胞系HuH-7細胞凋亡被抑制,促進肝細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Karki等[9]在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸腫瘤小鼠模型中的研究中首次證實了NLRC3表達缺陷的小鼠易發(fā)生結(jié)腸炎癥,持續(xù)存在的炎癥最終導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生。因此,靶向治療NLRC3可以作為抑制腫瘤細胞增殖的治療策略。

目前關(guān)于NLRC3在EMT患者發(fā)生發(fā)展中的作用以及具體機制研究尚少。Suryawanshi等[10]報道稱EMT患者的病變具有獨特的免疫微環(huán)境,類似于腫瘤樣炎癥的特征。EMT類似腫瘤的特點,如增殖、浸潤及遠處轉(zhuǎn)移等,也提示其與腫瘤的發(fā)生過程有一些相同特征。正常情況下,自身免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫監(jiān)視作用,識別、殺傷并及時清除突變細胞。當宿主免疫監(jiān)視功能低下或受到抑制時,腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸,促進腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移。卵巢異位子宮內(nèi)膜的種植涉及機體炎癥、免疫及類似腫瘤的過程,炎癥和免疫反應(yīng)可促進腫瘤的發(fā)生、生長和進展,免疫系統(tǒng)的抗腫瘤形成功能發(fā)揮了對腫瘤異質(zhì)性的免疫監(jiān)視作用[11]。因此推測NLRC3在EMT免疫失衡中發(fā)揮了重要作用。本實驗檢測了NLRC3在正常子宮內(nèi)膜組織及Ⅲ期、Ⅳ期EMT異位內(nèi)膜組織中的表達情況。免疫組化、WB、qRT-PCR結(jié)果均顯示NLRC3在Ⅲ期、Ⅳ期EMT中表達水平顯著低于正常子宮內(nèi)膜組。進一步分析NLRC3在Ⅲ、Ⅳ期EMT組織中的表達,結(jié)果顯示不同分期中NLRC3的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。我們目前的研究僅限于Ⅲ～Ⅳ期EMT患者,收集的Ⅰ～Ⅱ期EMT患者例數(shù)不足以進入分組,而Ⅲ、Ⅳ期EMT卵巢異位子宮內(nèi)膜中的免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)差異可能不明顯。因此,需要增加Ⅰ期、Ⅱ期的患者標本,以進一步挖掘不同病變等級EMT和NLRC3表達之間可能存在的關(guān)系。

因此,NLRC3代表的免疫監(jiān)視功能的下調(diào)可能參與了EMT腹腔微環(huán)境免疫失衡狀態(tài)。人體內(nèi)輔助性T細胞(Th1、Th17)和Treg細胞的平衡可以清除外來微生物,從而避免機體發(fā)生感染或病變。當患者腹腔微環(huán)境NLRC3表達減少或缺乏時,其激活和極化CD4+T細胞為Th1和Th17亞群的能力下降,使EMT腹腔微環(huán)境中輔助性T細胞(Th1、Th17)和Tregs處于免疫失衡狀態(tài),從而減少異位子宮內(nèi)膜的清除,使異位子宮內(nèi)膜發(fā)生免疫逃逸,進而導(dǎo)致EMT的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn),EMT中CA125水平高者的NLRC3表達陽性率更低,在EMT發(fā)生發(fā)展過程中,NLRC3是極具潛力的一個指標,同時,聯(lián)合檢測CA125和NLRC3的表達可能為預(yù)測或診斷EMT發(fā)揮良好的作用,本研究的不足之處在于僅限于檢測EMT患者卵巢異位子宮內(nèi)膜組織中NLRC3的表達,而缺少血清學(xué)方面的檢驗,需要在后續(xù)的實驗中進一步完善,以評估其在臨床診斷治療中的相關(guān)潛力。

綜上所述,子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病與腹腔微環(huán)境免疫失衡有關(guān),NLRC3代表的免疫監(jiān)視功能下降或缺失可能參與EMT的發(fā)生發(fā)展,但其確切的機制有待深究。聯(lián)合檢測CA125和NLRC3的表達可能為預(yù)測或診斷EMT發(fā)揮良好的作用。