安媛媛·安林, 籍雁敏, 熱西丹·阿布力海提, 木尼熱·買買提尼牙孜, 佐日汗·艾依薩

(1.新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院兒科, 新疆 烏魯木齊 830000 2.新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科, 新疆 烏魯木齊 830000)

缺鐵性貧血(IDA)是一種常見且危害性大的疾病,可引起人體血液中血紅蛋白含量的顯著下降,導致貧血、暈厥和易怒等病癥[1-2]。研究表明,IDA與Hepcidin的缺乏有關,Hepcidin是由HAMP基因編碼,由肝細胞產(chǎn)生的多肽激素,當Hepcidin被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中,可與十二指腸腸細胞和脾臟巨噬細胞相互作用,從而直接降解鐵轉(zhuǎn)運蛋白,從而減少鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達[3]。研究表明,Hepcidin與鐵蛋白、鐵和血紅蛋白的水平呈顯著正相關,而且Hepcidin可作為IDA的生物學標志物[4]。然而,體內(nèi)Hepcidin的水平受何種機制調(diào)控還不清楚。小G蛋白信號傳導蛋白1/5/8(SMAD1/5/8)屬于SMAD蛋白家族,是一類關鍵的轉(zhuǎn)錄因子,其在細胞凋亡、血管生成、免疫反應、組織定位以及胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用[5]。最近,有關Hepcidin調(diào)節(jié)機制的研究表明,SMAD1/5/8直接參與了Hepcidin表達的調(diào)節(jié),當激活SMAD1/5/8信號后肝細胞中的Hepcidin表達顯著上調(diào)[6]。另外,SMAD1/5/8在上游受到多種長鏈非編碼RNA(lncRNA)的調(diào)控[7]。lncRNA是一種轉(zhuǎn)錄長度超過200nt的非編碼RNA,不僅廣泛表達于IDA患者體內(nèi),而且靶向轉(zhuǎn)錄因子、激活因子、抑制因子等多種基因,調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達,參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[7]。lncRNA已被多次報道調(diào)控鐵的代謝,還能參與調(diào)控肝細胞的損傷,并與Hepcidin的表達密切相關[8]。叉頭基因結構域同源蛋白D3長鏈非編碼RNA1(lnc-FOXD3-AS1)是一種新報道的lncRNA,密切參與多種細胞的增殖、凋亡、炎癥損傷和并調(diào)節(jié)細胞中SMAD1/5/8信號的表達。然而,目前并不清楚lnc-FOXD3-AS1對IDA和Hepcidin的調(diào)控作用。本文旨在研究lnc-FOXD3-AS1對IDA大鼠Hepcidin調(diào)控作用并探討了潛在機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組:雄性SD大鼠體重為200±15g,共50只,購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心,飼養(yǎng)條件為溫度22±2℃,濕度60 5%,日/夜周期為12h。大鼠隨機數(shù)字表法分為5組。包括對照組,IDA組,IDA大鼠經(jīng)100μg/kg lnc-FOXD3-AS1過表達載體(靜脈注射)治療組(pcDNA-FOXD3-AS1+IDA組)、IDA大鼠經(jīng)過表達空載體(100μg/kg靜脈注射)治療組(pcDNA-null+IDA組)、IDA大鼠經(jīng)pcDNA-FOXD3-AS1聯(lián)合Smad1/5/8的激活抑制劑Compound C(25mg/kg,靜脈注射)治療組(pcDNA-FOXD3-AS1+Compound C+IDA組),每組n=10。IDA組以玉米淀粉為主要成分配制一種低鐵飼料喂養(yǎng)聯(lián)合眼眶靜脈重復放血建立IDA大鼠模型。低鐵飼料配方:玉米淀粉99%,鹽0.7%,混合維生素0.1%,微量元素0.1%,氯化膽堿約0.1%,原子吸收光譜法測定鐵含量為10.1mg/kg。采用低鐵飼料配合每隔1d眶靜脈重復放血,連續(xù)14d,建立實驗性IDA模型。大鼠從無鐵裝置中獲得食物和蒸餾水,該裝置用于防止從水中攝入外來鐵。整個實驗過程嚴格控制,避免鐵污染。將正常飼料喂養(yǎng)的大鼠分為對照組。pcDNA-FOXD3-AS1+IDA組、pcDNA-null+IDA組、pcDNA-FOXD3-AS1+Compound C+IDA組大鼠藥物干預與造模開始同步,每隔1d靜脈注射1次,連續(xù)14d。14d后用含乙二胺四乙酸真空管收集各組血液,安樂死大鼠收集肝臟組織,保存6只新鮮肝臟組織用于western blot和qRT-PCR檢測,剩余4只肝臟組織片制作冷凍切用于免疫熒光化學檢測。

1.2酶聯(lián)免疫吸附實驗:取各組血清,12000rpm/min離心10min,然后在20℃下保存直至分析。根據(jù)制造商說明書(美國USCN Life公司),用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清和肝臟研磨后中Hepcidin水平。并使用原子吸收光譜儀(美國VARIAN公司,AA-240 FS型)測定血清中鐵含量。

1.3qRT-PCR檢測Lnc-FOXD3-AS1的表達:用TRIzol regent(美國Invitrogen公司)從組織或血清中提取總RNA。通過分光光度法測定RNA的濃度和純度,并使用PrimeScript RT逆轉(zhuǎn)錄酶試劑試劑盒(日本Takara公司)按照制造商的方案合成互補DNA。qRT-PCR分析使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(日本Takara公司)和StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)(美國Applied biosystems)進行。LncRNA HAGLR表達以GAPDH為內(nèi)參基因,用ΔΔCt法測定基因的相對表達量。目的基因引物由上海生工生物技術有限公司設計。引物序列如下(5’-3’):lnc-FOXD3-AS1 正向5'- ACCAGAGGAAGGAGCACGA-3';反向5'-AGAAGCACCACTGTCCATCC-3';;GAPDH 正向5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3',反向 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。相對定量使用2-ΔΔCT方法。

1.4Western blot檢測肝臟組織中Hepcidin和SMAD1/5/8的表達:制備肝組織裂解物:切碎的肝臟樣品在含1% NP-40、1mg/mL pepstatin、1mg/mL leupeptin、1mg/mL抑肽蛋白和100mg/mL苯基甲基磺酰的1mL TBS(pH 7.5)緩沖液中裂解。在4℃,12000g離心15min,收集上清液。蛋白濃度由Bio-Rad試劑盒(上海碧云天生物公司)進行檢測。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測細胞總蛋白,并將其電印跡到硝化纖維膜上(英國Amersham Pharmacia Biotech公司)。將膜用5%的脫脂牛奶封閉2h,然后在4℃下與一抗孵育10h。免疫復合物用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG抗體(1∶5000)孵育。最后,使用Western-Light化學發(fā)光檢測系捕獲蛋白信號表達。所有實驗均重復3次?？贵w濃度為Hepcidin(1∶1000)、SMAD1/5/8(NB100-56656,1∶800)、磷酸化的SMAD1/5/8(Ser463/465)(AB3848,p-SMAD1/5/8)(1∶500)。

1.5肝臟組織免疫熒光化學法檢測Hepcidin和SMAD1/5/8的表達:對肝組織的冷凍切片進行免疫染色,在pH為6.0的檸檬酸中進行熱介導抗原回收,并用10%的BSA進行封閉。將載玻片與Hepcidin的抗體孵育,并用Alexa Fluor 594偶聯(lián)抗兔抗體和Fluor 488偶聯(lián)抗小鼠抗體標記。用DAPI (美國Sigma公司)對細胞核進行染色,用共聚焦鏡(德國蔡司公司)捕獲免疫熒光信號。

2 結 果

2.1IDA大鼠體內(nèi)鐵含量和Hepcidin、lnc-FOXD3-AS1和SMAD1/5/8的表達變化:與對照組比,IDA組中大鼠肝臟組織和血清中鐵含量明顯降低(均P<0.05),而且外周血HGB含量僅為78.29±5.26g/L。見表1。表明大鼠IDA模型建立成功。與對照組比,IDA組中Hepcidin、lnc-FOXD3-AS1和SMAD1/5/8的表達水平都顯著降低(均P<0.05),另外肝臟組織中SMAD1/5/8的磷酸化水平也顯著降低(P<0.05),見圖1和表2。

圖1 大鼠肝臟中Hepcidin和SMAD1/5/8蛋白表達

表1 大鼠肝臟鐵和血清鐵以及血紅蛋白中含量

表2 大鼠肝臟中Hepcidin lnc-FOXD3-AS1和SMAD1/5/8的相對表達

2.2過表達lnc-FOXD3-AS1增加IDA大鼠肝臟和血清中的Hepcidin表達:與pcDNA-null+IDA組比,pcDNA-FOXD3-AS1+IDA組肝臟組織和血清的lnc-FOXD3-AS1表達顯著升高,而且Hepcidin蛋白表達水平也顯著升高(均P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 大鼠肝臟中Hepcidin的表達

圖3 大鼠肝臟中SMAD1/5/8的表達

圖4 過表達lnc-FOXD3-AS1通過激活SMAD1/5/8促進體內(nèi)Hepcidin表達

表3 大鼠肝臟和血清中Hepcidin蛋白和lnc-FOXD3-AS1的相對表達

2.3過表達lnc-FOXD3-AS1激活IDA大鼠肝臟中SMAD1/5/8的信號:與pcDNA-null+IDA組比,pcDNA-FOXD3-AS1+IDA組的肝臟組織SMAD1/5/8的表達水平顯著升高(均P<0.05),而且SMAD1/5/8的磷酸化水平明顯升高(P<0.05),見圖3A-3B和表4。

表4 大鼠肝臟組織中的SMAD1/5/8的免疫染色強度和相對表達

2.4過表達lnc-FOXD3-AS1通過激活SMAD1/5/8促進體內(nèi)Hepcidin表達:與pcDNA-FOXD3-AS1+IDA組比,pcDNA-FOXD3-AS1+Compound C+IDA組的SMAD1/5/8的磷酸化水平明顯降低(P<0.05),說明SMAD1/5/8的激活被抑制。同時與pcDNA-FOXD3-AS1+IDA組比,pcDNA-FOXD3-AS1+Compound C+IDA組肝臟組織和血清中Hepcidin表達量明顯減少(均P<0.05)。見圖4,表5和表6。

表5 大鼠肝臟組織中的SMAD1/5/8的免疫染色強度和相對表達

表6 大鼠體內(nèi)Hepcidin的免疫染色強度和相對蛋白水平

3 討 論

Hepcidin是全身鐵平衡的主要調(diào)節(jié)因子,而SMAD通路是肝臟中Hepcidin表達的中心調(diào)節(jié)因子[9]。研究表明,SMAD/Hepcidin軸在調(diào)控Hepcidin對鐵的反應中起關鍵作用,當組織鐵負荷增加激活肝內(nèi)皮細胞中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白6并啟動信號級聯(lián)反應,從而激活轉(zhuǎn)錄因子SMAD1/5/8,使SMAD1/5/8轉(zhuǎn)位到細胞核中進行Hepcidin的轉(zhuǎn)錄[9]。然而,鐵缺乏調(diào)節(jié)肝臟SMAD信號通路以控制Hepcidin表達的機制尚不完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在肝細胞中FOXD3-AS1是一種新型SMAD信號和Hepcidin表達的調(diào)節(jié)因子,從而在改善缺鐵性疾病的治療具有重要意義。

本研究利用缺鐵飲食和放血誘導后,可同時顯著下調(diào)肝臟中l(wèi)nc-FOXD3-AS1的表達、Hepcidin和SMAD1/5/8的表達,而當過表達lnc-FOXD3-AS1后,肝組織和血清Hepcidin表達均明顯上調(diào),肝組織中SMAD1/5/8、p-SMAD1/5/8的表達也上調(diào)。表明lnc-FOXD3-AS1促進了Hepcidin介導的鐵代謝并激活了SMAD1/5/8信號。已知鐵代謝和非編碼RNA之間有密切關系,例如lncRNA核富集的轉(zhuǎn)錄物1可以直接通過分子海綿作用調(diào)控血清中Hepcidin的表達[8]。另外,miRNA-122也被證實可以靶向調(diào)控SMAD信號通路從而調(diào)控肝細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白6依賴的Hepcidin的轉(zhuǎn)錄[10]。重要的是,本研究證明了一個新的潛在候選標志物,lnc-FOXD3-AS,其在IDA大鼠體內(nèi)下調(diào),而過表達lnc-FOXD3-AS1后大鼠的鐵代謝標志物Hepcidin有明顯的上調(diào),表明lnc-FOXD3-AS1在IDA治療中具有激活SMAD1/5/8信號的作用和促進鐵生成的作用。

SMAD1/5/8是SMAD蛋白家族關鍵高度同源的轉(zhuǎn)錄因子簇,SMAD1/5/8蛋白分子量一致,其功能目前尚不完全清楚,但是已知的是其在細胞生長、分化、程序性死亡、衰老以及發(fā)育過程中均扮演重要角色[5]。研究表明,當SMAD1/5/8信號被外界信號激活,可以明顯促進肝細胞中Hepcidin蛋白表達[6]。另外,在甲狀腺癌中SMAD1/5/8的直接上游調(diào)控因子是lnc-FOXD3-AS1以及miRNA-296-5p,從而參與調(diào)控了癌細胞的增殖、凋亡以及遷移等生物學功能。本研究在IDA大鼠肝組織中發(fā)現(xiàn)SMAD1/5/8活性被抑制,當給予lnc-FOXD3-AS1過表達質(zhì)粒治療后又進一步顯著激活了SMAD1/5/8,包括SMAD1/5/8的蛋白表達被上調(diào),其Ser463/465位點磷酸化水平顯著性上調(diào),此過程還伴隨了鐵代謝標志物Hepcidin的表達增加。

為了更進一步明確lnc-FOXD3-AS1過表達介導的SMAD1/5/8激活與Hepcidin的表達增加有關,我們在lnc-FOXD3-AS1過表達的基礎上使用了SMAD活化抑制劑進行干預,結果表明Ser463/465位點的磷酸化水平被compound C顯著抑制,而同時我們也觀察到Hepcidin的表達受到抑制,這些結果均在lnc-FOXD3-AS1過表達的條件下實現(xiàn),表明lnc-FOXD3-AS1過表達可以通過激活SMAD1/5/8促進Hepcidin的表達。已證實compound C可以有效地抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白6介導的SMAD1/5/8的磷酸化[11],這支持了我們的研究結果,25mg/kg compound C靜脈注射能顯著抑制SMAD1/5/8的激活從而抑制了Hepcidin的表達,表明compound C抑制SMAD1/5/8的激活能逆轉(zhuǎn)lnc-FOXD3-AS1過表達的作用從而減少IDA的鐵代謝。以上研究結果均提示lnc-FOXD3-AS1扮演了SMAD1/5/8的激活信號,從而通過促進Hepcidin的表達改善了IDA中鐵代謝受限。

綜上所述,本研究證明低鐵飲食和放血誘導的IDA大鼠體內(nèi)lnc-FOXD3-AS1發(fā)生下調(diào),而過表達lnc-FOXD3-AS1可以通過激活SMAD1/5/8促進Hepcidin的表達。我們認為,lnc-FOXD3-AS1-SMAD1/5/8-Hepcidin途徑可能是調(diào)控IDA發(fā)生的一種新型生物學網(wǎng)絡。本研究深化了我們對IDA發(fā)生的生物學網(wǎng)絡機制的理解,對于開發(fā)針對IDA的治療策略具有重要意義。