劉婷雋

徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，江蘇 徐州 221004

肺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多步驟的過程。它們是由異?；蜃兓偷鞍踪|(zhì)表達(dá)引起的腫瘤，導(dǎo)致細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和進(jìn)展［1-3］。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌總發(fā)生率的80%以上，而肺腺癌（LUAD）是原發(fā)性肺癌的主要亞類（約85%）［4］。LUAD 潛伏期長，早期癥狀輕，惡性程度高。通常情況下，LUAD 患者在診斷時已進(jìn)入晚期，失去治療機(jī)會［5-6］。隨著各種靶向藥物的發(fā)展及其在LUAD 中的應(yīng)用，LUAD 患者的5 年生存率有所提高，尤其是程序性細(xì)胞死亡蛋白1/程序性細(xì)胞死亡蛋白配體1（PD-1/PD-L1）等免疫治療藥物的應(yīng)用［7］。因此，識別新的生物標(biāo)志物來預(yù)測免疫治療的療效是非常必要的。

溶酶體是一種高度酸性的膜結(jié)合細(xì)胞器，參與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外大分子的轉(zhuǎn)換［8-9］。溶酶體中含有50 多種酸性水解酶，用于細(xì)胞成分消化。為了防止這些水解酶和質(zhì)子的泄漏，從而破壞周圍的細(xì)胞溶質(zhì)環(huán)境（細(xì)胞溶質(zhì)酸化和蛋白水解），導(dǎo)致細(xì)胞死亡［10-11］。因此，細(xì)胞需要具有各種高度糖基化的整體蛋白的溶酶體膜來承受管腔酸性微環(huán)境。此外，溶酶體膜是與靶細(xì)胞器（如內(nèi)體和自噬體）相互作用的重要橋梁，有效的促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸［11］。

TM6SF1 位于人類15q24-q26 染色體和小鼠7 號染色體，轉(zhuǎn)錄本大小為1.4 kb，編碼370個氨基酸的蛋白質(zhì)，具有6個功能未知的跨膜結(jié)構(gòu)域，是一種廣泛表達(dá)的溶酶體跨膜蛋白［12］。有研究［12-13］利用熒光細(xì)胞成像技術(shù)，觀察到TM6SF1囊泡與溶酶體膜的一體化融合過程。已被證明在人腦、肺、肝、腎臟、脾臟、睪丸和外周血白細(xì)胞中表達(dá)。目前研究結(jié)果提示，TM6SF1異常高甲基化可能與某些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但其在肺腺癌中的作用仍不清楚。

本研究通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析TM6SF1 蛋白在肺腺癌中的表達(dá)情況，同時通過細(xì)胞實驗觀察過表達(dá)TM6SF1 后對A549細(xì)胞增殖、遷移的影響，進(jìn)而來探討TM6SF1基因在判斷肺腺癌預(yù)后和靶向治療中應(yīng)用的可行性。

1 實驗與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

A549、H1299、H1975、PC9、HCC78 和HBE 細(xì)胞生長于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，并加入1%的青鏈霉素，在37 ℃，5%CO2的飽和濕度下培養(yǎng)。分為空白對照組和實驗組，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，即可以用于實驗。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析

登錄GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/），利用General 和Survival Analysis 模塊，在線分析TM6SF1 基因在肺癌及正常組織中的表達(dá)情況及生存曲線。

1.3 細(xì)胞增殖活性檢測

將對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞以1× 105個/孔，接種于96孔板。細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)過夜，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。每孔加入20 μL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h。酶標(biāo)儀測定各孔OD 值（450 nm），計算分析各組細(xì)胞增殖情況。

1.4 過表達(dá)TM6SF1細(xì)胞株的構(gòu)建

NCBI網(wǎng)站檢索并設(shè)計TM6SF1 引物序列，用南京生工公司合成過表達(dá)載體513B，BamHI/XbaI 酶切，構(gòu)建513B-LV-TM6SF1過表達(dá)質(zhì)粒。

1.5 慢病毒包裝

使用促轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與293T 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染6 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清液。

1.6 慢病毒感染

將處于對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞以105個/mL 接種于6孔板，按照慢病毒感染復(fù)數(shù)=20 加入病毒并添加1∶1 500的聚凝胺進(jìn)行感染，以獲取穩(wěn)定過表達(dá)TM6SF1的A549細(xì)胞株。12 h 后換新鮮培養(yǎng)基。48 h 后提取蛋白，Western blot檢測TM6SF1的過表達(dá)效果。

1.7 RNA提取和RT-PCR分析

A549 細(xì)胞胰酶消化細(xì)胞，PBS 清洗一遍。使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，并反向轉(zhuǎn)錄為cDNA。對于RT-PCR，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green I Master 在LightCycler 480 中進(jìn)行實時定量PCR。TM6SF1 引物序列：正義：5'-CGGCCCAGCATGATTCCT-3'，反義：5'-TCCCGGGGTGGTTTTCTTTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為103 bp。GAPDH 引物序列:正義5'-TGCACCACCAACTGCT-TAGC-3'， 反義5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為87 bp。

1.8 細(xì)胞劃痕實驗

將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以5× 105個/孔，接種于6孔板，細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)過夜。第二天用10 μL 槍頭在培養(yǎng)皿中以“十”字形劃線。用PBS 洗去劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，同時拍照0 h 照片。繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，拍照并分析。

1.9 Transwell實驗

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，實驗前1 d 使用無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中饑餓培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，放入24 孔板中，小室及孔中加入500 μL 37 ℃預(yù)熱的無血清培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱2 h，小心吸去小室中的培養(yǎng)液。胰酶消化細(xì)胞，然后加入完全培養(yǎng)基吹打為單細(xì)胞懸液，1 000 rpm 離心5 min 離心沉淀細(xì)胞，吸取上清，PBS 溶液洗滌2 次去除完全培養(yǎng)基，離心沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀重懸于無血清的培養(yǎng)基中，調(diào)整好細(xì)胞濃度為1～5× 105/mL，取100 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室的上部，下室加入600 μL 完全培養(yǎng)基，細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS 清洗2 次，上下室分別加入600 μL 75%乙醇固定30 min；吸除乙醇， PBS 清洗2 次，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，雙蒸水清洗3 次后，自然晾干，于顯微鏡鏡下隨機(jī)選取10 個視野拍照并計數(shù)細(xì)胞。

1.10 Western blot

A549 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，PBS 清洗一遍，并用RIPA 裂解緩沖液（在冰上裂解30 min。使用BCA方法檢測蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)裝載到凝膠上進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到Hybond NC 膜上。在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1 h，并在4 °C 下與一級抗體孵育過夜。一級抗體如下：第二天，清洗膜，并在室溫下與適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶（HRP）結(jié)合二級抗體孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測印跡。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件通過One-way ANOVA 多及t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。以P＜0.05 為差義有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

2 結(jié)果

2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果

通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析得知，與正常組織相比，TM6SF1 在肺腺癌中的表達(dá)降低（*P＜0.05）（圖1A）；且TM6SF1 高表達(dá)肺腺癌患者生存時間明顯長于TM6SF1 低表達(dá)患者（**P＜0.001）（圖1B）。另外，TM6SF1 與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原Ki-67 具有負(fù)相關(guān)性（***P＜0.001）（圖1C）。這提示TM6SF1 在肺腺癌中可能具有抑制腫瘤的作用。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果

2.2 TM6SF1 基因在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及過表達(dá)TM6SF1細(xì)胞系的構(gòu)建

用WB 及qRT-RCR 分析5 株人肺腺癌細(xì)胞系中TM6SF1基因的表達(dá)情況。從WB結(jié)果可以看出，與正常支氣管上皮細(xì)胞HBE 相比，TM6SF1 蛋白在人肺腺癌A549、H1299、H1975、PC9 細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而在HCC78 中不明顯（圖2A）。qRT-RCR 結(jié)果顯示，除H1975 細(xì)胞以外，TM6SF1 基因在其他4 株肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)均下調(diào)（圖2A）。我們?nèi)M6SF1 表達(dá)較低的A549 細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 TM6SF1在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及過表達(dá)細(xì)胞株的鑒定

為了研究TM6SF1 在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)作用，研究在A549 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染目的基因TM6SF1。將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞總蛋白，WB 結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染LV-NC 相比， 轉(zhuǎn)染LV-TM6SF1-1 和LV-TM6SF1-2 后的A549 細(xì)胞中TM6SF1 表達(dá)明顯增加（圖2B），因此該細(xì)胞株即為穩(wěn)定表達(dá)TM6SF1的A549細(xì)胞株。

2.3 TM6SF1基因?qū)549細(xì)胞增殖的影響

為了進(jìn)一步研究TM6SF1對A549細(xì)胞增殖的影響，研究者進(jìn)行了細(xì)胞增殖實驗。CCK8實驗結(jié)果見圖3。在培養(yǎng)48 h 后，過表達(dá)TM6SF1 的A549 細(xì)胞與對照組相比，細(xì)胞數(shù)量明顯受到抑制，說明TM6SF1 抑制A549 細(xì)胞的增殖。

圖3 TM6SF1對A549細(xì)胞增殖的影響

2.4 細(xì)胞劃痕及Transwell實驗結(jié)果

為了闡述TM6SF1 在肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用，研究采用劃痕實驗和Transwell 小室來檢測TM6SF1 對侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。實驗結(jié)果顯示，A549 細(xì)胞中TM6SF1的表達(dá)上調(diào)后，肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱（圖4A）。在劃痕實驗中，過表達(dá)TM6SF1 后，A549 細(xì)胞的傷口愈合能力減弱。（圖4B）。這表明TM6SF1 在肺癌中起到抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

圖4 TM6SF1對A549細(xì)胞的侵襲和遷移的影響

2.5 Westren blot檢測PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白

PI3K/Akt 通路參與調(diào)控體內(nèi)細(xì)胞增殖、凋亡和分化等多種生物學(xué)功能，是目前NSCLC 最常見的調(diào)控途徑之一［14］。為了進(jìn)一步研究TM6SF1 是否參與調(diào)控PI3K/Akt 通路，采用WB 檢測PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。實驗結(jié)果，見圖5，過表達(dá)TM6SF1 后， p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt明顯降低。

圖5 TM6SF1對PI3K/Akt通路中Akt、pAkt、PI3K、p-PI3K表達(dá)量的影響

3 討論

近年來肺癌發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，位于我國惡性腫瘤死亡率之首，備受臨床及流行病學(xué)研究者的關(guān)注。而LUAD 是肺癌中常見的病理類型，它起源于小氣道上皮中分泌粘液的II 型肺泡細(xì)胞。轉(zhuǎn)移和侵襲率高是LUAD 最顯著的特征之一，盡管在手術(shù)切除、化學(xué)療法和放射療法方面已取得一定進(jìn)展，但其5 年生存率仍較低［15］，抗腫瘤藥物耐藥是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的重要原因之一。如何有效的預(yù)防和抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移是肺癌有效治療的關(guān)鍵因素。

TM6SF1 是六跨膜蛋白超家族的重要成員之一，其表達(dá)調(diào)控在很大程度上是未知的，但已證實該基因是miR-155 和miR-K12-11 的靶點［16］。此外，TM6SF1 在肝癌和腎癌中發(fā)生過甲基化［13，17］，這意味著TM6SF1 的表達(dá)以表觀遺傳方式受到高度調(diào)節(jié)。研究［18］發(fā)現(xiàn)，其異常高甲基化可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性。但其在肺腺癌中的作用還沒有報道。

在本實驗中，通過GSPIA 數(shù)據(jù)庫分析得知TM6SF1 在肺腺癌中的表達(dá)低于正常組織，且TM6SF1 與細(xì)胞增殖相關(guān)抗原Ki-67 具有負(fù)相關(guān)性。高表達(dá)TM6SF1 的肺腺癌患者具有更長的生存期。同時，在4 株肺腺癌細(xì)胞中證實，TM6SF1 低表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建過表達(dá)TM6SF1的A549細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TM6SF1能明顯促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，但具體是通過何種作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。另外，本研究只是通過GSPIA 數(shù)據(jù)庫分析得知TM6SF1 在肺腺癌中的表達(dá)低于正常組織，但在臨床樣本中的實際表達(dá)情況還不清楚，接下來研究者將分析臨床樣本中TM6SF1 的表達(dá)與癌癥分化程度、患者生存情況的相關(guān)性。在多數(shù)腫瘤中，PI3K/Akt 通路處于持續(xù)激活狀態(tài)，抑制PI3K/Akt通路可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［19］。TM6SF1 是否調(diào)節(jié)PI3K/Akt 通路影響細(xì)胞增殖尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TM6SF1 可下調(diào)PI3K/Akt 通路相關(guān)激酶的表達(dá)，下游信號通路受到抑制。溶酶體跨膜蛋白和自噬有著密切的關(guān)系。小鼠或細(xì)胞中一些溶酶體蛋白LAMP1、LAMP2 的缺失可引起自噬的發(fā)生，而LAPTM4B則可以抑制自噬。那么，TM6SF1 是否參與調(diào)節(jié)自噬，若參與自噬，其具體的機(jī)制是什么有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果為明確TM6SF1 在肺腺癌中的作用機(jī)制提供了實驗基礎(chǔ)，TM6SF1 可能作為一種新的抑癌基因，為肺癌的診斷治療提供新的證據(jù)。