陳雅明，蘇慧琳，曾元寧，，王秋紅

1.黑龍江中醫(yī)藥大學教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室·黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學中藥學院·廣東省中藥飲片規(guī)范化炮制工程技術研究中心，廣東 廣州 510006

鹽誘導激酶3（SIK3）是鹽誘導激酶家族成員之一，屬于5’-AMP 活化蛋白激酶（AMPK）相關激酶家族［1］。SIK3基因對調節(jié)肝臟糖異生［2］、調控細胞周期以及對腫瘤細胞［3］的生長有重要作用，在人體中各部位均有表達。有研究［4］表明，SIK3 蛋白在卵巢癌中和三陰性乳腺癌過度表達，能促進乳腺癌細胞的G1/S細胞周期的進程以及特異性趨化因子CXCR4 的釋放以誘導乳腺癌細胞增殖，增強mTOR 介導小鼠的有氧糖酵解［5］。此外，SIK3 基因的表達能抑制腫瘤細胞的生長［6］，能促進急性髓系白血病的發(fā)生［7］。在晚期漿液性卵巢癌中，SIK3在低表達患者的總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）低于高表達患者，敲除部分SIK3 基因的卵巢癌細胞能增加對紫杉醇加順鉑治療的化學抗性［8］。

SIK3基因對癌癥的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮著重要作用，可能是癌癥治療和預后生物標志物的潛在重要靶點。基于已有研究中癌癥發(fā)生發(fā)展與SIK3基因之間的聯系，本研究對SIK3基因表達在人類腫瘤中進行了泛癌化分析，使用TCGA數據庫和GEO 數據庫等探究SIK3 基因在腫瘤中的基因表達、生存狀態(tài)以及蛋白質磷酸化位點，并進行了SIK3基因與腫瘤相關成纖維細胞浸潤相關性分析，以研究SIK3基因在不同癌癥中的發(fā)病機制和臨床預后中的作用。

1 材料與方法

1.1 SIK3基因泛癌分析

分別在TIMER2（http://timer.cistrome.org/）和GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index） 中點擊“檢索”“基因”并輸入“SIK3”，檢索出SIK3 基因在腫瘤與正常組織之間的基因表達差異。

1.2 SIK3蛋白泛癌分析

在 Ualcan （http://ualcan.path.uab.edu/index.html） 和GEPIA2 的“Expression Analysis”模塊中的“Expression DIY”以獲得在TCGA 腫瘤組織不同病理階段（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期）中SIK3 基因型表達的小提取圖（P≤0.01）。

1.3 SIK3蛋白質磷酸化分析

在Ualcan 數據庫中輸入“SIK3”檢索，分析在原發(fā)性腫瘤和正常組織中SIK3細胞磷酸化位點，包括乳腺癌、卵巢癌、結腸腺癌、腎透明細胞癌、子宮內膜癌、肺腺癌。

1.4 泛癌分析SIK3基因的預后情況

利用在線工具GEPIA2 的“Survival Analysis”模塊中輸入“SIK3”以獲取“Overall Survival”和“Disease Free Survival”生存曲線圖。通過Cutoff-high （50%） and cutoff-low （50%） values作為高表達和低表達組的閾值。

1.5 SIK3基因遺傳變異分析

登錄cBioPortal 網站（https://www.cbioportal.org/），選擇“Query”中的“TCGAPanCencer Atlas Studies”，并輸入“SIK3”用于檢索SIK3 基因變異特征。變異的結果在“Cancer Types Summary”對所有TCGA 腫瘤的頻率、突變類型和CNA（拷貝數改變）進行展示。

1.6 SIK3與腫瘤相關成纖維細胞浸潤相關性分析

使用TIMER2數據庫的“Immune”模塊來探索SIK3表達與所有TCGA 腫瘤免疫浸潤之間的關聯，免疫細胞選擇CD8+T 細胞和腫瘤相關成纖維細胞。根據CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、 QUANTISEQ、 XCELL、 MCPCOUNTER 和EPIC 算法估計免疫浸潤。根據P 值與偏微分方程相關性（cor）值調整純度后的獲得數據，以熱圖和散點圖展示。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用TIMER 數據庫和GTEx 數據庫中下載的正常組織和腫瘤組織中的SIK3 mRNA 表達數據，進行Kaplan-Meier生存曲線分析，并采用Log-rank 檢驗。使用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SIK3基因在不同腫瘤中的表達

使用TIMER 數據庫和GTEx 數據庫聯合分析正常組織和腫瘤樣本中SIK3 mRNA 的表達水平。如圖1、圖2 所示，相比于正常組織，SIK3 基因在13 種癌癥中低表達，包括膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、結腸腺癌（COAD）、多形性膠質母細胞瘤（GBM）、腎透明細胞癌（KIRC）、 腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、 肺腺癌（LUAD）、肺鱗狀細胞癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）、直腸腺癌（READ）、甲狀腺癌（THCA）、子宮內膜癌（UCEC）、睪丸生殖細胞瘤（TGCT），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 TIMER數據庫中SIK3基因在不同癌癥中的表達情況

圖2 GTEx數據庫中SIK3基因在不同癌癥中的表達情況

2.2 SIK3蛋白在不同腫瘤中的表達

與正常組織相比，SIK3 蛋白在BRCA、KIRC、LUAD中為低表達，見圖3。使用HEPIA2A 數據庫后在病理分期圖中顯示，SIK3 表達與癌癥病理的不同時期有顯著差異，包括在BLCA、BRCA、KIRC、胰腺癌（PAAD）、THCA，見圖4。

圖3 SIK蛋白在不同癌癥中的表達情況

圖4 SIK蛋白在不同癌癥時期中的表達情況

2.3 SIK3生存分析數據

使用TGCA和GEO數據庫根據SIK3蛋白表達水平將腫瘤病例進行分類，并繪制Kaplan-Meier曲線以研究SIK3的表達與不同腫瘤患者的預后情況。SIK3的高表達與腎上腺皮質癌（ACC）預后不良存在相關性（P=0.014），預后SIK3 低表達存活率更高；SIK3 的低表達與KIRC、腦低級別膠質瘤（LGG）、間皮瘤（MESO）、PAAD、膽管癌（CHOL）、THCA 預后不良存在相關性，特別在KIRC 中，SIK3低表達導致生存率顯著降低，見圖5。

圖5 SIK3基因表達水平與不同癌癥預后關聯性分析

2.4 SIK3基因突變頻率在多種癌癥中的表達

使用cBioportal 工具研究SIK3 基因在各種腫瘤中的變異情況，見圖6。其中，子宮肌瘤中的SIK3 突變率為9.07%，其中突變頻率為8.51%（45/529），擴增頻率為0.19%（1/529），基因缺失頻率為0.38%（2/529）。

圖6 多種癌癥中SIK3突變頻率

2.5 SIK3蛋白在各種癌癥中的磷酸化位點及表達水平

使用Ualcan工具比較正常人與患者的組織和腫瘤之間SIK3蛋白磷酸化水平差異。使用CPTAC數據集，對6種類型腫瘤進行分析，包括BRCA、腎細胞癌（RCC）、COAD、LUAD、卵巢癌（OV）、UCEC。在乳腺癌中SIK3磷酸化水平降低，在RCC 中SIK3 磷酸化水平升高，在COAD 中SIK3 磷酸化水平降低，在LUAD 中SIK3 磷酸化水平降低，在OV 中SIK3 磷酸化水平降低，在UCEC 中SIK3 磷酸化水平降低，見圖7。

圖7 SIK3蛋白在不同癌癥中的磷酸化位點和表達水平

2.6 SIK3與腫瘤相關成纖維細胞浸潤的相關性分析

使用TIMER2 工具并根據EPIC、 MCPCOUNTER、TIDE算法用于研究在TGCA中SIK3與腫瘤相關成纖維細胞浸潤相關性分析，生成腫瘤的散點圖數據。SIK3在免疫浸潤T 細胞表達中，與COAD、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、HPV 感染的頭頸部鱗癌（HNSC-HPV +）、 PAAD、READ、胃癌（STAD）、TGCT、胸腺癌（THYM）呈正相關，與LGG 呈負相關。例如，基于MCPCOUNTER 算法，COAD 中SIK3 表達水平與癌相關成纖維細胞浸潤水平呈正相關（RHO=0.421，P=2.88e-13），見圖8。

圖8 SIK3與腫瘤相關成纖維細胞浸潤的相關性分析

3 討論

本研究通過對SIK3基因在人類腫瘤進行泛癌分析，探究了SIK3基因的表達情況、預后情況、基因變異、蛋白磷酸化位點及表達水平，最后對SIK3與腫瘤相關成纖維細胞浸潤的相關性進行分析。結果表明，SIK3在多種癌癥中異常表達，與正常組織相比，SIK3 基因在13 種癌癥中低表達，在不同癌癥的不同病理階段中SIK3蛋白的表達也有顯著差異，揭示了SIK3 基因的表達可能影響了BLCA、BRCA、 COAD、 GBM、 KIRC、 KIRP、 LUAD、 LUSC、PRAD、READ、THCA、UCEC 和TGCT 等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展。已有研究表明，SIK3 基因可參與小鼠的生命過程，調節(jié)關節(jié)的穩(wěn)態(tài)［9］，經敲除后能導致小鼠骨骼嚴重畸形，大多數在出生時死亡［10］。此外，SIK3 基因敲除后可導致小鼠發(fā)育過程中出現衰老［11］，同時還會出現糖異生缺陷［12］和內毒素休克的超敏反應［13］。Armouti 等［14］研究表明，16 周齡雌性小鼠SIK3 基因經敲除后，卵巢缺乏排卵前泡和黃體，并含有大量出血性卵泡，并內有均勻、無細胞、嗜酸性物質的沉積物。

通過Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現，SIK3 的高表達與ACC 預后不良存在相關性，預后SIK3 低表達存活率更高，揭示了SIK3 基因可能在ACC 中起促癌基因的作用。SIK3的低表達與KIRC、LGG、MESO、PAAD、CHOL、THCA預后不良存在相關性，特別在KIRC 中，SIK3 低表達導致生存率顯著降低，揭示SIK3基因可能在KIRC、LGG、MESO、PAAD、CHOL、THCA 中起抑癌基因的作用。此外在子宮肌瘤中SIK3 基因突變概率較高。進一步分析發(fā)現，SIK3 蛋白在RCC 中磷酸化水平升高，在BRCA、COAD、LUAD、OV和UCEC 5種癌癥中磷酸化水平降低。

已有研究［15］表明，SIK3 基因表達促進組蛋白乙酰化酶磷酸化后能誘導細胞增殖和惡性腫瘤的發(fā)生，SIK3過表達能促進細胞周期的進程并通過激活cSrc-磷酸肌醇3-激酶通道誘導細胞增殖，隨后p21 Waf/Cip1 下調，增加小鼠腫瘤的發(fā)生［14］。SIK3 能誘導促炎精氨酸代謝，通過MMP-9 激活誘導腫瘤轉移性蛋白CXCR4 的表達。三陰性乳腺癌細胞經高鹽和IL-17 共同刺激多種乳腺癌細胞后，SIK3蛋白表達特異性上調，協同誘導癌細胞的炎癥反應和增殖［16］。

腫瘤浸潤性免疫細胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與癌癥的發(fā)生、發(fā)展或轉移密切相關。據報道［17］，腫瘤微環(huán)境基質中的腫瘤相關成纖維細胞參與調節(jié)各種腫瘤浸潤免疫細胞的功能。根據EPIC、MCPCOUNTER、TIDE算法研究在TGCA 中SIK3 基因在免疫浸潤T 細胞中的表達，發(fā)現SIK3 基因與COAD、HNSC、HNSC-HPV+、PAAD、READ、STAD、TGCT、THYM 呈正相關，與LGG呈負相關，顯示了SIK3基因表達的預后價值。腫瘤微環(huán)境具有多種炎性細胞因子和趨化因子，已被證明可介導癌癥的進展和增殖。在腫瘤微環(huán)境中，雖然腫瘤細胞產生的抗炎活性氧和活性氮增加，但腫瘤細胞周圍存在相反的抗炎巨噬細胞表型，以抑制癌細胞的免疫消除，SIK3可能會根據細胞類型和單個細胞表型的細胞分化狀態(tài)發(fā)揮不同作用，這些細胞表型積累作用以促進腫瘤生長。有研究［18］表明，SIK3在多發(fā)性骨髓瘤和急性髓系白血病細胞系表達居較高水平。而實驗［19］表明，大黃素和小檗堿聯合用藥能顯著降低SIK3活性，抑制乳腺癌細胞的生長、阻滯細胞周期和凋亡。

綜上所述，SIK3基因的表達與人類多種腫瘤進程密切相關，SIK3在多種腫瘤細胞與正常細胞間存在顯著的差異表達，與ACC 等癌癥的預后和多種免疫浸潤T 細胞的表達存在相關性，表明SIK3 在腫瘤免疫微環(huán)境中起重要作用，可能作為腫瘤潛在診斷標志物以及癌癥治療新靶標。后續(xù)可研究SIK3 基因在癌癥細胞和正常細胞中的蛋白表達差異，進一步研究其在癌癥中的作用機制及相關通路分析。