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        二甲雙胍治療強(qiáng)直性脊柱炎模型小鼠后的骨密度與關(guān)節(jié)炎評分變化

        2024-01-04 07:27:16鄭錦暢向旻孫杰聰林瀚魏波吳少科胡資兵
        關(guān)鍵詞:小鼠實(shí)驗(yàn)模型

        鄭錦暢 向旻 孫杰聰 林瀚 魏波 吳少科 胡資兵

        廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱微創(chuàng)外科,湛江 524001

        強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)主要病理改變及影像學(xué)特征是關(guān)節(jié)及肌腱附著點(diǎn)的慢性炎癥、異位骨化和骨質(zhì)疏松[1-2]。AS 骨代謝異常是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和脆性骨折的直接原因,由多種信號通路調(diào)控[3-4]。目前,尚無藥物可完全終止AS 疾病的進(jìn)展。因此,尋找有效的藥物治療AS十分必要。

        二甲雙胍是經(jīng)典的降糖藥物。有研究顯示,二甲雙胍可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化過程[5]。McCarthy 等[6]研究,二甲雙胍促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的機(jī)制可能是通過激活ERK 信號通路和增加e/iNOS 表達(dá)引起的。Pham 等[7]的研究也證實(shí)了上述結(jié)果。Kasai 等[8]的研究發(fā)現(xiàn)大劑量的二甲雙胍導(dǎo)致成骨活性下降,小劑量的二甲雙胍促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化。二甲雙胍除了降糖作用以外,還具有參與糖尿病骨代謝、心血管保護(hù)、腫瘤抑制等作用[9-11]。但以上研究都是基于糖代謝異常的基礎(chǔ)上進(jìn)行的研究,二甲雙胍是否干預(yù)AS 骨代謝尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)用二甲雙胍灌胃AS 模型小鼠,探討其外周關(guān)節(jié)炎及骨密度的變化。

        資料與方法

        1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        研究時(shí)間為2021年9月至2022年6月。實(shí)驗(yàn)小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,無特定病原體(SPF)級,4 周齡健康雌性BALB/c 小鼠[許可證號SCXK(粵)2018-0002],體質(zhì)量(14±1)g,共30只,飼養(yǎng)環(huán)境60%~68%的相對濕度,室溫(23±2)℃,光照周期12∶12,光照強(qiáng)度15~20 Iux。所有小鼠進(jìn)行食物和水的自由飼養(yǎng)。

        本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(GDY2002276),本實(shí)驗(yàn)遵循和符合廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用規(guī)范(No.GDY2002276)。

        2.實(shí)驗(yàn)器材和試劑

        蛋白聚糖(皮爾斯,美國),弗羅因德的完全佐劑(Sigma,美國),弗羅因德的不完全佐劑(Sigma,美國),二甲雙胍(上海麥克林生化科技有限公司),阿佛丁(南京愛貝生物科技有限公司),電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器公司),雙能X光骨密度儀(MEDIX90,法國)。

        3.實(shí)驗(yàn)方法

        3.1.建模 小鼠喂飼至8 周,體質(zhì)量(25±2)g。隨機(jī)分成3組:二甲雙胍模型組、AS模型對照組、空白對照組,每組10只。模型鼠實(shí)驗(yàn)第1周每只腹腔注射100 μg蛋白聚糖加等體積弗氏完全佐劑,每隔3 周腹腔注射1 次,共注射3 次,后續(xù)兩次改蛋白聚糖加等體積弗氏不完全佐劑。觀察小鼠的步態(tài)和攀爬活動(dòng)。

        3.2.灌胃 造模成功后,二甲雙胍模型組小鼠用二甲雙胍灌胃,劑量為100 mg/kg,每天灌胃1 次,連續(xù)3 周。模型對照組和空白對照組小鼠灌胃等量生理鹽水。

        3.3.關(guān)節(jié)病變評分 觀察各組小鼠蛋白聚糖誘導(dǎo)和藥物干預(yù)后12 周的活動(dòng)情況及關(guān)節(jié)變化,按紅腫及活動(dòng)情況5 級評分[12]。無紅腫:0 分;關(guān)節(jié)紅不腫:1 分;關(guān)節(jié)輕度紅腫:2 分;中度紅腫:3 分;重度紅腫伴有功能障礙:4 分。病變關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)總和最高分16分。

        3.4.骨密度測定 即用型麻醉劑阿佛丁麻醉小鼠,每只小鼠腹腔注射0.5 ml,麻醉滿意后,骨密度儀掃描,分析每組小鼠腰椎、脛骨和股骨骨密度值。

        4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        采用SPSS 22.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用配對t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié)果

        1.蛋白聚糖誘導(dǎo)的脊柱關(guān)節(jié)炎模型小鼠外周關(guān)節(jié)炎評分(表1)

        表1 蛋白聚糖誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠的外周關(guān)節(jié)評分(分,± s)

        表1 蛋白聚糖誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠的外周關(guān)節(jié)評分(分,± s)

        注:二甲雙胍模型組小鼠用二甲雙胍灌胃,模型對照組和空白對照組小鼠灌胃等量生理鹽水。與模型對照組比較,aP<0.05

        小鼠在誘導(dǎo)3次完后未見明顯關(guān)節(jié)紅腫現(xiàn)象,第8周開始出現(xiàn)紅腫,模型組小鼠的關(guān)節(jié)評分在第12 周達(dá)到峰值。觀察至16 周,免疫鼠均出現(xiàn)不同程度的外周關(guān)節(jié)炎癥。16 周的二甲雙胍模型組小鼠關(guān)節(jié)評分明顯低于模型對照組,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        2.各組小鼠骨密度的變化(表2)

        表2 3組小鼠的骨密度測定值(g/cm2,± s)

        表2 3組小鼠的骨密度測定值(g/cm2,± s)

        注:二甲雙胍模型組小鼠用二甲雙胍灌胃,模型對照組和空白對照組小鼠灌胃等量生理鹽水。與模型對照組比較,aP<0.01,bP<0.05;與空白對照組比較,cP<0.05

        阿佛丁麻醉小鼠,等麻醉平穩(wěn)后,骨密度儀掃描各組小鼠,軟件分析每組小鼠腰椎、脛骨和股骨骨密度值。結(jié)果顯示,二甲雙胍模型組小鼠股骨和脛骨骨密度明顯高于模型對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

        討論

        AS 是一種慢性進(jìn)展的脊柱關(guān)節(jié)炎癥性疾病,常累及脊柱關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)、雙側(cè)的骶髂關(guān)節(jié)及外周關(guān)節(jié)。早期治療的目的是消炎鎮(zhèn)痛、預(yù)防畸形、控制病理進(jìn)展。目前,常用的藥物有NSAIDs、糖皮質(zhì)激素、抗腫瘤壞死因子生物制劑及免疫抑制劑(柳氮磺吡啶)等。學(xué)者黃雪艷[13]采用二磷酸鹽聯(lián)合碳酸鈣D3來治療強(qiáng)直性脊柱炎,可以改善骨與軟骨代謝,但至今無特效藥能控制進(jìn)展和根治AS。

        本實(shí)驗(yàn)用蛋白聚糖誘導(dǎo)免疫雌性BALB/c 小鼠,建造外周關(guān)節(jié)炎的AS 小鼠模型,再給實(shí)驗(yàn)?zāi)P托∈蠊辔付纂p胍3 周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)免疫8 周后小鼠出現(xiàn)外周關(guān)節(jié)炎癥狀,模型鼠在12 周關(guān)節(jié)炎分值達(dá)頂峰。二甲雙胍模型組的小鼠關(guān)節(jié)炎評分明顯低于模型對照組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明二甲雙胍對減輕AS 模型小鼠外周關(guān)節(jié)炎癥狀。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行骨密度檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型對照組小鼠骨密度明顯低于空白對照組小鼠的骨密度,說明該模型除了顯示外周關(guān)節(jié)炎癥狀外,小鼠骨代謝失去平衡,還出現(xiàn)了骨質(zhì)破壞和骨質(zhì)疏松的改變。本實(shí)驗(yàn)中,二甲雙胍模型組小鼠的骨密度值有明顯改善,與模型對照組小鼠比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),凸顯了二甲雙胍在增加小鼠成骨性能和抑制破骨作用方面的優(yōu)勢。

        本研究結(jié)果初步表明:蛋白聚糖誘導(dǎo)的AS 模型小鼠成骨與破骨代謝失去平衡,出現(xiàn)骨質(zhì)疏松改變及外周關(guān)節(jié)炎癥狀。二甲雙胍治療AS 模型小鼠,成骨代謝增強(qiáng),破骨代謝受到抑制。該研究結(jié)果將為日后進(jìn)一步的二甲雙胍治療AS 提供了科學(xué)依據(jù)。然而,本研究是基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究,所有的動(dòng)物模型都是比較單一的因素制作出來的,人體AS 疾病的發(fā)病機(jī)制遠(yuǎn)比實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型復(fù)雜。只有不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法,制作的動(dòng)物模型與人體AS 疾病的相似性越來越高,實(shí)驗(yàn)的精確度和可靠性就越大,這樣更有利于為日后的臨床研究提供更為豐富的精準(zhǔn)數(shù)據(jù)。

        利益沖突所有作者均聲明無利益沖突。

        作者貢獻(xiàn)聲明鄭錦暢、向旻、孫杰聰、林瀚:實(shí)施研究,采集數(shù)據(jù),分析和解釋數(shù)據(jù);胡資兵:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),文章撰寫,實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo);魏波、吳少科:對文章的知識性內(nèi)容審閱,參考文獻(xiàn)校對,統(tǒng)計(jì)分析,行政,技術(shù)和材料支持及指導(dǎo)

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