夏 飛, 曹時(shí)玲, 鄔培鴻, 高悅?cè)A, 成 欣

(陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

茯茶是一種后發(fā)酵茶,可以補(bǔ)充人體維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,具有減肥、助消化、降脂、調(diào)節(jié)腸道菌群[1,2]等多種功能,被茶學(xué)界認(rèn)定為21世紀(jì)健康飲料.在Eurotium cristatum(冠突散囊菌,俗稱“金花菌”)作用下,黑毛茶中大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì),形成茯茶特有醇厚滋味.因此冠突散囊菌的數(shù)量往往是判斷茯茶品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一.自古以來,茯茶深受奶肉食品為主的西北、邊疆乃至中亞各民族喜愛.近年來,人們對(duì)自身健康關(guān)注度不斷提高,茯茶因其健康功效受到了廣大消費(fèi)者的青睞.目前,傳統(tǒng)的茯茶種類相對(duì)單一,茯茶的加工工藝主要以經(jīng)驗(yàn)為主,不利于茯茶產(chǎn)品多元化以及茯茶產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展,亟待開發(fā)新的茯茶品類.現(xiàn)階段,茯茶新品類的開發(fā)主要是將黑毛茶與其他藥食同源物質(zhì)復(fù)配[3,4]或采用傳統(tǒng)茯茶加工工藝對(duì)其他藥食同源的植物資源加工[5,6]等方面.

蛹蟲草是一種與冬蟲夏草同屬的食藥用真菌,主產(chǎn)于云南、吉林、河北、內(nèi)蒙古等地區(qū)[7,8],具有調(diào)節(jié)免疫[9]、抗腫瘤[10]、抗菌、抗炎[11]及抗氧化[12]等多種功效.蛹蟲草中核苷類化合物、蟲草酸及多種氨基酸等[11,13]是其發(fā)揮藥用功能的物質(zhì)基礎(chǔ).蛹蟲草與黑毛茶復(fù)配,有望得到兼具免疫調(diào)節(jié)和降血脂、降血糖的復(fù)合功能性蛹蟲草茯茶,以豐富茯茶的功能,提升茯茶的飲用價(jià)值.然而,已有研究證實(shí),茯茶加工過程中,原料的配比及加工關(guān)鍵步驟會(huì)影響茯茶的品質(zhì)及其代謝產(chǎn)物組成特征[14-16].而關(guān)于蛹蟲草茯茶制作工藝的研究鮮少報(bào)道,其加工關(guān)鍵工藝步驟仍需進(jìn)一步研究.與傳統(tǒng)茯茶相比,蛹蟲草茯茶中特有的代謝產(chǎn)物,具有哪些特征還尚待闡明.通常,茯茶的品質(zhì)主要通過冠突散囊菌的數(shù)量以及代謝物來表征.茯茶加工過程中,汽蒸環(huán)節(jié)往往是影響茯茶中微生物的關(guān)鍵因素,物料配比決定了茯茶中物質(zhì)的組成及含量.

為明確影響蛹蟲草茯茶品質(zhì)的關(guān)鍵加工工藝及其代謝產(chǎn)物特征,本研究針對(duì)原料配比和加工過程中汽蒸時(shí)間對(duì)蛹蟲草茯茶品質(zhì)的影響展開關(guān)鍵工藝步驟的探索實(shí)驗(yàn).同時(shí),利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)對(duì)蛹蟲草茯茶中代謝產(chǎn)物特征進(jìn)行解析,揭示蛹蟲草茯茶特有的代謝產(chǎn)物種類組成.本研究進(jìn)一步促進(jìn)茯茶產(chǎn)品的多元化,并為深入開發(fā)蛹蟲草茯茶的功能提供理論物質(zhì)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售三四級(jí)黑毛茶,蛹蟲草(產(chǎn)地吉林).

主要試劑:甲醇、乙腈、異丙醇和甲酸均為色譜純.碳酸鈉、福林酚試劑、濃硫酸、苯酚、考馬斯亮藍(lán)G-250、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂等均為分析純.

1.2 主要儀器及設(shè)備

LRH-400-GS智能型人工氣候培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);SP-756PC紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);Wonbio-96c多樣品冷凍研磨儀(上海萬柏生物科技有限公司);JXDC-20氮?dú)獯祾邇x(海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司);Vanquish Horizon system UHPLC液相色譜系統(tǒng)(美國賽默飛世爾科技公司);ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(美國沃特世公司);Q-Exactive HF-X質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科技公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 汽蒸時(shí)間對(duì)蛹蟲草茯茶的影響

稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的蛹蟲草及黑毛茶共500 g,蛹蟲草切成茶葉大小,混合均勻.用高壓滅菌鍋分別汽蒸5 min、10 min、15 min、20 min、25 min,汽蒸溫度為100 ℃,汽蒸后渥堆4小時(shí).渥堆結(jié)束后,用蒸鍋汽蒸20 s,之后筑茶磚、標(biāo)記,放入人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi).茶磚間距5 cm,設(shè)定溫度為28 ℃,濕度78%,發(fā)花14天后取出備用.

1.3.2 原料配比對(duì)蛹蟲草茯茶的影響

將蛹蟲草分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%(FT)、2%(C-1)、4%(C-2)、6%(C-3)以及8%(C-4)與黑毛茶復(fù)配至500 g,按照1.3.1所述制備成品茶磚.

1.3.3 蛹蟲草茯茶內(nèi)含成分含量測(cè)定

蛹蟲草茯茶樣品中冠突散囊菌數(shù)量測(cè)定參考前人工作中所使用的方法[17].茶多酚含量測(cè)定參考《GB/T 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》.茶多糖含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定[18].蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[19].茶葉中干物質(zhì)含量測(cè)定參考《GB/T 8303-2013 茶 磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測(cè)定》.

1.3.4 蛹蟲草茯茶感官評(píng)審

參照GB/T 23776-2018《茶葉感官審評(píng)方法》對(duì)蛹蟲草茯茶進(jìn)行感官評(píng)審.

1.3.5 蛹蟲草茯茶代謝物特征分析

精確稱取50 ± 5 mg蛹蟲草茯茶樣品(CFT)和茯茶樣品(FT)至2 mL離心管中,加入一顆直徑6 mm的研磨珠.向離心管中加入400 μL 80%甲醇水,使用研磨儀研磨6 min(-10 ℃,50 Hz),低溫超聲提取30 min(5 ℃,40 KHz).將樣品于-20 ℃靜置30 min.在4 ℃下13 000 rpm離心15 min,移取上清液待測(cè).

LC-MS檢測(cè)分析色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm,Waters,Milford,USA);流動(dòng)相A為95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸),流動(dòng)相B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水(含0.1%甲酸).進(jìn)樣量為3 μL,柱溫為40 ℃.質(zhì)譜條件:樣品經(jīng)電噴霧電離,分別采用正、負(fù)離子掃描模式采集質(zhì)譜信號(hào).噴霧電壓(正模式)為3.5 kV,噴霧電壓(負(fù)模式)為-3.5 kV,S-Lens電壓為50 kV,鞘氣50 arb,輔助氣13 arb,加熱溫度為425 ℃,毛細(xì)管溫度為325 ℃,質(zhì)譜全掃模式下,儀器分辨率設(shè)置為60 000,掃描范圍為70～1 050 m/z.

1.4 數(shù)據(jù)處理

將代謝組原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件ProgenesisQI(Waters Corporation,Milford,USA)進(jìn)行基線過濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊等操作,最終得到含保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度等信息的數(shù)據(jù)矩陣.之后進(jìn)行特征峰搜庫鑒定,將MS和MS/MS質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫(http://www.hmdb.ca/)進(jìn)行匹配,MS質(zhì)量誤差設(shè)置為小于10 ppm,同時(shí)根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜匹配得分鑒定代謝物.對(duì)鑒定后的矩陣文件進(jìn)行過濾、補(bǔ)值、歸一化、對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化等數(shù)據(jù)預(yù)處理過程.

根據(jù)代謝物在不同樣本間的表達(dá)情況,對(duì)預(yù)處理后的矩陣文件進(jìn)行PCA主成分分析.進(jìn)而采用t檢驗(yàn)、OPLS-DA分析及倍數(shù)變化值(fold change)篩選差異代謝物(VIP>2,p<0.05).之后根據(jù)OPLS-DA模型,選擇VIP值前30的代謝物作為主要差異代謝物,以完全連鎖的方法對(duì)這30種關(guān)鍵差異代謝物進(jìn)行聚類,并對(duì)其含量值進(jìn)行歐式距離矩陣(Euclidean distance matrix)計(jì)算,繪制聚類熱圖.最后,通過KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)注釋差異代謝物參與的主要通路.

數(shù)據(jù)以“mean ± sd”表示.數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0軟件的Ducan′s多重比較法進(jìn)行差異性分析,并采用Origin 2022繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 蛹蟲草茯茶制備關(guān)鍵工藝

2.1.1 汽蒸時(shí)間對(duì)冠突散囊菌數(shù)量的影響

影響茯茶品質(zhì)形成的主要因素包括濕熱作用和微生物發(fā)酵作用,而汽蒸會(huì)影響茶葉原料中微生物的生存率.因此本研究首先關(guān)注汽蒸時(shí)間對(duì)蛹蟲草茯茶中冠突散囊菌數(shù)量的影響.汽蒸處理10 min的蛹蟲草茯茶樣品中,冠突散囊菌的數(shù)量達(dá)到1.4×105CFU/g,顯著高于其他汽蒸時(shí)間組.汽蒸處理5 min的蛹蟲草茯茶樣品中冠突散囊菌數(shù)量為1.2×105CFU/g.而當(dāng)汽蒸時(shí)間為15 min時(shí),冠突散囊菌數(shù)量最低,僅為6.7×104CFU/g.當(dāng)汽蒸時(shí)間為20 min及25 min時(shí),茯磚茶中冠突散囊菌數(shù)量明顯下降,這可能是由于汽蒸時(shí)間過長,增大了茶胚含水量[20],導(dǎo)致茯茶其他霉菌的快速生長.根據(jù)以上結(jié)果,最終選擇蛹蟲草茯茶的最佳汽蒸時(shí)間為10 min.

2.1.2 原料配比對(duì)蛹蟲草茯茶的影響

將蛹蟲草與黑毛茶按不同比例混合拼配后,汽蒸10 min制備蛹蟲草茯茶,以確定原料配比對(duì)蛹蟲草茯茶品質(zhì)的影響.蛹蟲草質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%(C-1)和4%(C-2)時(shí),蛹蟲草茯茶中茶多酚含量略有增加,然而并不具有顯著性.而6%(C-3)和8%(C-4)的蛹蟲草配比顯著降低了蛹蟲草茯茶中茶多酚的含量(p<0.05),尤其是C-4組中茶多酚含量最少,為47.84 ± 2.33 mg/g,顯著低于FT組(如圖1所示).表明蛹蟲草的添加能夠降低茶多酚含量,有利于改善茯茶的苦澀味.茶多糖的含量隨著蛹蟲草添加量的增多而逐漸增加,其中,C-4組的茶多糖含量最高,達(dá)到174.11 ± 2.70 mg/g(如圖1所示).然而,C-4組的茶多糖含量仍顯著低于FT組,表明在茯茶中添加蛹蟲草會(huì)降低茶多糖的含量,這可能是由于成品茶中蛋白質(zhì)類物質(zhì)含量的顯著增加.隨著蛹蟲草比例的增加,蛹蟲草茯茶中蛋白質(zhì)的含量顯著增高.C-4組蛹蟲草茯茶的蛋白質(zhì)含量達(dá)到233.89 ± 4.30 mg/g,較FT組增加了70.83 mg(如圖1所示).蛋白質(zhì)類物質(zhì)能夠提高茯茶的鮮爽程度,表明蛹蟲草的添加可以提升成品茶的鮮爽口感[5,6].成品茶中干物質(zhì)含量在C-1組中最高,為87.49 ± 0.06%,然而與C-2、C-3組中干物質(zhì)含量相比并沒有顯著性差異(如圖1所示).

圖1 不同原料配比的蛹蟲草茯茶內(nèi)含成分含量

2.1.3 感官評(píng)審

不同原料配比的蛹蟲草茯茶感官評(píng)審結(jié)果表明,隨著蛹蟲草添加量的增多,蛹蟲草茯茶的蟲草香逐漸濃郁,而湯色也會(huì)逐漸變成橙紅色,口感更醇和,且回感甘甜無澀味.其中以C-3組及C-4組色香味俱全,香氣濃、湯色紅、滋味佳(如圖2及表1所示).綜合不同原料配比蛹蟲草茯茶關(guān)鍵內(nèi)含物含量情況及感官評(píng)審結(jié)果,確定8%(C-4)的蛹蟲草比例為最佳的蛹蟲草茯茶配比.

表1 蛹蟲草茯茶的感官評(píng)審結(jié)果

圖2 蛹蟲草茯茶的茶湯評(píng)審

2.2 蛹蟲草茯茶(CFT)與茯茶(FT)的代謝物差異

2.2.1 主成分分析(PCA)

由PCA分析結(jié)果可知,正離子模式下,主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)和為59.28%(如圖3(a)所示).負(fù)離子模式下,主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)和為62.73%(如圖3(b)所示),該分析結(jié)果能較好的說明蛹蟲草茯茶代謝物組成特征.

圖3 CFT和FT組各樣本的PCA分析圖

PCA可以從總體上反應(yīng)各組樣本之間的總體差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小[21].蛹蟲草茯茶與茯茶樣本在正、負(fù)離子模式下均表現(xiàn)出明顯的分離趨勢(shì),蛹蟲草茯茶的代謝產(chǎn)物與茯茶的代謝產(chǎn)物差異較大[22],因此相較于傳統(tǒng)茯茶,蛹蟲草茯茶的代謝產(chǎn)物具有一定的獨(dú)特特征.

2.2.2 蛹蟲草茯茶代謝產(chǎn)物組成分析

利用差異火山圖分析蛹蟲草茯茶與茯茶的差異性標(biāo)志代謝物,使用VIP>2.0,p<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn).紅色點(diǎn)表示顯著上調(diào)的代謝物,藍(lán)色點(diǎn)表示顯著下調(diào)的代謝物,灰色點(diǎn)代表變化不顯著的代謝物.與茯茶相比,蛹蟲草茯茶有119種代謝物顯著發(fā)生變化,其中72種代謝產(chǎn)物相對(duì)含量顯著增加,47種代謝產(chǎn)物相對(duì)含量顯著下降(如圖4所示).

圖4 CFT與FT組間差異代謝物火山圖

通過文獻(xiàn)調(diào)研,蛹蟲草茯茶的差異代謝物主要可分為氨基酸及其衍生物、脂質(zhì)、生物堿、黃酮類、香豆素類、多酚、糖醇類、萜類等[21,23-25](如表2所示).其中,氨基酸及其衍生物是數(shù)量最多的差異代謝物,占總數(shù)19.33%.而核苷、核苷酸及其類似物、生物堿及其衍生物、香豆素類、萜類以及黃酮類化合物數(shù)量極少,占比均不足5%.除核苷酸類、香豆素類、萜類及黃酮類,蛹蟲草茯茶中其他類代謝產(chǎn)物均以上調(diào)為主,其中,氨基酸類代謝物上調(diào)數(shù)量明顯高于下調(diào)數(shù)量.因此,蛹蟲草茯茶中氨基酸類物質(zhì)含量高于傳統(tǒng)茯茶.

表2 CFT與FT的差異代謝物種類及變化情況

2.2.3 蛹蟲草茯茶與茯茶主要差異代謝成分分析

依據(jù)VIP>2,選取蛹蟲草茯茶和茯茶之間差異代謝產(chǎn)物的前30種進(jìn)行分析.與茯茶相比,蛹蟲草茯茶中有22種代謝物含量顯著增加(p<0.05),同時(shí)有8種代謝物顯著降低(p<0.05)(如圖5所示).共有14種代謝產(chǎn)物在蛹蟲草茯茶和茯茶之間差異非常明顯(VIP>4.0,p<0.05),其中顯著上調(diào)的代謝物包括Bursopoietin(法氏囊生成素,VIP=6.35),Azaleatin 3-arabinoside(杜鵑素3-阿拉伯糖苷,VIP=6.10),Toremifene(托瑞米芬,VIP=4.88),Deoxycholic acid(脫氧膽酸,VIP=4.54),1-Aminoglucose(1-氨基葡萄糖,VIP=4.46),Guanidino arginine(胍基精氨酸,VIP=4.43),Curcumenol(姜黃素醇,VIP=4.30),Quinolinic Acid(喹啉酸,VIP=4.16)及Gln Tyr Leu(谷氨酰胺、絡(luò)氨酸、亮氨酸,VIP=4.12)等.這些代謝物可能是蛹蟲草茯茶的主要特征代謝物.

圖5 CFT與CT組間主要差異代謝物相關(guān)性分析(VIP柱狀圖表示代謝產(chǎn)物在CFT和FT之間的差異.“＊”表示p<0.05;“＊＊”表示p<0.01;“＊＊＊”表示p<0.001)

2.2.4 蛹蟲草茯茶及茯茶間差異代謝物代謝途徑

對(duì)蛹蟲草茯茶中119種顯著差異性代謝物(VIP>2.0,p<0.05)進(jìn)行通路富集分析(如圖6所示).圖6中,X軸代表通路影響,Y軸代表通路富集,富集點(diǎn)直徑代表通路的豐度,深色代表更高的通路影響值.結(jié)果發(fā)現(xiàn)有四種代謝途徑在蛹蟲草茯茶與茯茶之間顯示出較高的途徑影響值.其中,精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)通路對(duì)蛹蟲草茯茶中P-Coumaroylagmatine(對(duì)?；一“?、4-Hydroxycinnamoylagmatine(4-羥基肉桂酰丁胺)、L-4-Hydroxyglutamate semialdehyde(L-4-羥基谷氨酸半醛)、L-Phosphoarginine(L-磷酸精氨酸)及Ornithine(鳥氨酸)等物質(zhì)的形成具有重要影響.氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)通路對(duì)蛹蟲草茯茶中UDP-N-acetyl-D-mannosamine(UDP-N-乙酰-D-甘露糖胺)、N-Glycolylneuraminic acid(N-羥乙酰神經(jīng)氨酸)、D-Glucuronic acid 1-phosphate(D-葡萄糖醛酸1-磷酸)及Uridine diphosphate-N-acetylglucosamine(尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖)的代謝影響也較大.而煙酸和煙酰胺的代謝(Nicotinate and nicotinamide metabolism)及精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)兩種代謝通路會(huì)影響蛹蟲草茯茶中Quinolinic Acid(喹啉酸)、6-Hydroxynicotinic Acid(6-羥基煙酸)、N-alpha-Acetyl-L-citrulline(N-α-乙酰-L-瓜氨酸)及Ornithine(鳥氨酸)等代謝物的變化.因此,蛹蟲草茯茶中的氨基酸類物質(zhì)含量相較于傳統(tǒng)茯茶有所增加,該結(jié)果與章節(jié)2.2.2一致.

圖6 CFT與FT的差異代謝物代謝途徑的拓?fù)浞治?/p>

3 結(jié)論

本研究探索了影響蛹蟲草茯茶品質(zhì)的關(guān)鍵加工步驟,并對(duì)蛹蟲草茯茶的代謝產(chǎn)物特征進(jìn)行解析.黑毛茶中添加8%的蛹蟲草,汽蒸10 min制得的蛹蟲草茯茶具有茶多酚含量低,茶多糖、蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn).且湯色橙紅透亮,口感醇和回甘.與傳統(tǒng)茯茶相比,蛹蟲草茯茶中氨基酸類物質(zhì)含量明顯增加.同時(shí),脂質(zhì)、生物堿、黃酮類、香豆素類、多酚、糖醇類、萜類等物質(zhì)也發(fā)生明顯變化.代謝通路分析證實(shí),蛹蟲草茯茶中氨基酸類物質(zhì)可能是通過精氨酸和脯氨酸代謝等途徑產(chǎn)生.本研究初步探索了蛹蟲草茯茶的加工工藝關(guān)鍵步驟,揭示了蛹蟲草茯茶的代謝產(chǎn)物特征,為促進(jìn)茯茶產(chǎn)品多元化以及深入開發(fā)蛹蟲草茯茶功能奠定物質(zhì)理論基礎(chǔ).