李 陽，魯 迨，周 州，陳麗葉，謝新輝，吳家浩，趙 倩,，石星波

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410007）

黃曲霉毒素是主要由黃曲霉和寄生霉產(chǎn)生的有毒次生代謝物，結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素環(huán)組成的二呋喃酮萘酮的衍生物[1]。黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）毒性最大、致癌性最強(qiáng)，已被世界衛(wèi)生組織列為I類致癌物[2-3]。為了保障食品安全，開發(fā)準(zhǔn)確檢測(cè)食品中AFB1含量的方法尤其重要，常用的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[4]、高效液相色譜（high performance liquid chromatograpy，HPLC）法[5]、免疫化學(xué)檢測(cè)法[6]等。色譜法靈敏度高、穩(wěn)定性好，但儀器設(shè)備昂貴和需要專業(yè)技術(shù)人員。免疫化學(xué)檢測(cè)法中酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）應(yīng)用最為廣泛，但ELISA依賴昂貴的抗體[7]和酶，而天然酶具有制備成本高、耐酸堿性低、穩(wěn)定性差、儲(chǔ)存不便的缺陷[8]，同時(shí)單一信號(hào)輸出容易出現(xiàn)假陽性。因此，構(gòu)建新型ELISA傳感策略以實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的高靈敏便攜檢測(cè)至關(guān)重要。

納米材料的引入為開發(fā)新型的ELISA帶來了機(jī)遇，如可作為載體負(fù)載識(shí)別分子或者酶用于信號(hào)放大、作為納米酶偶聯(lián)抗體用于信號(hào)調(diào)節(jié)以及作為底物用于信號(hào)輸出[9]。石墨烯量子點(diǎn)（graphene quantum dots，GQDs）是一種零維碳納米材料，制備簡單且具有很強(qiáng)的熒光特性[10-11]，可以作為底物實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)輸出，同時(shí)提高ELISA檢測(cè)的靈敏度。二氧化錳納米顆粒（MnO2nanoparticles，MnO2NPs）比表面積大、具有較寬的光吸收性能[12]，可以作為能量受體有效地猝滅熒光物質(zhì)的熒光，此外其還具有優(yōu)異的模擬酶性能[13]，可以催化酶底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）顯色[14]，實(shí)現(xiàn)比色信號(hào)輸出。若將兩種材料組合，則可實(shí)現(xiàn)比色/熒光信號(hào)同時(shí)輸出，為構(gòu)建雙模信號(hào)ELISA提供選擇[15]。

核酸適配體（aptamer，Apt）作為一種新型識(shí)別元件，親和力和特異性高、免疫原性低，已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)中[16-17]。真菌毒素等小分子分子質(zhì)量小、抗原表位單一，不能同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗體，一般使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)[18]，特異性不夠好。將抗體與Apt組合對(duì)目標(biāo)物的識(shí)別表現(xiàn)出了較好的特異性，可以實(shí)現(xiàn)小分子“三明治”夾心ELISA檢測(cè)[19]。

本實(shí)驗(yàn)基于GQDs與MnO2NPs構(gòu)建了一種比色/熒光雙信號(hào)輸出平臺(tái)用于AFB1的高靈敏便攜式檢測(cè)。使用SiO2納米顆粒（SiO2nanoparticles，SiO2NPs）為載體，將谷胱甘肽（glutathione，GSH）和AFB1-Apt富集在SiO2NPs上制備SiO2NPs@GSH@Apt識(shí)別探針。使用MnO2NPs偶聯(lián)GQDs的復(fù)合納米材料MnO2NPs@GQDs為底物，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），MnO2NPs有效猝滅GQDs的熒光，同時(shí)MnO2NPs@GQDs能有效地催化TMB氧化為藍(lán)色氧化態(tài)TMB。SiO2NPs@GSH@Apt識(shí)別探針與AFB1抗體共同識(shí)別目標(biāo)物AFB1，形成夾心型結(jié)構(gòu)。GSH具有很強(qiáng)的還原性，能將MnO2NPs還原成Mn2＋[20]，MnO2NPs@GQDs的類過氧化物酶能力減弱，而GQDs被猝滅的熒光不斷恢復(fù)，通過底物熒光強(qiáng)度以及TMB顏色的變化對(duì)實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的可視化及熒光檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸、氫氧化鈉、30% H2O2、硫酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；高錳酸鉀 衡陽市凱信化工試劑有限公司；聚丙烯胺鹽酸鹽（poly(allylamine hydrochloride)，PA H）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydro，EDC）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）北京索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）上海源葉生物科技有限公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品 山東美正生物科技有限公司；二氧化硅納米顆粒 天津均益佳科技有限責(zé)任公司；谷胱甘肽 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；TMB 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；AFB1-Apt序列（5′-3′）GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CC[21]生工生物工程（上海）股份有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SPARK 20M多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司；Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀 馬爾文帕納科公司；Heraeus Pico 17離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技公司；TCS-10金屬恒溫振蕩器 杭州瑞誠儀器有限公司；JEM-2100F透射電子顯微鏡 日本電子光學(xué)公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 GQDs的制備

參考文獻(xiàn)[22]采用直接熱解法。稱取2 g檸檬酸，200 ℃反應(yīng)30 min，得到橙色液體時(shí)標(biāo)志GQDs形成。將GQDs逐滴加入到100 mL（0.25 mol/L）的NaOH溶液中，隨后調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0得到GQDs溶液。將其放入干燥箱中60℃烘干至質(zhì)量恒定后稱量，得到所制備的GQDs質(zhì)量濃度為19.8 mg/mL。

1.3.2 MnO2NPs的制備

參考文獻(xiàn)[23]的方法用PAH將高錳酸鉀還原成MnO2NPs。稱取35 mg高錳酸鉀溶于40 mL去離子水中，加入5 mL 40 mg/mL的PAH溶液，在超聲的輔助下反應(yīng)15 min，隨后透析48 h（3 000 Da）得到純化的MnO2NPs。將其放入干燥箱中60 ℃烘干至質(zhì)量恒定后稱量，得到所制備的GQDs質(zhì)量濃度為3.7 mg/mL。

1.3.3 MnO2NPs@GQDs復(fù)合底物的合成及性質(zhì)

取5 mL 198 μg/mL的GQDs溶液與5 mL質(zhì)量濃度為7.4、18.5、37、74、185、370 μg/mL的MnO2NPs室溫反應(yīng)得到不同質(zhì)量濃度的MnO2NPs@GQDs復(fù)合材料，將未加入與加入MnO2NPs的GQDs的熒光強(qiáng)度分別記為F0、F1，以F0與F1差值ΔF1為參考確定底物合成最佳的MnO2NPs質(zhì)量濃度。接下來探究底物合成所需的時(shí)間，在GQDs溶液加入MnO2NPs后，每隔10 min測(cè)量其熒光強(qiáng)度，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

考察MnO2NPs、GQDs、底物以及底物在引入GSH后的類過氧化物酶特性和熒光特性的變化，分別配制4 種溶液：1）MnO2NPs溶液：250 μL MnO2NPs＋750 μL H2O；2）GQDs溶液：250 μL GQDs＋750 μL H2O；3）MnO2NPs@GQDs 溶液：500 μL MnO2NPs@GQDs＋500 μL H2O；4）MnO2NPs@GQDs＋GSH溶液：500 μL MnO2NPs@GQDs＋500 μL GSH。將4 種溶液置于45 ℃反應(yīng)40 min，待反應(yīng)完成后各取200 μL液體測(cè)定熒光光譜，同時(shí)各取50 μL液體加入50 μL TMB和50 μL H2O2，室溫反應(yīng)45 min，加入50 μL 1 mol/L的H2SO4溶液終止反應(yīng)，測(cè)定紫外-可見吸收光譜并記錄在450 nm波長處的吸光度A450nm。

1.3.4 SiO2NPs@GSH@Apt探針的制備及優(yōu)化

對(duì)探針上的GSH濃度進(jìn)行優(yōu)化，將1 mL表面氨基化的SiO2NPs溶液（0.1 mg/mL）與1 mL不同濃度（0、0.5、2.5、5、7.5、10、12.5、15 mmol/L）的GSH溶液室溫反應(yīng)1 h，隨后將1 mL 100 nmol/L用4 mmol的EDC和1 mmol的NHS活化后的Apt加入其中室溫反應(yīng)1 h。接著8 000 r/min離心3 min，重復(fù)3 次得到純化的探針。400 μL不同GSH濃度的探針與400 μL底物45 ℃反應(yīng)40 min，測(cè)定同1.3.3節(jié)。將有、無GSH的探針加入到底物后的熒光值分別記為F2、F3，以F2與F3熒光差值ΔF2和A450為參考得到最佳GSH濃度。對(duì)SiO2NPs表面富集GSH的溫度與時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，考察SiO2NPs在不同溫度下（15、25、35、45、55、65 ℃）以及不同反應(yīng)時(shí)間下（10、20、30、40、50、60、70、80 min）對(duì)GSH富集情況，以ΔF2和A450nm為參考得到最優(yōu)反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間。

1.3.5 基于SiO2NPs@GSH@Apt探針和MnO2NPs@GQDs底物對(duì)AFB1的檢測(cè)

基于探針和底物構(gòu)建了基于夾心法ELISA用于AFB1的檢測(cè)，具體操作步驟如下：1）AFB1抗體包被：將100 μL 0.01 mg/mL AFB1抗體加入96微孔板中，4 ℃孵育12 h。2）封閉：取出微孔板，棄去液體，PBS洗滌3 次后加入100 μL 0.01 mg/mL BSA，37 ℃孵育1 h。3）連接抗原：取出微孔板，棄去液體，PBS洗滌3 次后加入100 μL不同質(zhì)量濃度AFB1，37 ℃孵育1 h。4）棄去液體，PBS洗滌3 次后加入100 μL探針，25 ℃反應(yīng)1 h。5）棄去液體，PBS洗滌3 次后加入100 μL底物，45 ℃反應(yīng)40 min。測(cè)定同1.3.3節(jié)。

1.3.6 可行性分析

將100 μL同濃度的SiO2NPs、SiO2NPs@GSH、SiO2NPs@Apt、SiO2NPs@GSH@Apt分別加入到鋪好AFB1抗原的微孔板中，25 ℃反應(yīng)1 h，棄去液體，PBS洗滌3 次后加入100 μL底物，45 ℃反應(yīng)40 min。測(cè)定同1.3.3節(jié)。

1.3.7 反應(yīng)條件優(yōu)化

將200 μL探針加入到200 μL底物中，考察其在不同溫度下（15、25、35、45、55、65 ℃）以及不同反應(yīng)時(shí)間下（10、20、30、40、50、60 min）的熒光強(qiáng)度和類過氧化物酶特性變化，確定最優(yōu)反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間。

1.3.8 特異性分析

為驗(yàn)證本方法檢測(cè)AFB1的特異性，選擇黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）、赭曲霉毒素（ochratoxin A，OTA）、T-2毒素（trichothecenes，T-2）、棒曲霉毒素（Patulin）、伏馬毒素（fumonisin B1，F(xiàn)B1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）以及混合毒素進(jìn)行特異性驗(yàn)證，其中單一毒素質(zhì)量濃度為10-8g/mL，混合毒素中的干擾毒素質(zhì)量濃度為10-8g/mL、AFB1質(zhì)量濃度為10-9g/mL。操作同1.3.5節(jié)，將AFB1分別用上述毒素代替。

1.3.9 實(shí)際樣品中AFB1的檢測(cè)

使用商業(yè)化的ELISA試劑盒和HPLC檢測(cè)牛奶、大米、麥片、醬油、白醋5 種實(shí)際樣品中的AFB1含量，驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性。檢測(cè)前需對(duì)所選的樣品進(jìn)行預(yù)處理，步驟如下：1）牛奶：取1 mL樣品加入3 mL去離子水混合均勻。2）大米、麥片、醬油：將樣品粉碎后取5 g樣本加入60%甲醇溶液25 mL，振蕩10 min；取液體于4 000 r/min離心5 min；取上清液1 mL加入4 mL去離子水混合均勻。3）白醋：取1 mL樣品加入60%甲醇溶液5 mL，振蕩均勻；取液體1 mL加入4 mL去離子水混合均勻。操作同1.3.5 節(jié)，將AFB1分別用上述預(yù)處理過的實(shí)際樣品代替。

選擇牛奶樣品作為加標(biāo)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收的檢測(cè)。分別取1 mL待測(cè)液加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使AFB1的終質(zhì)量濃度分別為1×10-9、1×10-10、1×10-11g/mL，計(jì)算得到加標(biāo)回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，從酶標(biāo)儀和熒光分光光度計(jì)中導(dǎo)出數(shù)據(jù)，利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)原理

檢測(cè)原理如圖1所示，使用SiO2NPs作為載體富集GSH和AFB1-Apt構(gòu)建SiO2NPs@GSH@Apt識(shí)別探針，MnO2NPs偶聯(lián)GQDs的復(fù)合納米材料MnO2NPs@GQDs為底物。在聚苯乙烯微孔板上包被AFB1抗體，當(dāng)有目標(biāo)物AFB1存在時(shí)，探針上的AFB1-Apt和抗體共同識(shí)別并捕獲AFB1，形成夾心結(jié)構(gòu)，以GSH控制底物熒光及比色信號(hào)的輸出。底物具有MnO2NPs類過氧化物酶的特性，能夠有效地催化酶底物TMB顯色，且MnO2NPs具有較寬的光吸收性能，能有效猝滅GQDs的熒光。但由于探針上的GSH具有很強(qiáng)的還原性，能將MnO2NPs還原成Mn2＋，此時(shí)底物的類過氧化物酶特性消失，不能催化TMB氧化變色，但底物中GQDs被猝滅的熒光恢復(fù)。當(dāng)目標(biāo)物AFB1濃度越高，溶液的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，比色信號(hào)逐漸減弱，通過底物熒光強(qiáng)度以及TMB顏色的變化對(duì)AFB1進(jìn)行定量及可視化檢測(cè)。

圖1 比色/熒光雙模信號(hào)檢測(cè)AFB1原理圖Fig.1 Schematic illustration of the dual-mode signal for colorimetric and fluorescence detection of AFB1

2.2 GQDs、MnO2NPs和MnO2NPs@GQDs制備及表征

如圖2A所示，GQDs的最大激發(fā)波長為370 nm，最大發(fā)射波長為465 nm，在紫外燈照射下發(fā)出了很強(qiáng)的藍(lán)色熒光。對(duì)MnO2NPs紫外-可見吸收光譜進(jìn)行測(cè)定，其在250～600 nm波長處有比較寬的吸收范圍。由圖2B可以看到，MnO2NPs為球狀，且分散性較好。隨機(jī)選取100 個(gè)MnO2NPs進(jìn)行粒徑分析，結(jié)果表明該尺寸分布在1.2～3.4 nm之間，平均粒徑為2.2 nm。由圖2C可以看出，GQDs也為球狀結(jié)構(gòu)。GQDs粒徑分布在2.7～6.7 nm之間，平均粒徑為3.75 nm。

圖2 GQDs、MnO2NPs和MnO2NPs@GQDs的表征Fig.2 Characterization of GQDs,MnO2NPs and MnO2NPs@GQDs

為考察MnO2NPs@GQDs復(fù)合納米材料是否成功合成，通過紅外光譜圖分析MnO2NPs、GQDs及MnO2NPs@GQDs表面功能基團(tuán)，如圖2D所示，1 600 cm-1是C＝O的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，3 500 cm-1為O—H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)[22]，GQDs表現(xiàn)出了對(duì)羧基和羥基的吸收，表明其含有—COOH基團(tuán)；MnO2NPs表現(xiàn)出了對(duì)羰基和羥基的吸收，且Mn—O的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致MnO2NPs在527 cm-1處出現(xiàn)小的特征峰；復(fù)合納米材料在527 cm-1處也有小的特征峰[24]，對(duì)羰基和羥基也表現(xiàn)出吸收，說明MnO2NPs與GQDs偶聯(lián)形成了MnO2NPs@GQDs復(fù)合納米材料。通過X射線衍射儀對(duì)MnO2NPs@GQDs進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析，如圖2E所示，2θ為28.7°、37.3°、56.7°時(shí)出現(xiàn)的特征峰與β-MnO2的110、101、211晶面匹配[25]，2θ＝24°附近出現(xiàn)的寬峰對(duì)應(yīng)于石墨的002平面，來源于GQDs的石墨結(jié)構(gòu)[26]。從3 種材料的電位表征圖（圖2F）可見，GQDs帶負(fù)電，MnO2NPs帶正電，由于靜電吸附作用MnO2NPs與GQDs結(jié)合得到MnO2NPs@GQDs復(fù)合納米材料，MnO2NPs@GQDs帶正電，提示MnO2NPs@GQDs的成功合成。

對(duì)底物的類過氧化物酶特性和熒光特性進(jìn)行探究。由圖3A所示，MnO2NPs具有類過氧化物酶特性，能將TMB氧化成藍(lán)色產(chǎn)物，在硫酸終止下變成黃色；而GQDs沒有類酶活性，在GQDs中加入TMB與H2O2以及終止液后溶液呈無色狀態(tài)；MnO2NPs@GQDs底物在加入TMB與H2O2以及終止液后溶液呈黃色，說明底物也具有類過氧化物酶特性；在加入GSH后，GSH將MnO2NPs還原成Mn2＋，底物的類酶活性消失，插圖為MnO2NPs、GQDs、MnO2NPs@GQDs、MnO2NPs@GQDs＋GSH四種溶液加入TMB與H2O2以及終止液后的顏色圖片。如圖3B所示，MnO2NPs不發(fā)熒光；而GQDs具有很強(qiáng)的熒光特性，在465 nm處具有很高的熒光發(fā)射峰；MnO2NPs與GQDs復(fù)合形成MnO2NPs@GQDs底物后，基于FRET，GQDs的熒光被MnO2NPs猝滅導(dǎo)致底物熒光強(qiáng)度很低；加入GSH后，MnO2NPs還原成Mn2＋，MnO2NPs對(duì)GQDs熒光的猝滅效果減弱，底物熒光逐漸恢復(fù)。插圖為MnO2NPs、GQDs、MnO2NPs@GQDs、MnO2NPs@GQDs＋GSH四種溶液在360 nm紫外燈下的圖片，可以清楚看到4 種溶液的熒光強(qiáng)度變化。

圖3 GSH加入前后MnO2NPs@GQDs的類過氧化物酶特性（A）及熒光特性（B）Fig.3 Peroxide-like properties (A) and fluorescence intensity (B) of MnO2NPs@GQDs before and after adding GSH

2.3 MnO2NPs@GQDs底物條件優(yōu)化

如圖4A所示，隨著MnO2NPs質(zhì)量濃度不斷的增大，GQDs的熒光不斷被猝滅，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到74 μg/mL時(shí)ΔF1最大，所以以此為最佳質(zhì)量濃度。對(duì)MnO2NPs與GQDs的孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，從圖4B可以看出，ΔF1隨著時(shí)間的延長而增加，在90 min后趨于穩(wěn)定，因此選擇最佳孵育時(shí)間為90 min。

圖4 底物制備時(shí)MnO2NPs質(zhì)量濃度（A）和反應(yīng)時(shí)間（B）條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of concentration of MnO2NPs (A) and reaction time (B) for substrate preparation

2.4 SiO2NPs@GSH@Apt探針制備及條件優(yōu)化

SiO2NPs@GSH@Apt探針是通過氨基修飾的SiO2NPs首先與GSH羧氨結(jié)合、接著與羧基化的Apt靜電吸附偶聯(lián)而成。對(duì)探針進(jìn)行Zeta電位表征，如圖5A所示，氨基修飾的SiO2NPs帶正電，加入GSH后由于縮合反應(yīng)SiO2NPs@GSH正電位值增加，但加入羧基化Apt后，SiO2NPs@GSH@Apt正電位值減少，說明GSH、Apt已成功富集在SiO2NPs表面，證實(shí)了SiO2NPs@GSH@Apt探針的成功合成。

圖5 SiO2NPs@GSH@Apt的表征及制備條件優(yōu)化Fig.5 Characterization of SiO2NPs@GSH@Apt and optimization of its preparation conditions

對(duì)探針制備過程中GSH濃度及SiO2NPs富集GSH溫度與時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。如圖5B所示，隨著探針上的GSH濃度不斷增大，底物的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，對(duì)TMB的氧化效果逐漸減弱。當(dāng)GSH終濃度為5 mmol/L時(shí)，底物的熒光強(qiáng)度恢復(fù)接近穩(wěn)定，但底物與TMB反應(yīng)得到的TMB氧化產(chǎn)物吸光度很低，為了實(shí)現(xiàn)比色及熒光的雙模信號(hào)同時(shí)輸出，選擇終濃度為2.5 mmol/L的GSH進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖5C所示，在35 ℃條件下底物的熒光強(qiáng)度恢復(fù)最多且對(duì)TMB的氧化效果最弱，說明此溫度下SiO2NPs表面富集的GSH最多，所以選擇35 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。如圖5D所示，反應(yīng)時(shí)間到60 min時(shí)底物的熒光強(qiáng)度恢復(fù)接近穩(wěn)定且對(duì)TMB的氧化效果也趨于穩(wěn)定，說明此時(shí)SiO2NPs表面的GSH富集達(dá)到飽和，因此SiO2NPs富集GSH的時(shí)間選擇為60 min。

2.5 可行性驗(yàn)證及反應(yīng)條件優(yōu)化

將SiO2NPs、SiO2NPs@GSH、SiO2NPs@Apt、SiO2NPs@GSH@Apt分別加入到底物中，對(duì)底物的比色/熒光信號(hào)輸出進(jìn)行探究。從圖6A、B可以看到，SiO2NPs兩種信號(hào)與空白響應(yīng)值相差不大，沒有識(shí)別目標(biāo)物和與底物反應(yīng)的功能；SiO2NPs@GSH對(duì)兩種信號(hào)都有輕微的響應(yīng)，但其缺少對(duì)目標(biāo)物的識(shí)別功能；SiO2NPs@Apt具備識(shí)別功能，但其沒有信號(hào)響應(yīng)；SiO2NPs@GSH@Apt具備識(shí)別功能且比色與熒光信號(hào)明顯響應(yīng)，這說明基于SiO2NPs@GSH@Apt探針與MnO2NPs@GQDs底物構(gòu)建檢測(cè)AFB1的方法可行。

圖6 AFB1檢測(cè)可行性研究及反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.6 Feasibility of AFB1 detection and optimization of reaction conditions

對(duì)探針與底物的反應(yīng)時(shí)間與溫度進(jìn)行優(yōu)化。如圖6C所示，隨著反應(yīng)時(shí)間延長，探針上的GSH與底物不斷反應(yīng)使MnO2NPs還原成Mn2＋，到40 min底物的熒光及類過氧化物酶活性趨于穩(wěn)定，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中探針與底物反應(yīng)時(shí)間選擇為40 min。由圖6D可以看到，在45 ℃條件下底物的熒光和類過氧化物酶活性效果最好，所以選擇此溫度作為探針與底物最佳反應(yīng)溫度。

2.6 AFB1檢測(cè)靈敏度及特異性分析

在最優(yōu)條件下，向檢測(cè)體系中加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液（10-12～10-6g/mL），以底物熒光差值?F（?F=F4-F5，F(xiàn)4、F5分別為加入毒素和超純水后底物的熒光值）和TMB顯色的吸光度差值?A（?A=A1-A0，A1、A0分別為加入毒素和超純水后底物與TMB反應(yīng)后的A450nm）作為信號(hào)輸出，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖7A所示，隨著AFB1質(zhì)量濃度不斷增大，GQDs的熒光不斷恢復(fù)，恢復(fù)的熒光強(qiáng)度?F與AFB1質(zhì)量濃度在10-12～10-6g/mL范圍內(nèi)呈明顯正相關(guān)，得到熒光信號(hào)的線性方程為?F=928.733＋71.779lgC，R2=0.990 2，檢出限計(jì)算為1.667×10-12g/mL。檢出限的定義如下：3S0/S（3為置信水平為99%的因子，S0為空白測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3），S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）。由圖7C可以看到，隨著AFB1質(zhì)量濃度不斷增大，TMB氧化產(chǎn)物在450 nm波長處的吸光度逐漸減低，以AFB1質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，?A為縱坐標(biāo)，在10-12～10-6g/mL范圍內(nèi)得到了比色信號(hào)的線性方程為?A=-0.275-0.021lgC，R2=0.998 9，計(jì)算得到檢出限為2.732×10-12g/mL。此外，通過AFB1檢測(cè)方法與其他方法比較（表1）表明，本研究所得結(jié)果具有較寬的線性范圍和更低的檢出限，對(duì)AFB1具有良好的檢測(cè)性能，可實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的高靈敏便攜檢測(cè)。

表1 不同AFB1檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of different methods for the determination of AFB1

圖7 AFB1檢測(cè)靈敏度及特異性Fig.7 Sensitivity and specificity of AFB1 detection

探討該方法對(duì)檢測(cè)AFB1的特異性，選擇與AFB1結(jié)構(gòu)類似的毒素AFB2、AFM1、OTA、T-2毒素、Patulin、FB1、DON以及混合毒素進(jìn)行驗(yàn)證。如圖7B所示，只有AFB1和混合毒素才有明顯的熒光信號(hào)響應(yīng)，說明熒光信號(hào)有良好的特異性。如圖7D所示，TMB氧化產(chǎn)物的顏色在有AFB1存在時(shí)最淺，說明比色信號(hào)對(duì)AFB1也具有良好的特異性。

2.7 實(shí)際樣品中AFB1的檢測(cè)分析

使用本方法對(duì)牛奶、大米、麥片、醬油和白醋共5 種實(shí)際樣品中的AFB1進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中AFB1的含量，同時(shí)與商業(yè)化的ELISA試劑盒和HPLC進(jìn)行方法對(duì)比，結(jié)果如表2所示。商業(yè)化的ELISA試劑盒檢出了大米與醬油兩種樣品，含量分別為0.111、3.41×10-2μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為2.7%、1.5%。HPLC只檢出了大米一個(gè)樣品，含量為0.100 μg/kg。本方法中比色信號(hào)檢出了大米與醬油兩種樣品，而熒光信號(hào)檢出了大米醬油和麥片3 種樣品，比色信號(hào)檢出大米、醬油中的AFB1含量分別為0.114、3.44×10-2μg/kg，RSD分別為2.2%、0.8%；熒光信號(hào)檢出大米、醬油與麥片中的AFB1含量分別為0.108、3.26×10-2、1.94×10-3μg/kg，RSD分別為2.4%、1.2%、0.9%。兩種信號(hào)的檢測(cè)結(jié)果與ELISA試劑盒和HPLC所測(cè)得的結(jié)果保持在同一水平，且RSD均小于3%，說明檢測(cè)結(jié)果具有一定的準(zhǔn)確性。此外，兩種信號(hào)能測(cè)出ELISA試劑盒和HPLC未能檢出的樣品，說明本方法能有效地檢測(cè)出實(shí)際樣品中的AFB1含量并且比傳統(tǒng)方法的靈敏度更高。兩種信號(hào)得到的結(jié)果可以看到本方法中熒光信號(hào)的靈敏度更高。

表2 不同方法檢測(cè)實(shí)際樣品中AFB1的含量Table 2 Comparison of results of AFB1 detection in real food samples by different methods

為進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的實(shí)際應(yīng)用性能，在牛奶中添加不同含量的AFB1標(biāo)準(zhǔn)液制備不同質(zhì)量濃度的AFB1牛奶加標(biāo)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。如表3所示，比色信號(hào)與熒光信號(hào)均有效檢出，并與加標(biāo)含量幾乎持平。其中比色信號(hào)的加標(biāo)回收率為96.03%～112.27%，熒光信號(hào)回收率為91.50%～117.20%，兩種信號(hào)的RSD均小于3%，說明本方法具有很好的準(zhǔn)確性和特異性，可用于牛奶等相關(guān)實(shí)際樣品中AFB1的檢測(cè)。

表3 牛奶樣品中AFB1加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of AFB1 in spiked milk samples

3 討論

將GSH和AFB1-Apt富集在SiO2NPs表面制備了SiO2NPs@GSH@Apt識(shí)別探針，MnO2NPs與GQDs偶聯(lián)復(fù)合成MnO2NPs@GQDs信號(hào)讀出底物，Apt和抗體組合識(shí)別目標(biāo)物AFB1。在聚苯乙烯微孔板上，基于探針上GSH與底物的反應(yīng)設(shè)計(jì)了一種具有比色/熒光雙信號(hào)的AFB1檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了AFB1的可視化比色及熒光信號(hào)高靈敏檢測(cè)。兩種信號(hào)得到的結(jié)果互相佐證，避免了單信號(hào)輸出時(shí)容易出現(xiàn)假陽性的后果。Apt與抗體共同識(shí)別捕獲目標(biāo)物，避免其他毒素干擾，具有良好的特異性，且相較2 個(gè)抗體組合使用的成本更低。與商業(yè)化ELISA試劑盒和HPLC相比，本方法具有更高的靈敏度，可用于痕量檢測(cè)AFB1，為食品安全快速、靈敏檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。