高俊杰，李志星，姚彬彬，趙先炎，胡文效*，邱磊*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院） 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，山東 濟(jì)南 250014）

朗姆酒與中國白酒、白蘭地、威士忌、伏特加和金酒齊名，是“世界六大蒸餾酒”之一[1-4]。朗姆酒最早起源于加勒比海地區(qū)的西印度群島，即現(xiàn)在的古巴地區(qū)[5]，后傳入歐洲，迄今已有200 年左右的生產(chǎn)歷史[6]。朗姆酒是以甘蔗汁或甘蔗附屬物如糖蜜等為原料，經(jīng)酒精發(fā)酵、蒸餾、橡木桶陳釀等一系列工序后釀制而成，它因口感甜爽、芳香馥郁、果味突出，現(xiàn)已成為廣大消費(fèi)者喜愛的一種世界名酒[7]，在世界暢銷的酒精飲料中銷量僅次于白蘭地和威士忌，排名第三[8]。我國朗姆酒市場十分廣闊，近年來對(duì)朗姆酒的進(jìn)口量逐年增加，躍居我國進(jìn)口酒精飲品量之首[9]。

朗姆酒的香氣主要取決于原料、發(fā)酵和陳釀這3 個(gè)方面[10]。由于原料類型、發(fā)酵條件和所用菌種以及陳釀時(shí)間的不同，朗姆酒中酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、酚類等主要呈香物質(zhì)的種類、含量及比例存在差異，進(jìn)而造就了不同朗姆酒的香氣特點(diǎn)，同時(shí)也決定了朗姆酒品質(zhì)的高低。然而目前國際上對(duì)朗姆酒關(guān)鍵香氣化合物的組成仍沒有清晰定論，對(duì)朗姆酒的檢測標(biāo)準(zhǔn)也僅局限于原料和主要成分規(guī)定上，對(duì)香氣成分的檢測標(biāo)準(zhǔn)也未做出明確規(guī)定，因此，根據(jù)其他酒類（如白蘭地、白酒）香氣成分的檢測方法對(duì)朗姆酒中的香氣組分進(jìn)行定性和定量分析具有十分重要的研究價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義[7]。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)屬于質(zhì)譜分析學(xué)的一部分，因其可準(zhǔn)確對(duì)產(chǎn)品中各種化合物進(jìn)行定性和定量分析被廣泛應(yīng)用于食品指標(biāo)檢測、生物醫(yī)藥及化工涂料研發(fā)等領(lǐng)域[11]。酒類中酒精和水占絕大部分比重，香氣成分所占比重甚微，而恰恰是這些微量的香味物質(zhì)對(duì)酒體的風(fēng)格和口感起著至關(guān)重要的作用[12-13]。為了便于利用GC-MS 對(duì)各種香氣成分進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量，需要對(duì)酒樣進(jìn)行必要的前處理，從而將這些微量香味物質(zhì)分離出來。常見的前處理方法包括液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）法[14-15]和頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）法[16-17]。為盡可能地將酒類中的不同揮發(fā)性和極性的香氣物質(zhì)提取完全，本研究以二氯甲烷為萃取劑，利用液液萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)哈瓦那俱樂部3 年、哈瓦那俱樂部7 年和哈瓦那俱樂部樽融3 種不同陳釀時(shí)間朗姆酒中的香氣成分進(jìn)行定性和定量分析[18]，探究3 種朗姆酒的香氣組成，以期為我國高質(zhì)量朗姆酒評(píng)價(jià)系統(tǒng)的建立和完善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 款朗姆酒[哈瓦那俱樂部3 年、哈瓦那俱樂部7年和哈瓦那俱樂部樽融（陳釀時(shí)間在25 年以上）]：保樂力加（中國）酒業(yè)有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品：上海麥克林生化科技有限公司；二氯甲烷（色譜純）：美國天地試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XS104 型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；液液萃取裝置（500 mL 梨形分液漏斗及漏斗架）：山東力戈生物科技有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道夫公司；DC-12 氮吹儀：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；7890B/7000D 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5 非極性毛細(xì)管柱色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 朗姆酒酒樣的前處理

取25 mL 朗姆酒于錐形瓶中，加入75 mL 去離子水將其稀釋至酒精度為10% vol 左右[19]，加入2 g 氯化鈉。將處理完的朗姆酒酒樣轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，并用二氯甲烷先后萃取3 次（60、40、20 mL），靜置后將下層有機(jī)相倒入錐形瓶中合并，加入干燥后的無水硫酸鈉15 g，靜置過夜。最后將有機(jī)相常壓45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氮吹濃縮至1 mL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 進(jìn)樣瓶中，加入20 μL 質(zhì)量濃度為1 g/L 的2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)），密封好并置于4 ℃冰箱中保存，進(jìn)樣時(shí)采用直接進(jìn)樣方式進(jìn)樣1 μL。

1.3.2 GC-MS 分析條件

GC 條件：DB-5 非極性毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm×0.25 μm）；升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min，以4 ℃/min升溫至170 ℃保持5 min，以8 ℃/min 升溫至280 ℃保持10 min；載氣（He）（99.99%）流速1.0 mL/min，壓力53.5 kPa，采用分流比6：1 方式進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL。

MS 條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；檢測器電壓830 eV；傳輸管線溫度280 ℃；進(jìn)樣口和接口溫度為250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；全掃描模式（Scan）；質(zhì)量掃描范圍35～350 amu；掃描速度：769 amu/s；溶劑延遲4 min。

1.3.3 定性和定量方法

定性方法：根據(jù)NIST14 譜庫對(duì)GC-MS 掃描分析得到的各香氣化合物組分進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索，利用匹配度＞80%特征離子和保留時(shí)間進(jìn)行定性分析。

定量方法[20]：采用半定量方法對(duì)各組分進(jìn)行定量分析，按下列公式計(jì)算。

Xi=Ai/As×Cs

式中：Xi為待測物的質(zhì)量濃度，g/L；Cs為內(nèi)標(biāo)物（2-辛醇）質(zhì)量濃度，g/L；Ai為待測物的峰面積；As表示內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.3.4 香氣活力值的計(jì)算方法

香氣活力值（odor activity value，OAV）可從閾值和濃度兩個(gè)維度上評(píng)價(jià)某香氣化合物對(duì)整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)度，進(jìn)而表征酒中的關(guān)鍵香氣化合物。各化合物的OAV（W）可按下列公式計(jì)算[21]。

W=ρ/T

式中：W 為各化合物的OAV；ρ 為香氣化合物在酒中的質(zhì)量濃度，g/L；T 為香氣化合物的香氣閾值（以10%乙醇水溶液計(jì)），μg/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及繪圖均在Excel 2007 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種朗姆酒的香氣成分測定結(jié)果

采用LLE-GC-MS 法對(duì)3 種哈瓦那俱樂部朗姆酒中的香氣成分進(jìn)行測定，其GC-MS 分析的總離子流色譜圖見圖1，3 種朗姆酒中香氣成分的測定結(jié)果見表1。

表1 3 種朗姆酒中香氣成分的GC-MS 測定結(jié)果Table 1 Determination of aroma components in three types of rum by GC-MS

圖1 3 種朗姆酒中香氣成分GC-MS 分析的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatograms of aroma components in three types of rum by GC-MS

由圖1 和表1 可知，3 種朗姆酒中香氣化合物的分離效果較好且種類和含量存在明顯差異，從中共檢測出139 種香氣成分，包括47 種酯類、23 種醇類、15 種酸類、13 種醛類、16 種酮類、8 種酚類、17 種其他類，這與楊華峰等[22]對(duì)銀朗姆酒不同蒸餾階段香氣物質(zhì)的研究結(jié)果極為相似。檢出的香氣成分大多為中鏈香氣化合物，占檢出香氣成分總數(shù)的82.01%。此外，檢出的酯類中包括3 種內(nèi)酯類，內(nèi)酯類是朗姆酒陳釀過程中長時(shí)間與橡木桶作用產(chǎn)生的，其含量會(huì)隨著陳釀時(shí)間的延長而有所增加，這里將內(nèi)酯類單獨(dú)作為一類香氣成分進(jìn)行討論。

哈瓦那俱樂部3 年中共測得58 種香氣化合物，包括酯類20 種（50.71%）、內(nèi)酯類3 種（1.27%）、醇類9種（15.12%）、醛類6 種（10.10%）、酸類7 種（15.13%）、酮類3 種（0.85%）、酚類3 種（1.02%）和其他類7 種（5.81%）；哈瓦那俱樂部7 年中共測得65 種香氣化合物，包括酯類24 種（31.54%）、內(nèi)酯類2 種（1.74%）、醇類14 種（34.38%）、醛類6 種（15.70%）、酸類5 種（8.94%）、酮類5 種（5.04%）、酚類2 種（0.43%）和其他類6 種（5.62%）；哈瓦那俱樂部樽融中共測得102 種香氣化合物，包括酯類33 種（30.23%）、內(nèi)酯類2 種（1.91%）、醇類14 種（17.57%）、醛類11 種（31.85%）、酸類11 種（9.65%）、酮類12 種（2.74%）、酚類6 種（0.43%）和其他類12 種（5.62%）。3 種朗姆酒中檢出的香氣成分總量隨著陳釀時(shí)間的延長而增大，哈瓦那俱樂部3 年、哈瓦那俱樂部7 年和哈瓦那俱樂部樽融中檢出的香氣成分總量分別為30.67、36.85 g/L 和73.81 g/L，哈瓦那俱樂部樽融中各類香氣化合物的含量均高于其他2 種朗姆酒，這與陳釀過程中氧化還原作用和酯化反應(yīng)產(chǎn)生的芳香物質(zhì)的積累有關(guān)[23]。另外，陳釀時(shí)間較長的朗姆酒香氣成分中內(nèi)酯類和醛類的含量及其占比較大，這些成分多來自橡木。

2.2 3 種朗姆酒中的共有香氣組分

為進(jìn)一步探究朗姆酒普遍的香氣特征，對(duì)3 種朗姆酒中的共有香氣成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表2。

表2 3 種朗姆酒中的共有香氣成分Table 2 Common aroma components in three types of rum

由表2 可知，3 種朗姆酒共檢測出25 種共有香氣成分，包括12 種酯類、1 種內(nèi)酯類、3 種醇類、1 種酸類、3 種醛類、1 種酮類、1 種酚類和3 種其他類。這些共有香氣成分的含量分別占3 種朗姆酒各自香氣成分檢出總量的76.67%、72.50%、56.33%，對(duì)朗姆酒總體香氣成分影響較大，它們相互作用形成了朗姆酒果香、花香、甜香、木香、熏香的基礎(chǔ)香氣特征。

2.3 3 種朗姆酒中香氣組分的OAV 分析

為進(jìn)一步確定3 種朗姆酒中的特征香氣組分，對(duì)3種朗姆酒中可查詢到閾值的香氣化合物進(jìn)行OAV 計(jì)算，發(fā)現(xiàn)部分香氣化合物的閾值較小，OAV 較大，因此，OAV 的計(jì)算結(jié)果取以10 為底數(shù)的對(duì)數(shù)后用OAV* 表示，OAV 值計(jì)算結(jié)果、相應(yīng)的香氣特征及分類情況見表3。OAV＞1 即OAV*＞0 時(shí)，說明該香氣化合物對(duì)相應(yīng)朗姆酒的香氣類型有貢獻(xiàn)且值越大，貢獻(xiàn)就越大。

表3 3 種朗姆酒中香氣成分的OAVTable 3 OAV of aroma components in three types of rum

由表3 可知，從3 種朗姆酒中檢出且能查到閾值的香氣化合物共有18 種，其中可被檢出的化合物的OAV* 均大于0，說明這些化合物對(duì)朗姆酒的香氣有貢獻(xiàn)?，F(xiàn)將OAV＞10 000 即OAV*＞4 的化合物定為第一梯度貢獻(xiàn)最大的香氣化合物，其組分包括大馬士酮、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯；第二梯度的貢獻(xiàn)較大的香氣化合物有香蘭素、2-苯乙醇、愈創(chuàng)木酚、水楊酸甲酯、α-松油醇，其中可被檢出的化合物的OAV*均介于3～4 之間；其他7 種香氣化合物的OAV* 均小于3，被劃分到貢獻(xiàn)較小的第三梯度，這與Pino 等[25]對(duì)陳年朗姆酒中氣味活性化合物的研究結(jié)果類似。結(jié)合表1 可知，3 種朗姆酒中酯類、醇類、醛類香氣化合物含量較高且占比較大，這在一定程度上說明了香氣化合物的含量大小決定了其對(duì)朗姆酒整體香氣的貢獻(xiàn)大小。此外，大馬士酮的含量與愈創(chuàng)木酚相近，而OAV 卻明顯大于愈創(chuàng)木酚。因此，僅依據(jù)某香氣化合物的含量來判斷其貢獻(xiàn)度大小是不準(zhǔn)確的，還應(yīng)考慮到該香氣化合物的閾值大小。

2.4 感官評(píng)定

為進(jìn)一步確定3 種朗姆酒中的風(fēng)味活性物質(zhì)，需將香氣化合物和感官特征聯(lián)系起來。3 種朗姆酒的感官評(píng)定結(jié)果見圖2。

圖2 3 種朗姆酒的香氣輪廓圖Fig.2 Aroma profiles of three types of rum

香氣化合物的香氣特征大致可歸類為10 種香氣類型：花香、果香、甜香、青香、奶香、熏香、木香、辛香、藥香和脂蠟香，這些香氣類型是人的感官對(duì)朗姆酒整體香氣特征的評(píng)定，是多種香氣成分之間相互作用（協(xié)同或掩蓋）形成的[26]。在這些香氣類型中，果香和花香是朗姆酒最突出的香氣特點(diǎn)，是朗姆酒香氣的主體部分，其次是甜香、青香和奶香，它們對(duì)朗姆酒的香氣也具有較大影響。此外，雖然脂蠟香、熏香、木香、辛香和藥香對(duì)朗姆酒的香氣影響較小，但是它們與其他幾種香氣類型相互協(xié)調(diào)共同構(gòu)成了朗姆酒的整體風(fēng)味，其中熏香、辛香和藥香隨著朗姆酒陳釀時(shí)間的延長有明顯增加的現(xiàn)象，這主要取決于陳釀過程中酚類和醛類物質(zhì)的積累，其中酚類物質(zhì)的存在也是朗姆酒抗氧化的主要原因。

3 討論與結(jié)論

本研究利用LLE-GC-MS 法對(duì)3 種朗姆酒（哈瓦那俱樂部3 年、哈瓦那俱樂部7 年和哈瓦那俱樂部樽融）的香氣成分進(jìn)行了分離和分析。3 種朗姆酒共檢測出139 種香氣成分，包括酯類、醇類、酸類、醛類、內(nèi)酯類、酮類、酚類、其他類8 類，其中酯類化合物的種類最多，有44 種。酯類是由朗姆酒發(fā)酵過程中的醇類和酸類發(fā)生酯化反應(yīng)生成的，是酵母細(xì)胞在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一類重要的揮發(fā)性香氣化合物，大多具有花果香氣，在朗姆酒中含量較高而閾值較低，因而對(duì)朗姆酒的香氣貢獻(xiàn)作用較大。

3 種朗姆酒中的香氣成分主要是酯類、醇類、醛類、酸類4 類，另外還有少量的酮類、內(nèi)酯類、酚類、烷烴類、吡喃類、含氮化合物等。哈瓦那俱樂部樽融中檢測到的香氣化合物數(shù)目最多且總量最高。此外，陳釀時(shí)間越長的朗姆酒中，內(nèi)酯類和醛類含量占比越大且含量也越高。內(nèi)酯類是由相應(yīng)的羥基酸形成的，其中主要是威士忌內(nèi)酯，它來源于橡木木材，主要使朗姆酒呈橡木香，是衡量陳釀朗姆酒品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。醛類主要由相應(yīng)的醇氧化而來，往往使朗姆酒呈現(xiàn)微弱的刺激性氣味，其中主要是丁香醛，它主要來源于橡木桶的烘烤過程，可使朗姆酒呈現(xiàn)一定的刺鼻氣味和辛辣味，對(duì)朗姆酒整體香氣的細(xì)微差別和陳釀后朗姆酒酒體顏色的穩(wěn)定有著重要的影響。

3 種朗姆酒中共檢測出25 種共有香氣成分，這些共有香氣成分含量較高，占各自香氣成分檢出總量的55%以上，其中辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-苯乙醇等香氣化合物的含量較高，被認(rèn)為是朗姆酒中的基本香氣成分。由香氣成分的OAV 分析結(jié)果可知，對(duì)3 種朗姆酒香氣貢獻(xiàn)最大的香氣化合物是大馬士酮，它是朗姆酒中玫瑰花香的主要來源。此外，對(duì)朗姆酒香氣貢獻(xiàn)較大的香氣化合物還有辛酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、香蘭素、2-苯乙醇、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、愈創(chuàng)木酚。通過感官評(píng)定可知，果香和花香是3 種朗姆酒的主要香氣特征，其次是甜香、青香和奶香。隨著朗姆酒陳釀時(shí)間的延長，其熏香、辛香和藥香會(huì)明顯增加，這可能與陳釀過程中橡木中木質(zhì)素的降解有關(guān)。

本研究分離并分析了3 種哈瓦那俱樂部朗姆酒中的香氣成分，比較了3 種朗姆酒中香氣組成的異同，探究了朗姆酒隨著陳釀時(shí)間延長香氣組分及香氣特征變化的規(guī)律，初步明確了朗姆酒中的某些關(guān)鍵香氣化合物，這為高品質(zhì)朗姆酒的品鑒及其生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供了一定的理論依據(jù)。但同時(shí)可能存在未查明對(duì)朗姆酒貢獻(xiàn)較大香氣化合物的閾值的情況，這可能造成對(duì)3 種朗姆酒關(guān)鍵香氣成分的判定及其風(fēng)味輪廓的描述存在一定的偏差，有必要進(jìn)一步對(duì)其他化合物的香氣閾值進(jìn)行測定。