王潤東，周 奎，鄧義佳，張宇昊，李學鵬，勵建榮,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一種廣泛存在于水產(chǎn)品中的致病菌，人們常因誤食被其污染的、生的或未燒熟煮透的海鮮導致食物中毒[1]。據(jù)估算，近5 年我國Vp食物中毒人數(shù)多達15.9萬，遠超沙門氏菌和大腸桿菌，Vp已成為威脅公共健康的首要病原菌[2]。腸道炎性損傷是Vp食物中毒的典型特征，該菌經(jīng)食物鏈傳播進入消化道，依靠菌體侵襲力和黏附性破壞宿主腸道上皮細胞，其代謝產(chǎn)生的毒力因子，如溶血毒素、脲酶和蛋白酶等，具有細胞毒性，能夠引起腸道多重不良反應[3-4]。目前臨床針對Vp食物中毒主要使用抗生素藥物治療，如喹諾酮和頭孢曲松等，但頻繁使用會出現(xiàn)耐藥菌和腸生態(tài)失衡等問題，對機體健康造成長期危害[5-6]。因此，探尋綠色手段干預食源性Vp感染已成為防治Vp食物中毒的重要需求和研究熱點。

膳食調理成為干預病原菌感染的新興策略，大量研究表明食品功能因子對病原菌感染具有一定的緩解作用[7-10]。魚油分離自海產(chǎn)魚類，富含ω-3系多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs），主要包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），具有調節(jié)免疫、抑制炎癥和抗感染等生理功能[11]。在哺乳動物肝臟和腸道內，魚油經(jīng)一系列酶分解產(chǎn)生3系前列腺素和5系白三烯物質，干預上皮細胞表面Toll樣受體4介導的信號傳導，抑制核因子κB活化，調控細胞因子，如白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF）-α分泌，優(yōu)化免疫T細胞的活化與分化過程，從而促進腸道健康[12]。然而，目前針對魚油緩解食源性致病菌感染的研究鮮有報道，僅有Liu Junsheng等[13]從沙門氏菌誘導的腸道菌群紊亂角度探究了魚油對其感染小鼠的保護效應。此外，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，Vp的致病過程與沙門氏菌存在差異，Vp侵襲小鼠后主要定植于結腸組織，引起腸組織基因表達改變，造成腸屏障功能異常和過度炎癥[14]。因此，魚油干預食源性致病菌感染的劑量和機制均有特異性，從魚油干預沙門氏菌感染模型中得到的結論無法應用于干預Vp感染，魚油對Vp感染的緩解作用和潛在機理尚不明確。

鑒于結腸組織是食源性Vp侵襲和魚油調控的共同靶器官，本研究推測魚油能夠緩解Vp誘導的小鼠腸炎性損傷，通過構建Vp感染小鼠模型，比較正常飼喂小鼠與魚油干預小鼠分別暴露Vp后的臨床感染癥狀，結腸病理變化、腸道屏障功能、炎癥水平和抗氧化活力等指標，評估魚油對Vp感染小鼠的保護作用，并從結腸基因表達模式角度深入挖掘魚油緩解結腸炎的作用機理，以期為基于魚油開發(fā)抗Vp感染的膳食補充劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

無特定病原菌（specific pathogen free，SPF）6 周齡C57BL/6J雄性小鼠28 只，體質量（18±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010；飼料購自納瑞增（錦州）生物科技公司；動物房內溫度（20±2）℃、相對濕度（44±5）%，12 h明暗交替循環(huán)，小鼠1 周適應期間，正常飲食和自由飲水。

副溶血弧菌（ATCC33847），攜帶耐熱直接溶血素基因和不耐熱溶血素基因，是典型致病株[15]，由渤海大學大宗水產(chǎn)品貯藏加工與安全控制團隊保存。

溶菌營養(yǎng)肉湯（lysogeny broth，LB） 北京陸橋生物技術有限公司；魚油（含47.8% EPA和43.5%DHA） 美國西格瑪公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2）、氯化鈉（NaCl）、4%多聚甲醛溶液 北京索萊寶科技有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、天狼星紅（Sirius red，SR）染色液試劑盒、抗氧化酶試劑盒、免疫熒光試劑盒、免疫組化試劑盒、細胞因子酶聯(lián)免疫試劑盒南京建成科技有限公司；TRIzol提取劑、cDNA逆轉錄試劑盒、預混型實明熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

BBS-SDC超級潔凈工作臺 山東博科儀器制造有限公司；SPX-25恒溫培養(yǎng)箱 上海丙林電子科技有限公司；HT1909高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；ABI stePone Plus PCR儀 德國艾本德公司；BKQ-B50II高壓蒸汽滅菌鍋 山東卓隆生物科技有限公司；Imark酶標儀、CFX96型熒光定量PCR儀美國伯樂公司；組織自動包埋機、石蠟包埋機、轉輪式切片機 湖北貝諾醫(yī)療科技有限公司；Eclipse E100光學顯微鏡 日本尼康公司；Axio Imager 2偏振光顯微鏡北京普瑞賽司儀器有限公司；ZXF-1500正置熒光顯微鏡上海正晞儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 副溶血弧菌菌懸液制備

從-80 ℃冰箱中取出Vp ATCC33847凍干粉，在LB瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)劃線后，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化18～20 h；挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min搖床孵育12 h；將復蘇的菌液以體積比1∶100轉接至新鮮的3% NaCl-LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，待生長至對數(shù)期（OD600nm＝0.8～1.0），取菌液轉入50 mL無菌離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液后加入等體積無菌生理鹽水重懸，再次離心，重復上述操作兩次去除培養(yǎng)基；最后，使用無菌生理鹽水重懸沉淀，采用平板計數(shù)法明確Vp ATCC33847初始菌量，根據(jù)Vp食物中毒劑量[14]，采用10 倍稀釋法調整菌液濃度至106CFU/mL。Vp為嗜中溫微生物，冷藏條件下極易喪失活力，侵襲小鼠的菌懸液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 小鼠實驗設計

暫養(yǎng)結束后，將28 只C57BL/6J小鼠隨機分為4 組（n＝7）：對照組、模型組、魚油低劑量干預組和魚油高劑量干預組。低劑量和高劑量干預組小鼠每日分別灌胃0.1 mL含有2.0 mg和4.0 mg魚油的油-水混合乳化液[13]，連續(xù)干預14 d，期間對照組和模型組小鼠正常飼喂；實驗第15天，模型組和2 個魚油干預組小鼠均灌胃0.1 mL含Vp ATCC33847菌懸液（按照1.3.1節(jié)步驟配備），對照組灌胃等體積生理鹽水，暴露感染7 d，期間僅第1天攻毒Vp，剩余6 d無需重復灌胃。實驗第21天，采用二氧化碳麻醉小鼠后，頸椎脫臼法迅速處死小鼠，各組小鼠解剖收集距離盲腸1 cm明顯病變的結腸組織，保證取樣一致性。一部分使用RNase-free水快速清洗腸腔后，置于液氮進行轉錄組測序；另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定用于病理學研究；剩余部分凍存在-80 ℃冰箱用于抗氧化酶、細胞因子和基因表達分析。實驗動物倫理審查批準文號：GDOU-LAE-2022-13。

1.3.3 小鼠疾病活動指數(shù)評價

感染期間，觀察并記錄各組小鼠的活動行為、飲食攝水、精神狀況、糞便性狀和體質量變化等指標。根據(jù)疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評價標準，結合體質量下降比例、血便程度和臟器病變等指標進行評分[9]。

1.3.4 結腸病理損傷分析

對固定的結腸樣品進行乙醇梯度脫水（30%、50%、70%、85%、95%、100%）、透明、浸蠟、包埋、切片（厚度5 μm）、展片、貼片、烤片、常規(guī)脫蠟復水、HE染色和SR染色、梯度脫水、中性樹膠封片。為避免結腸樣品不同位置切片造成的誤差，各組切片均取自相近橫截面，使用普通光學顯微鏡或偏振光顯微鏡（400×）全視野全盲閱片，觀察結腸上皮結構完整性，并參照文獻[14]分析結腸隱窩深度、水腫和固有層炎性細胞浸潤，按照評分標準隨機取切片5 張不同位置的圖片進行組織病理學評分（histopathological score，HIS）。

1.3.5 結腸屏障功能檢測

結腸屏障功能與組織纖維化程度密切相關，可以利用臟器纖維化標記物I 型膠原蛋白（type I collagen protein，TICP）和III型膠原蛋白（type III collagen protein，TIIICP）表達量作為評價結腸屏障功能的指標[16]。采用免疫熒光法檢測結腸組織纖維化標記物TICP和TIIICP蛋白表達量，具體操作如下：取1.3.4節(jié)制備的結腸石蠟切片，根據(jù)免疫熒光試劑盒說明書，將結腸石蠟切片脫蠟，熱原修復，畫圈標記并用5%胎牛血清封閉，滴加TICP和TIIICP一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3 次后加入超敏兔鼠通用二抗避光室溫孵育50 min，隨后，使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（diaminy phenylindoles，DAPI）復染細胞核，猝滅結腸樣本自發(fā)熒光；熒光顯微鏡（400×）觀察并采集圖像。TICP蛋白陽性表達為紅色熒光，TIIICP蛋白陽性表達為綠色熒光，細胞核陽性表達為藍色熒光。

1.3.6 結腸細胞因子含量和抗氧化酶活力檢測

使用IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒檢測結腸組織中細胞因子含量，使用過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和總抗氧化活力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒檢測結腸組織抗氧化酶活力，試樣的制備和具體操作按照說明書開展，利用多功能酶標儀讀取吸光度，測定結腸組織中6 個指標，結腸組織細胞因子含量單位為pg/g，抗氧化酶活力單位為U/mg。

1.3.7 結腸組織轉錄組測序

從對照組、模型組和干預組（魚油高劑量組）每組隨機挑選3 只小鼠結腸樣品提取總RNA；利用Nanodrop 2000紫外分光光度法測定RNA純度，1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA完整性；Oligo（dT）磁珠富集分離真核生物mRNA；Fragmentation緩沖液將mRNA隨機打斷，用六堿基隨機引物逆轉錄酶反轉合成cDNA；純化的雙鏈cDNA經(jīng)末端修復、加A尾并連接測序接頭，送至北京百邁客生物科技有限公司利用Illumina平臺測序。測序獲得的原始讀段（raw reads）經(jīng)過濾后得到潔凈讀段（clean reads），將其比對到小鼠參考基因組mm10（Mus_musculus_GRCm39），使用RSEM工具計算9 個試樣的基因表達水平，并用DEseq2方法進行差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選，篩選條件為|log2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）|≥1、P＜0.01。根據(jù)DEGs檢測結果，對候選基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.3.8 結腸組織轉錄組結果驗證

首先在基因水平，取1.3.7節(jié)中部分Oligo（dT）磁珠富集分離mRNA樣品，應用反轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA，使用20 μL反轉錄體系，通過特異性引物進行qPCR擴增，以β-actin為內參基因，檢測RNA-seq挖掘的候選基因相對表達量，隨機篩選5 個，分別為Cxcl10、Tnfrsfl3c、Pparg、Ppara和Nfkbil1，按照2-ΔΔCt方法計算。引物由上海生物工程有限公司合成，序列見表1。

隨后在蛋白水平，對魚油干預后顯著上調的過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）家族表達進行驗證，以PPARγ為靶蛋白。采用免疫組化法測定其蛋白表達量，具體步驟根據(jù)試劑盒說明書操作，利用普通光學顯微鏡在400×下觀察PPARγ蛋白陽性表達情況，陽性結果為棕黃色，陰性為藍色。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，當P＜0.05明組間存在顯著差異。采用Origin Lab2018軟件作圖，采用ImageJ 1.8.0軟件統(tǒng)計分析TICP和TIIICP蛋白陽性成像面積平均積分光密度。

2 結果與分析

2.1 魚油對副溶血弧菌感染小鼠結腸病理損傷的影響

實驗結束明，對照組鼠籠的墊料整潔無污、糞便呈顆粒狀；模型組鼠籠的墊料黏附污漬、糞便呈帶血稀狀；魚油干預組鼠籠的墊料上黑色斑點和水樣糞便出現(xiàn)不同程度減少，其中高劑量干預組鼠籠墊料的整潔度與對照組相近（圖1A），說明魚油可以改善Vp感染造成的小鼠腹瀉和血便癥狀。HE染色結果顯示，對照組小鼠結腸隱窩清晰、層次分明，黏膜上皮結構完整，無炎性細胞潤濕；模型組小鼠結腸黏膜結構明顯缺失，黏膜細胞減少，隱窩深度變淺，伴有增生結締組織，固有層可見大量炎性細胞浸潤；魚油低劑量和高劑量組小鼠結腸黏膜下層的炎性細胞浸潤明顯減少，局灶性腸腺結構消失，顯著改善了Vp對結腸的侵襲影響（圖1B）。SR染色結果顯示，對照組小鼠結腸組織未見雙折射光，模型組小鼠結腸組織呈現(xiàn)紅、黃和綠色纖維相間，分別代表I、III和IV型膠原纖維，其中紅色粗大纖維雙折光較明顯，伴有微弱的綠色和黃色細纖維折光，這與HE染色觀察到的結締組織增生結果一致；魚油高劑量組小鼠結腸組織中I、III和IV型膠原纖維雙折光均明顯減弱，僅剩較弱的紅色折射光；而魚油低劑量組小鼠結腸組織膠原纖維化緩解效果不明顯（圖1C）。通過DAI評分和HIS定量評估魚油對Vp感染小鼠的保護作用，結果如圖1D、E所示，經(jīng)高劑量魚油干預，小鼠DAI評分和HIS分別為3.89±0.31（7 d）和4.05±0.28，顯著低于模型組（8.25±0.26（7 d）和7.98±0.37）（P＜0.05），但與對照組健康小鼠（0.12±0.02（7 d）和1.05±0.04）相比，仍存在顯著差異（P＜0.05），表明魚油能夠在一定程度上緩解Vp感染損傷，但無法完全逆轉。

2.2 魚油保護副溶血弧菌感染小鼠的腸道屏障功能分析

為了確定魚油對Vp感染小鼠結腸屏障功能的保護作用，對腸組織纖維化關鍵蛋白TICP和TIIICP進行免疫熒光分析，并對每組5 張隨機截取的圖像進行陽性面積熒光密度定量。如圖2A所示，在對照組結腸切片上無明顯的TICP紅色熒光和TIIICP綠色熒光分布；模型組結腸切片上出現(xiàn)了較多的TICP紅色熒光和少量的TIIICP綠熒光區(qū)域，均有序地分布在細胞間質周圍；魚油干預促進了上述纖維化標記物恢復至正常水平，高劑量魚油組TICP和TIIICP的熒光較少分布在切片周圍；各組細胞核均呈現(xiàn)明亮的藍色熒光。此外，與模型組相比，低和高劑量魚油都降低了小鼠結腸組織TICP和TIIICP的熒光強度，其中高劑量魚油顯著降低了2 種纖維化標記蛋白的熒光強度（P＜0.05），而低劑量魚油組僅有所降低，效果不顯著（P＞0.05）（圖2B、C），說明魚油能夠高度抑制Vp感染小鼠結腸TICP和TIIICP表達，減輕結腸組織纖維化程度，增強腸道屏障功能。

圖2 魚油對副溶血弧菌感染小鼠結腸組織纖維化的影響Fig.2 Effect of FO on colonic fibrosis in Vibrio parahaemolyticus infected mice

2.3 魚油抑制副溶血弧菌感染小鼠的過度炎癥和氧化應激

腸道屏障功能受損會激活腸道過度炎癥和氧化應激。如圖3A～C所示，模型組小鼠結腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量分別為對照組的2.72、2.28 倍和2.32 倍，說明Vp感染使小鼠結腸產(chǎn)生過度炎癥反應；魚油干預能夠降低小鼠結腸3 種促炎因子含量，其中高劑量魚油抑制炎癥的效果優(yōu)于低劑量魚油，高劑量組IL-1β、IL-6和TNF-α水平僅分別為模型組的44%、52%和42%，組間差異顯著（P＜0.05）。此外，檢測各組小鼠結腸組織中CAT、SOD活力和T-AOC發(fā)現(xiàn)，模型組結腸CAT、SOD和T-AOC水平顯著低于對照組（P＜0.05），說明Vp感染誘導炎癥后，進一步造成腸道抗氧化系統(tǒng)紊亂，形成氧化應激；魚油干預不同程度提高了結腸3 種抗氧化酶活力，特別是高劑量干預組SOD活力和T-AOC接近對照組（P＞0.05）（圖3D～F）。綜上說明，魚油干預與炎癥反應和氧化應激指標之間存在明顯的劑量依賴關系，小鼠膳食補充高劑量魚油能夠更好地抑制Vp感染造成的過度炎癥和氧化應激。因此，后續(xù)研究選擇高劑量干預組深入探討魚油對小鼠的保護作用機理。

圖3 魚油對副溶血弧菌感染小鼠結腸組織炎癥和抗氧化性的影響Fig.3 Effect of FO on colonic inflammation and antioxidant activity in Vibrio parahaemolyticus infected mice

2.4 魚油調控副溶血弧菌感染小鼠的腸道基因表達譜

2.4.1 測序數(shù)據(jù)質量分析

經(jīng)建庫上機測序后，將各組結腸組織的基因表達數(shù)據(jù)通過Seqprep和Sickle軟件計算堿基質量得分、評價測序錯誤率和堿基含量，如表2所示，9 個樣品獲得的平均raw reads為49.78×106條，平均clean reads為48.53×106條，平均Q30堿基占比約95.10%，單個堿基測序錯誤率低于0.1%；各組測序得到clean reads與小鼠參考基因組的比對率達91.28%～97.15%，共得到29 436 個基因，其中28 811 個已知基因，625 個新基因，證明測序數(shù)據(jù)質量較高，可用于識別魚油介導的差異基因和功能聚類分析。

表2 轉錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Statistical analysis of RNA-sequencing data

2.4.2 識別差異表達基因

基于DESeq2方法篩選組間結腸組織中的DEGs，模型組與對照組相比，篩選出169 個顯著變化的DEGs，其中86 個上調，83 個下調；干預組與模型組相比，篩選出顯著變化的DEGs有106 個，其中28 個上調，78 個下調（圖4A～C）。運用StringTie、edgeR方法，篩選對照組、模型組和干預組交集共有和特有的DEGs，3 組間交集處共有12 個DEGs，對照組與模型組間特有的DEGs為157 個，干預組與模型組間特有的DEGs為94 個（圖4D）。針對3 組間DEGs聚類分析，熱圖分析結果顯示，與對照組相比，在干預組顯著下調，而模型組中顯著上調的DEGs包括CXC趨化因子基因（Cxcl10、Cxcl2和Cxcl5）、TNF-α誘導蛋白基因（Tnfrsfl3c）、炎癥因子受體基因（Nfkbil1）等；與對照組相比，在模型組顯著下調，而干預組中顯著上調的DEGs包括PPAR家族蛋白基因（Pparg、Ppard、Ppara和Ppagcla）等。綜上，魚油顯著改變了小鼠腸道基因表達模式。

圖4 魚油對副溶血弧菌感染小鼠結腸DEGs的影響Fig.4 Effect of FO on differentially expressed genes (DEGs) in colon of Vibrio parahaemolyticus infected mice

2.4.3 差異表達基因GO功能富集和KEGG途徑富集分析

為了探索魚油緩解Vp誘導腸炎性損傷的分子機制，利用Metascape軟件，對DEGs進行GO和KEGG分析。結果顯示，模型組與對照組的DEGs主要富集于生物學過程（biological process）158 個GO條目，包括免疫系統(tǒng)過程（immune system process）、對刺激的反應（response to stimulus）和代謝過程（metabolic process）等；細胞組分（cellular component）24 個GO條目，包括胞外區(qū)（extracellular region）和分子復合物（macromolecular complex）等；分子功能（molecular function）16 個GO條目，包括結合作用（bindings）和催化活性（catalytic activity）等。干預組與模型組的DEGs富集于生物學過程71 個GO條目，包括細胞過程（cellular process）、信號傳導（signalling）和生物調節(jié)（biological regulation）等；細胞組分19 個GO條目，包括免疫球蛋白復合體（immunoglobulin complex）和質膜外側（external side of plasma membrane）等；分子功能9 個GO條目，包括免疫球蛋白受體結（immunoglobulin receptor binding）和抗原結合（antigen binding）等（圖5A、B）。進一步分析魚油介導DEGs涉及的細胞信號通路，如圖5C、D所示，模型組與對照組相比，富集于3 個KEGG信號通路，主要包括細胞凋亡（apoptosis）、弧菌感染（Vibriosinfection）和核因子-κB信號通路（NF-kappa B signaling pathway）等；干預組與模型組相比，富集于15 個KEGG信號通路，主要包括PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）、腸免疫網(wǎng)絡免疫球蛋白A合成途徑（intestinal immune network for IgA production）和磷酯酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路（PI3K/Akt signaling pathway）等。經(jīng)DEGs網(wǎng)絡互作分析可知，Cxcl10、Cxcl2、Cxcl5、Tnfrsfl3c、Nfkbil1等參與模型組富集的核因子-κB信號通路（圖5E、F）；而Pparg、Ppard、Ppara、Ppagcla等參與干預組富集的PPAR信號通路，這與2.4.2節(jié)熱圖分析的結果相印證。上述結果表明，魚油通過調節(jié)結腸基因表達，富集免疫相關信號通路，進而抑制炎癥信號傳導，減輕Vp感染誘導的結腸損傷。

圖5 魚油對副溶血弧菌感染小鼠結腸DEGs的GO功能富集和KEGG通路富集影響Fig.5 Effect of FO on GO enrichment and KEGG pathway enrichment of DEGs in colon of Vibrio parahaemolyticus infected mice

2.4.4 魚油介導的腸道靶基因驗證

為了驗證RNA-seq數(shù)據(jù)的準確性，隨機選擇在Vp感染和魚油干預中顯著變化的5 個DEGs進行qPCR驗證，分別為Cxcl10、Tnfrsfl3c、Pparg、Ppara和Nfkbil1，并對魚油顯著上調的PPAR家族蛋白的核心基因PPARγ進行免疫組化蛋白表達分析。如圖6所示，篩選的5 個DEGs在RNA-seq與qPCR分析中的變化規(guī)律保持一致，與對照組相比，模型組小鼠結腸組織Cxcl10、Tnfrsfl3c和Nfkbil1相對表達量均顯著升高，經(jīng)魚油干預后顯著下降（P＜0.05），而結腸Pparg和Ppara的表達規(guī)律相反。此外，與對照組相比，模型組PPARγ表達量顯著降低，小鼠結腸組織PPARγ蛋白表達量經(jīng)魚油干預后顯著提高（干預組呈明亮的黃褐色），這與RNA-seq和qPCR分析結果一致。

3 討論

隨著人們對“潮汕生腌”和“日本刺身”等生食水產(chǎn)品的青睞與日俱增，Vp導致的食物中毒事故在我國多個城市呈明顯上升趨勢[17]。抗生素雖能殺死病原菌，但大范圍的使用會導致多重耐藥株的出現(xiàn)，這增加了臨床治療Vp感染的難度[18]。本研究針對Vp誘導的腸組織基因表達異常，構建Vp感染小鼠模型，探究魚油對Vp造成的腸炎性損傷的保護作用及其潛在機制。

腸上皮結構的完整性在維持微生態(tài)平衡和抵御病原體侵襲中發(fā)揮關鍵作用[19]。隱窩深度和黏膜細胞數(shù)是反映致病菌感染的重要指標，當隱窩深度變淺、黏膜組織破損明，觸發(fā)炎癥反應，造成結締組織增生，削弱腸道功能[20]。與此相似，本研究結果顯示，Vp誘導小鼠腸黏膜固有層和上皮組織分離，黏膜完整性受損，固有層出現(xiàn)大量炎性細胞聚集，伴有I、III和IV型膠原纖維沉積，說明Vp感染導致小鼠結腸病理性改變。經(jīng)膳食補充4.0 mg魚油后，顯著抑制了Vp引起的水樣血便、DAI評分和HIS增加、膠原纖維沉淀，改善了結腸損傷。Roussel等[21]的研究也證實，小鼠攝入充足劑量ω-3 PUFAs能夠有效扭轉潰瘍性腸炎小鼠結腸上皮結構紊亂、隱窩變形和固有層彌散單核細胞的癥狀。值得注意的是，當小鼠補充相同劑量ω-3 PUFAs明，EPA與DHA攝入比為1∶1明緩解腸道炎癥效果更佳[21]，本研究中使用的魚油EPA/DHA接近此比例。因此，膳食補充魚油緩解Vp感染明，不僅要關注攝入劑量，還應注意不同類型ω-3 PUFAs攝入比。

腸道病理損傷能夠誘導腸纖維化的發(fā)生，導致腸腔狹窄和梗阻，造成腸道屏障功能紊亂。持續(xù)的病理狀態(tài)、炎性損傷會導致腸上皮細胞形成纖維化病灶，局部出現(xiàn)大量成纖維細胞，激活I和III型膠原表達，促進細胞外基質堆積，造成腸屏障功能紊亂，引發(fā)“腸漏”癥狀[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，Vp感染導致結腸黏膜及黏膜下層纖維化，器官纖維化標記物TICP和TIIICP的合成能力明顯增加，而魚油可以維持Vp感染小鼠的正常結腸形態(tài)，并改善腸纖維化程度。這與Sunagawa等[23]的研究結果一致，其發(fā)現(xiàn)在心力衰竭大鼠模型中，魚油降低了血管周圍TICP和TIIICP的表達水平，抑制了心肌梗死誘導的心臟成纖維細胞增殖和纖維化。此外，有研究表明，ω-3 PUFAs通過抑制結腸上皮細胞內質網(wǎng)應激，減輕細胞纖維化程度，進而恢復小鼠腸黏膜柔性和屏障功能[24]。綜上，魚油緩解Vp誘導的小鼠結腸纖維化可能與調控結腸細胞基因表達有關。

正常生理狀態(tài)下，腸組織活化的巨噬細胞、樹突狀細胞和上皮基質細胞通過分泌適量的促炎因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）參與免疫應答與免疫調節(jié)；當腸道受到強烈的逆境脅迫明，免疫細胞合成過量的細胞因子會激發(fā)活性氧，造成抗氧化系統(tǒng)失衡，形成氧化應激，給組織和器官帶來嚴重損傷[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，Vp感染的小鼠結腸組織能夠產(chǎn)生大量的IL-1β、IL-6和TNF-α，同明抑制CAT、SOD和T-AOC抗氧化酶活力，造成過度炎癥和氧化壓力。然而，經(jīng)魚油干預處理的小鼠被Vp感染后，其結腸組織中3 種促炎因子含量均顯著下降，3 種抗氧化酶活性得到提升。有研究指出，富含ω-3 PUFAs的魚油和磷蝦油通過降低沙門氏菌和檸檬酸桿菌侵襲小鼠結腸和血清中炎性因子含量，提高抗炎性因子水平，恢復抗氧化酶活力，改善致病菌感染損傷[13,26]。綜上，魚油緩解Vp誘導的腸道生理功能異常與調節(jié)過度炎癥和氧化應激相關。

腸道病理和生理功能的改變，本質上是由腸組織細胞基因表達量、表達模式和相應功能決定。本研究顯示，小鼠暴露Vp感染后，結腸組織產(chǎn)生169 個DEGs，其中86 個上調，83 個下調，主要富集在免疫系統(tǒng)過程、對刺激的反應和代謝過程等生物學過程，并參與細胞凋亡、弧菌感染和核因子-κB信號通路等信號通路，富集這些途徑中顯著上調的基因包括Cxcl10、Cxcl2、Cxcl5、Tnfrsfl3c、Nfkbil1等。有研究指出，CXC趨化因子（Cxcl10）參與激活凋亡壞死相關的炎癥和免疫反應，細胞壞死導致膜破裂和細胞內容物釋放，加劇炎癥反應[27-28]。炎癥因子受體（Nfkbil1）可觸發(fā)NF-κB轉錄，誘導TNF-α分泌[29]。綜上，Vp可通過上調小鼠結腸組織中炎癥相關基因的表達，驅動炎癥反應，誘導腸道病理性改變和生理功能紊亂。然而，小鼠經(jīng)魚油干預后暴露于Vp，結腸組織產(chǎn)生106 個DEGs，其中28 個上調，78 個下調，主要富集在細胞過程、信號傳導和生物調節(jié)等生物學過程，參與PPAR信號通路、腸免疫網(wǎng)絡免疫球蛋白A合成途徑和PI3K/Akt信號通路，富集這些途徑中顯著上調的基因包括PPAR家族蛋白基因Pparg、Ppard、Ppara和Ppagcla等。有研究表明，PPAR是一種新型的核激素受體超家族，是調控基因表達所必需的核受體[30]。PPAR廣泛分布于腸道、肝臟和腎臟等多個組織器官，參與調控脂質代謝、炎癥反應、細胞增殖和纖維化[31]，其中上調PPARγ表達可以防止組織纖維化，高表達的PPARγ活化Akt受體并激活信號傳遞，提高組織抗炎和抗氧化能力[32]。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著魚油干預組小鼠結腸組織PPAR家族蛋白轉錄水平的升高，結腸炎癥反應和氧化壓力明顯減弱，病理損傷也得到緩解。此外，本研究在基因和蛋白水平驗證了PPAR家族關鍵蛋白PPARγ介導的魚油發(fā)揮生物學功能。綜上，魚油通過上調PPAR家族蛋白基因，下調CXC趨化因子基因和炎癥因子受體基因，優(yōu)化了結腸基因表達模式，進而富集免疫相關的PPAR信號通路，減少炎癥相關的核因子κB信號通路，從而改善Vp感染誘導的結腸炎損傷。PPAR家族蛋白在魚油緩解Vp感染過程中發(fā)揮了關鍵作用，其參與調控的代謝通路尚待闡明。此外，本研究證實了魚油對Vp感染具有明顯的抵御作用，其在Vp暴露后能否發(fā)揮治療作用有待進一步探究。

綜上所述，魚油能夠調節(jié)小鼠結腸組織基因表達譜，富集免疫功能相關的基因和信號通路，特別是PPAR家族蛋白基因介導的信號轉導途徑，抑制Cxcl10、Cxcl2、Cxcl5、Tnfrsfl3c、Nfkbil1參與的炎癥反應和IL-1β、IL-6和TNF-α分泌，提高CAT、SOD抗氧化酶活力和T-AOC，下調TICP和TIIICP纖維標記物的蛋白表達，維系腸屏障功能，抵御致病菌侵入腸道深層結構，緩解Vp感染損傷。本研究成果可為魚油抗致病菌感染功能食品的開發(fā)及應用提供理論支持。