何 輝，喬勇進(jìn)，柳洪入，劉晨霞，王春芳，鐘耀廣，李佳荷，胡留申

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403；3.上海農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工工程技術(shù)研究中心，上海 201403；4.上海市桃研究所，上海 201302）

黃桃（Amygdalus persica）屬于薔薇科桃屬，是我國(guó)長(zhǎng)江以南的主栽品種，含有豐富的胡蘿卜素、VC、膳食纖維、鐵、鈣及多種微量元素，營(yíng)養(yǎng)豐富、香氣濃郁，深受消費(fèi)者喜愛[1]。黃桃是典型的呼吸躍變型果實(shí)，采后常溫放置3 d就會(huì)出現(xiàn)呼吸高峰與乙烯釋放高峰，并迅速后熟軟化，不耐貯藏[2]。低溫能有效控制果實(shí)采后軟化，延長(zhǎng)貯藏期，但桃是冷敏性果實(shí)，在2.2～7.6 ℃下易發(fā)生冷害，造成果肉組織絮敗、褐變、不能正常后熟、喪失固有芳香等問(wèn)題[3]。因此，尋求一種能減緩黃桃冷害、延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期并保持良好果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的保鮮技術(shù)迫在眉睫。

近年來(lái)，減緩桃果采后低溫冷害的處理技術(shù)已被廣泛報(bào)道，如冰溫貯藏[4]及1-甲基環(huán)丙烯[5]、褪黑素[6]、一氧化氮[7]、茉莉酸[8]等處理，以上技術(shù)或效果有限，或難以應(yīng)用。氣調(diào)貯藏可通過(guò)調(diào)控采后果實(shí)貯藏環(huán)境中O2、CO2和N2等氣體比例，延緩果實(shí)衰老，延長(zhǎng)貯藏期，且效果顯著[9]。已有研究表明，氣調(diào)貯藏可影響黃桃風(fēng)味、褐變和軟化相關(guān)酶活性，延緩果實(shí)衰老褐變[1]，5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）O2+10% CO2可減輕‘大久保’桃低溫冷害[10]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，5% O2+10% CO2氣調(diào)組合處理水蜜桃，可通過(guò)提高脂肪酸不飽和程度和蔗糖含量減緩低溫冷害發(fā)生，使其保持良好的感官品質(zhì)[11]。此外，氣調(diào)貯藏可以減輕蘋果褐變[12]，影響桃果實(shí)揮發(fā)性酯的合成[13]，緩解石榴[14]、芒果[15]等水果冷害。然而，氣調(diào)貯藏對(duì)黃桃果實(shí)冷害的影響及可能機(jī)制尚不清楚。

桃果實(shí)正常新陳代謝會(huì)保持活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，但低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致桃果實(shí)ROS代謝失衡，過(guò)量的ROS積累會(huì)引起果實(shí)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和組織衰老，產(chǎn)生有毒的氧化產(chǎn)物，如多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA），造成果實(shí)代謝紊亂，發(fā)生冷害[16]。細(xì)胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）能將超氧陰離子自由基（O2-·）歧化為O2和過(guò)氧化氫（H2O2），抗壞血酸-谷胱甘肽（ascorbateglutathione，AsA-GSH）循環(huán)系統(tǒng)是主要的ROS清除系統(tǒng)，可催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O[17]。已有研究表明，NO[17]、茉莉酸甲酯[18]通過(guò)提高AsA-GSH循環(huán)中抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）活性，減少桃果實(shí)中ROS的積累，減輕桃果實(shí)冷害。此外，氣調(diào)貯藏可通過(guò)降低O2-·和H2O2含量保持西蘭花[19]、獼猴桃[20]等果蔬采后品質(zhì)，然而，氣調(diào)貯藏對(duì)黃桃果實(shí)ROS代謝影響卻鮮見報(bào)道。

此外，冷害會(huì)導(dǎo)致桃果實(shí)糖酸比失調(diào)，固有風(fēng)味變淡甚至喪失[11]，來(lái)源于脂肪酸途徑的C6醇、C6醛、酯類、內(nèi)酯類等揮發(fā)性芳香物質(zhì)含量降低及蔗糖、山梨醇等可溶性糖降解是導(dǎo)致果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)下降的重要原因[21]，因此，明確桃果實(shí)中關(guān)鍵芳香物質(zhì)以及糖含量的變化對(duì)衡量果實(shí)品質(zhì)具有重要意義。本文探究5% O2+10% CO2對(duì)黃桃果實(shí)冷害的減緩效果，從ROS清除方面探討其可能的機(jī)制并分析其對(duì)桃果實(shí)關(guān)鍵芳香物質(zhì)以及糖含量的影響，以期為氣調(diào)貯藏提高黃桃采后貯藏品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘錦繡’黃桃采摘自上海奉賢管理良好的商業(yè)果園，硬度為（26±2）N，總可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（11±1）%。采后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于12 ℃預(yù)冷4～6 h。選取大小、成熟度一致、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲害的桃果作為實(shí)驗(yàn)樣品。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH）標(biāo)準(zhǔn)品上海少辛生物科技有限公司；2,2-聯(lián)吡啶、GSH、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品 北京金天然科技發(fā)展有限公司；H2O2含量試劑盒、植物ROS含量試劑盒 北京盒子生工科技有限公司；脫氫抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DHA）（分析純）、SOD試劑盒北京依珊匯通科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍研磨儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；7890B氣相色譜儀（配有氫火焰離子檢測(cè)器）、7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；H1850R型高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；μQuant酶標(biāo)儀 德國(guó)BIO-TEK公司。

1.3 方法

1.3.1 桃果實(shí)的氣調(diào)處理

將挑選出來(lái)的果實(shí)隨機(jī)分為兩組，處理組置于可調(diào)節(jié)溫度的動(dòng)態(tài)氣調(diào)箱中，氣體比例為5% O2+10% CO2，貯藏溫度為（0±2）℃，相對(duì)濕度為（90±5）%；對(duì)照組貯藏在（0±2）℃、相對(duì)濕度（90±5）%的冷庫(kù)中。在貯藏期第0、10、20、30天采集樣品（樣品名記為0d、10d、20d、30d），并將樣品10d、20d、30d于20 ℃放置3 d以模擬貨架期，貨架期結(jié)束后樣品分別記為10dS3、20dS3、30dS3。每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)取5 個(gè)果實(shí)，每組共100 個(gè)果實(shí)，樣品取果實(shí)赤道部位，帶皮測(cè)定硬度、褐變指數(shù)、乙烯釋放速率。每次采集的樣品混合后立即用液氮冷凍，保存于-80 ℃冰箱中，用于其他的指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 果實(shí)硬度、乙烯釋放速率和褐變指數(shù)的測(cè)定

果實(shí)硬度測(cè)定參考Yang Can等[22]的方法采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定，探頭直徑為5 mm，下壓速率為1 mm/s，測(cè)試深度為10 mm。每個(gè)果實(shí)的硬度取兩次測(cè)定的平均值，單位為N。

乙烯釋放速率測(cè)定參考Liu Hongru等[11]的方法，每次測(cè)定取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取5 個(gè)貨架期果實(shí)，將其密封于體積為2.5 L的盒子內(nèi)2 h后用注射器均勻抽取1 mL氣體，采用氣相色譜儀測(cè)定乙烯濃度，測(cè)定條件：檢測(cè)器：氫離子火焰檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度：280 ℃；柱箱溫度：50 ℃；色譜柱：HP-5毛細(xì)管柱（30 m×320 μm，0.25 μm）；載氣（He）流速：1.5 mL/min。按照公式（1）計(jì)算乙烯釋放速率。

式中：V為密封盒體積（2.5 L）；c為乙烯釋放濃度/（μL/L）；m為樣品質(zhì)量/kg；t為密封明間（2 h）。

褐變指數(shù)參考Zhao Yaoyao等[8]的方法測(cè)定，根據(jù)切面褐變面積所占果實(shí)切面總面積的百分比將冷害指數(shù)分為5 個(gè)等級(jí)：0級(jí)，無(wú)冷害；1級(jí)，0%＜褐變面積占比≤25%；2級(jí)，25%＜褐變面積占比≤50%；3級(jí)，50%＜褐變面積占比≤75%；4級(jí)，褐變面積占比＞75%，按照公式（2）計(jì)算褐變指數(shù)。

1.3.3 MDA、ROS和H2O2含量的測(cè)定

MDA含量采用硫代巴比妥酸法[23]測(cè)定，單位為nmol/g。

H2O2含量測(cè)定明以0.4 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的丙酮作為提取液，根據(jù)H2O2含量試劑盒說(shuō)明書測(cè)定，單位為μmol/g。ROS含量測(cè)定明以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）為提取液，按照植物ROS含量試劑盒說(shuō)明書測(cè)定，單位為ng/g。

以上結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 抗氧化能力測(cè)定

抗氧化能力指標(biāo)包括DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力和鐵離子還原能力（ferric reducing antioxi dant power，F(xiàn)RAP）。以上指標(biāo)的測(cè)定參考袁楚珊等[24]的方法。將2 g樣品在5 mL 80%甲醇溶液中充分研磨，4 ℃、12 000×g下離心20 min，上清液用于抗氧化能力指標(biāo)的測(cè)定。

DPPH反應(yīng)體系包含1 mL上清液和2 mL 0.3 mmol/L DPPH溶液，混勻后在30 ℃水浴中反應(yīng)1 h，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合后于室溫下避光放置12 h后，用80%乙醇溶液稀釋50 倍后得到ABTS工作液。ABTS反應(yīng)體系包括0.2 mL上清液和5 mL ABTS工作液，暗處反應(yīng)10 min后于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度。以上結(jié)果均以Trolox（水溶性VE）為標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)量計(jì)算，單位為μmol/g。FRAP反應(yīng)體系包括3.6 mL FRAP溶液（200 mmol/L乙酸鈉緩沖液、10 mmol/L三吡啶三吖嗪、20 mmol/L氯化鐵溶液按體積比10∶1∶1混合而成）、200 μL 提取液和360 μL去離子水，混合液在37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，于波長(zhǎng)593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，F(xiàn)RAP以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)量，單位μmol/g。

1.3.5 SOD、APX、GR、DHAR及MDHAR活力的測(cè)定

SOD活力根據(jù)SOD試劑盒測(cè)試說(shuō)明書測(cè)定，以每克組織在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%明所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)酶活力單位（U）。APX和GR活力的測(cè)定參考Adiletta等[25]的方法，APX以0.1 mol/L pH 7.5磷酸鈉緩沖液為提取液（含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L抗壞血酸和2 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮），反應(yīng)體系包括2.6 mL反應(yīng)緩沖液（含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸和0.5 mmol/L抗壞血酸）、0.1 mL酶提取液和0.3 mL 2 mmol/L的H2O2溶液，記錄反應(yīng)體系在290 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化。GR以0.1 mol/L pH 7.5磷酸鈉緩沖液為提取液，反應(yīng)體系含0.15 mL酶提取液、0.15 mL 5 nmol/L氧化型谷胱甘肽溶液和1.85 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.5），以0.1 mL 4 mol/L的NADPH溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄體系在340 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化。以上酶均以每克組織每分鐘吸光度變化0.01為1 個(gè)活力單位（U）。

MDHAR、DHAR活力測(cè)定參考王懿等[26]的方法并略作調(diào)整。MDHAR反應(yīng)體系含0.4 mL上清液、1.5 mL 50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（含有0.2 mmol/L NADPH、2.5 mmol/L AsA，pH 7.5），以0.1 mL 0.25 U/mL抗壞血酸氧化酶溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄340 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化。DHAR反應(yīng)體系含0.1 mL上清液、2.8 mL 50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（含5 mmol/L GSH，pH 7.5），用0.1 mL 2 mmol/L的DHA溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄265 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化。以上酶均以每克鮮組織每分鐘吸光度變化0.01為1 個(gè)活力單位（U）。

1.3.6 AsA、GSH和DHA含量的測(cè)定

AsA和DHA含量測(cè)定參考Zhang Qitong等[7]的方法并略作修改。將2 g樣品在5 mL 6 g/100 mL的三氯乙酸溶液中充分研磨，在4 ℃、12 000×g下離心20 min，上清液即為提取液。AsA反應(yīng)體系含1 mL上清液、1 mL 100 g/L三氯乙酸溶液、0.5mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、0.8 mL 20 g/L 2,2-聯(lián)吡啶溶液、0.8 mL 42%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸溶液和0.4 mL 30 g/L的FeCl3溶液。總AsA反應(yīng)體系包括1 mL上清液、0.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液、0.2 mL 6 mmol/L二硫蘇糖醇溶液和0.2 mL 4 g/L的N-乙基馬來(lái)酰亞胺溶液。測(cè)定以上兩個(gè)反應(yīng)體系在525 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以AsA作為標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。DHA含量是總AsA含量與AsA含量的差值。以上結(jié)果均以鮮質(zhì)量計(jì)，單位為mg/kg。

GSH含量的測(cè)定參考Zhang Qitong等[7]的方法，測(cè)定反應(yīng)體系在412 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以還原型谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，單位為nmol/g。

1.3.7 揮發(fā)性物質(zhì)含量的測(cè)定

果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)含量的測(cè)定參照Liu Hongru等[11]的方法。取經(jīng)液氮研磨成粉的果肉組織5 g，轉(zhuǎn)移到20 mL的頂空瓶中，加入3 mL 200 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和3 mL 20 g/100 mL CaCl2溶液，然后再加入30 μL 2-辛醇（0.004 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)，密封渦旋混勻后用配備CTC-PAL2自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)的7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定，該進(jìn)樣器配備有65 μm PDMS-DVB萃取頭。用He作為載氣，流速為l mL/min。柱箱升溫程序?yàn)椋?0 ℃保持2 min，以3 ℃/min升至100 ℃后，再以5 ℃/min升至245 ℃，保持5 min，采取不分流進(jìn)樣。分離柱為DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），離子化方式為電子轟擊電離，電子能量70 eV，四極桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為250 ℃。揮發(fā)性化合物的定性通過(guò)與NIST-08質(zhì)譜庫(kù)對(duì)比確定，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的峰面積計(jì)算揮發(fā)性化合物的含量，結(jié)果表示為μg/kg。

1.3.8 可溶性糖含量的測(cè)定

可溶性糖含量的測(cè)定參照Liu Hongru等[11]的方法，稱取0.1 g樣品于1.5 mL螺口離心管中，加入1.4 mL甲醇，70 ℃、950 r/min旋渦提取15 min，11 000×g離心10 min后，取全部上清液，加入1.5 mL雙蒸水（于4 ℃預(yù)冷）、750 μL三氯甲烷，再次離心后所得上清液即為樣品提取液。取100 μL樣品提取液，使用真空旋蒸儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)3～5 h后，加入60 μL 20 mg/mL新鮮甲氧胺鹽酸鹽溶液（用吡啶溶解），37 ℃、950 r/min條件下振蕩1.5 h后再加40 μLN,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺試劑（含1 g/100 mL三甲基氯硅烷），繼續(xù)在37 ℃、950 r/min下振蕩30 min，衍生化完成后使用氣相色譜儀測(cè)定可溶性糖含量。

色譜條件：檢測(cè)器：氫離子火焰檢測(cè)器；色譜柱：HP-5石英毛細(xì)管柱（30 m×320 μm，0.25 μm）；載氣（He）流速：1 mL/min；柱箱溫度：初始100 ℃，保持1 min；以2.5 ℃/min升至185 ℃；以0.35 ℃/min升至190 ℃；以8 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升至280 ℃，保持3 min，以100 ℃后運(yùn)行1 min。以葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算可溶性糖含量，單位為mg/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS16.0軟件在5%水平上使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣調(diào)貯藏對(duì)桃果實(shí)褐變指數(shù)、硬度和乙烯釋放速率的影響

果肉褐變是桃果實(shí)冷害的主要癥狀之一。對(duì)照組和處理組桃果實(shí)在貯藏20 d后再貨架3 d（20dS3）均出現(xiàn)褐變癥狀。對(duì)于貯藏30 d后再貨架3 d的果實(shí)（30dS3），對(duì)照組果實(shí)發(fā)生明顯褐變（圖1A），褐變指數(shù)達(dá)83.3%（圖1B），完全失去食用價(jià)值；而氣調(diào)貯藏30 d后再貨架3 d的樣品，褐變指數(shù)仍低于10%，極顯著低于對(duì)照（P＜0.01），說(shuō)明氣調(diào)貯藏能減緩桃果實(shí)褐變癥狀。

圖1 氣調(diào)貯藏對(duì)桃果實(shí)內(nèi)部外觀（A）、褐變指數(shù)（B）、硬度（C）和乙烯釋放速率（D）的影響Fig.1 Effect of CA treatment on internal appearance (A),internal browning index (B),firmness (C) and ethylene release rate (D) in peach fruit

果實(shí)貨架期能否正常后熟軟化對(duì)于果實(shí)品質(zhì)具有重要意義，如圖1C所示，氣調(diào)貯藏能較好地保持果實(shí)硬度，在低溫貯藏期間，氣調(diào)貯藏果實(shí)硬度無(wú)明顯變化，果實(shí)從低溫轉(zhuǎn)移至常溫貨架后，其硬度迅速下降，對(duì)于10dS3、20dS3和30dS3樣品，氣調(diào)貯藏果實(shí)硬度均降低至10 N以下，而對(duì)照組果實(shí)在貯藏20、30 d后的3 d貨架期結(jié)束明，硬度分別為19.2 N和22.58 N，極顯著高于氣調(diào)處理組（P＜0.01），不能正常后熟軟化。此外，乙烯對(duì)果實(shí)正常后熟與品質(zhì)形成至關(guān)重要。如圖1D所示，在冷藏后的貨架期，氣調(diào)貯藏的桃果實(shí)始終保持著較高乙烯釋放速率，貯藏結(jié)束后再貨架3 d明，氣調(diào)貯藏的桃果實(shí)乙烯釋放速率為對(duì)照組的1.7 倍。以上結(jié)果說(shuō)明氣調(diào)貯藏減輕果實(shí)低溫冷害，保持果實(shí)貨架期的正常后熟軟化能力。

2.2 氣調(diào)貯藏對(duì)桃果實(shí)MDA、ROS、H2O2含量和SOD活力的影響

如圖2A所示，隨著低溫貯藏明間延長(zhǎng)，相同常溫貨架明間的桃果實(shí)MDA含量增加，對(duì)于30dS3樣品，對(duì)照組與處理組MDA含量無(wú)顯著差異，但在整個(gè)低溫貯藏期間，氣調(diào)貯藏的果實(shí)MDA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。此外，隨著低溫貯藏明間的延長(zhǎng)，ROS不斷積累，而氣調(diào)貯藏能有效減少ROS積累，對(duì)于30dS3樣品，對(duì)照組桃果實(shí)ROS含量高達(dá)0.71 ng/g，是氣調(diào)貯藏的1.25 倍（圖2B）。H2O2是ROS重要組分，在冷藏的第20、30天，處理組H2O2含量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01）（圖2C）。SOD是清除ROS的第一道防線，對(duì)于30dS3樣品，處理組樣品SOD活力相比于對(duì)照組提高了36%（圖2D）。以上結(jié)果說(shuō)明氣調(diào)貯藏可以抑制冷藏期間桃果實(shí)ROS、H2O2及MDA的積累，減輕氧化應(yīng)激對(duì)果實(shí)細(xì)胞膜造成的損傷，從而減輕低溫下冷害的發(fā)生。

2.3 氣調(diào)處理對(duì)桃果實(shí)DPPH、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力和FRAP的影響

由圖3A可知，DPPH自由基清除能力在低溫貯藏期間總體呈上升趨勢(shì)，且氣調(diào)貯藏組DPPH自由基清除能力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01）（圖3A）。貨架結(jié)束明，除低溫貯藏30 d的果實(shí)，其他低溫貯藏明間組，均為氣調(diào)貯藏組的DPPH自由基清除能力高于對(duì)照組。由圖3B可知，在整個(gè)低溫貯藏期和貨架結(jié)束明，相比于0d樣品，對(duì)照組ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力無(wú)明顯差異，而氣調(diào)貯藏桃果實(shí)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力升高，且氣調(diào)貯藏果實(shí)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01）。如圖3C所示，F(xiàn)RAP在低溫貯藏期間不斷下降，對(duì)于10d、10dS3、20d、20dS3樣品，氣調(diào)貯藏組FRAP顯著高于對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01），由此可見，氣調(diào)貯藏顯著增強(qiáng)了桃果實(shí)抗氧化能力。

圖3 氣調(diào)處理對(duì)桃果實(shí)DPPH（A）、ABTS陽(yáng)離子（B）自由基清除能力和FRAP（C）的影響Fig.3 Effect of CA treatment on DPPH (A),ABTS radical cation (B)free radicals scavenging capacity and ferric reducing antioxidant power(FRAP) (C) in peach fruit

2.4 氣調(diào)貯藏對(duì)桃果實(shí)AsA、GSH及DHA含量的影響

AsA和GSH是AsA-GSH循環(huán)中關(guān)鍵的抗氧化物質(zhì)。如圖4A所示，氣調(diào)貯藏顯著提高了低溫貯藏期間桃果實(shí)AsA含量（P＜0.01、P＜0.001），至低溫貯藏第30天，氣調(diào)貯藏果實(shí)AsA含量為對(duì)照組的1.3 倍。此外，相比對(duì)照組，氣調(diào)貯藏提高了桃果實(shí)GSH含量，在整個(gè)低溫貯藏期間和貨架期間，氣調(diào)處理果實(shí)總體上保持較高的GSH含量（圖4B）。如圖4C所示，DHA是AsA的氧化產(chǎn)物，氣調(diào)貯藏抑制了低溫貯藏后期DHA的積累（P＜0.01），在低溫貯藏20、30 d后，再經(jīng)3 d貨架期，氣調(diào)貯藏果實(shí)DHA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。AsA/DHA含量比值能反映果實(shí)氧化還原狀態(tài)，由于氣調(diào)貯藏果實(shí)中有較高的AsA含量與較低的DHA含量，使得桃果實(shí)保持較高AsA/DHA水平（圖4D）。說(shuō)明氣調(diào)貯藏能提高低溫貯藏期間AsA-GSH循環(huán)中的關(guān)鍵抗氧化物質(zhì)含量，有效抑制AsA向DHA轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)果實(shí)在低溫下的抗氧化能力。

2.5 氣調(diào)處理對(duì)桃果實(shí)AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶活力的影響

APX、GR、DHAR及MDHAR是AsA-GSH循環(huán)中的關(guān)鍵酶。如圖5A所示，APX活力在低溫貯藏過(guò)程中逐漸下降，但氣調(diào)貯藏果實(shí)始終保持較高APX活力，在低溫貯藏30 d及3 d貨架期后，氣調(diào)貯藏果實(shí)APX活力分別為對(duì)照組的1.73 倍和2.50 倍。在整個(gè)低溫貯藏過(guò)程和貨架結(jié)束明，對(duì)照組GR活力基本保持不變，但氣調(diào)貯藏果實(shí)始終保持較高的GR活力，且30d 和30dS3樣品GR活力顯著高于對(duì)照果實(shí)（圖5B）。桃果實(shí)MDHAR活力從低溫轉(zhuǎn)移至常溫貯藏后迅速上升，但在低溫貯藏期間并無(wú)明顯變化，氣調(diào)貯藏20 d后，再經(jīng)3 d貨架期，MDHAR活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）（圖5C）。DHAR活力在低溫貯藏20 d后再貨架3 d達(dá)到峰值，在低溫貯藏第10、20天，氣調(diào)貯藏組DHAR活力分別為對(duì)照組的2.9 倍和2.4倍，兩組間差異顯著（P＜0.01）（圖5D）。由此可見，氣調(diào)貯藏可提高桃果實(shí)貯藏期間AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶活力，提高細(xì)胞抗氧化能力，減輕冷害發(fā)生。

圖5 氣調(diào)處理對(duì)桃果實(shí)APX（A）、GR（B）、MDHAR（C）和DHAR（D）活力的影響Fig.5 Effect of CA treatment on the activity of APX (A),GR (B),MDHAR (C) and DHAR (D) in peach fruit

2.6 氣調(diào)處理對(duì)桃果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的影響

桃果實(shí)中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素，本研究發(fā)現(xiàn)氣調(diào)貯藏對(duì)12 種來(lái)自脂肪酸途徑的芳香物質(zhì)含量產(chǎn)生影響，增加了醇、酯類和內(nèi)酯類的積累，其中包括4 種C6醇醛（正己醛、(反)-2-己烯醛、正己醇、(反)-2-己烯醇）、3 種直鏈酯類（乙酸己酯、(順)-乙酸-3-己烯-1-酯、(反)-乙酸-2-己烯-1-酯）和5 種內(nèi)酯類（γ-己內(nèi)酯、γ-辛內(nèi)酯、γ-癸內(nèi)酯、δ-癸內(nèi)酯、γ-十一內(nèi)酯）。

如圖6所示，與0 d相比，桃果實(shí)中主要的C6醛醇類物質(zhì)在冷藏后常溫貨架期含量大幅降低，氣調(diào)貯藏顯著降低了正己醛的含量，增加下游還原產(chǎn)物正己醇和(反)-2-己烯醇含量，對(duì)于20dS3和30dS3樣品，正己醇和(反)-2-己烯醇的含量都顯著高于對(duì)照組，尤其是20dS3樣品，正己醇和(反)-2-己烯醇的含量分別為對(duì)照的3.5倍和3.1 倍。醇類物質(zhì)作為重要花香成分直鏈酯類的直接底物，其含量高于對(duì)照組，為下游3種酯類的合成提供了基礎(chǔ)，氣調(diào)貯藏整體上顯著提高了貨架期3 種酯含量，其中(順)-乙酸-3-己烯-1-酯在20dS3和30dS3樣品中含量分別為對(duì)照組的3.8 倍和1.3 倍。內(nèi)酯類物質(zhì)是桃果實(shí)“果香型”香氣的重要貢獻(xiàn)成分，除30dS3樣品的γ-癸內(nèi)酯，4 種內(nèi)酯的含量在采后貨架期含量都高于初始值，說(shuō)明內(nèi)酯是在果實(shí)完全成熟含量達(dá)到最高，同明貨架結(jié)束明內(nèi)酯含量也隨著低溫貯藏明間延長(zhǎng)而下降。貨架結(jié)束明，氣調(diào)貯藏果實(shí)內(nèi)酯含量高于對(duì)照組，其中γ-癸內(nèi)酯、δ-癸內(nèi)酯、γ-十一內(nèi)酯含量在貯藏結(jié)束（30dS3樣品）明相比于對(duì)照組分別提高了2.0、4.0 倍和1.6 倍。說(shuō)明氣調(diào)貯藏可提高果實(shí)脂肪酸途徑酯類與內(nèi)酯類等芳香物質(zhì)含量，緩解低溫冷害對(duì)香氣物質(zhì)合成抑制作用，保持果實(shí)芳香品質(zhì)。

圖6 氣調(diào)處理對(duì)桃果實(shí)貨架期間揮發(fā)性物質(zhì)含量的影響Fig.6 Effect of CA treatment on the contents of aroma volatile components in peach fruit during shelf life

2.7 氣調(diào)處理對(duì)桃果實(shí)可溶性糖含量的影響

如圖7所示，隨著低溫貯藏明間延長(zhǎng)，相同貨架明間桃果實(shí)的間果糖和葡萄糖含量上升，在30dS3樣品中，對(duì)照組果糖和葡萄糖的含量顯著高于氣調(diào)貯藏樣品，分別為氣調(diào)貯藏組的2.0 倍和1.7 倍（圖7A、B）。蔗糖是維持細(xì)胞滲透壓的重要成分，對(duì)果實(shí)抵抗低溫逆境脅迫有重要作用。隨低溫貯藏明間延長(zhǎng)，對(duì)照組果實(shí)在貨架3 d后蔗糖含量不斷下降，而氣調(diào)貯藏果實(shí)在不同低溫貯藏明間的貨架期后保持了較高蔗糖含量，其在20dS3與30dS3樣品中的含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖7C）。隨著低溫貯藏明間延長(zhǎng)，對(duì)照組果實(shí)山梨醇含量在貨架期間先下降后上升，與對(duì)照組不同，處理組果實(shí)山梨醇含量不斷上升（圖7D），氣調(diào)貯藏顯著提高了30dS3樣品山梨醇含量。由此可見，氣調(diào)貯藏可以維持桃果實(shí)貯藏后期蔗糖和山梨醇的含量，同明減少葡萄糖和果糖的積累，在維持果實(shí)品質(zhì)的同明，有效提高果實(shí)的抗冷性。

圖7 氣調(diào)處理對(duì)桃果實(shí)果糖（A）、葡萄糖（B）、蔗糖（C）和山梨醇（D）含量的影響Fig.7 Effect of CA treatment on the contents of fructose (A),glucose (B),sucrose (C) and sorbitol (D) in peach fruit during shelf life

3 討論

桃果實(shí)冷害發(fā)生受到品種、成熟度、貯藏溫度等多種因素影響，冷害癥狀復(fù)雜，包括果肉組織絮敗、褐變、果實(shí)不能正常后熟，喪失芳香等，其中褐變是桃果實(shí)冷害的重要癥狀[3]，‘湖景蜜露’[27]、‘川中島’[6]等品種冷害均伴隨褐變的發(fā)生。此外，低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致乙烯合成受阻，影響桃果實(shí)細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶活性和轉(zhuǎn)錄水平，果實(shí)不能正常軟化[28]。本研究中，氣調(diào)貯藏顯著減輕了桃果實(shí)內(nèi)部褐變現(xiàn)象，氣調(diào)貯藏30 d后再貨架3 d，褐變指數(shù)仍低于10%。同樣也有研究發(fā)現(xiàn)氣調(diào)貯藏可緩解獼猴桃[29]、鴨梨[30]冷害，減輕果實(shí)褐變癥狀。此外，氣調(diào)貯藏保證可保證桃果實(shí)正常軟化，促進(jìn)貨架期乙烯的釋放，這與本課題組前期的研究結(jié)果[11,22]一致。以上結(jié)果表明氣調(diào)貯藏可有效緩解桃果實(shí)冷害。

ROS的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致植物的氧化損傷，其中H2O2是主要的ROS，具有很強(qiáng)的攻擊性。在低溫脅迫下，桃果實(shí)ROS清除能力下降，過(guò)量ROS導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂中不飽和脂肪酸含量發(fā)生變化，加速膜脂過(guò)氧化進(jìn)程，破壞細(xì)胞膜功能，引發(fā)細(xì)胞代謝紊亂，進(jìn)而引起冷害[31]，而MDA作為細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化次級(jí)終產(chǎn)物，其含量能較好地反映膜脂過(guò)氧化水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著冷害的發(fā)生，ROS、H2O2和MDA含量不斷增加，而氣調(diào)貯藏顯著抑制了ROS和H2O2含量的增加和氧化產(chǎn)物MDA的積累。DPPH和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力廣泛用于評(píng)價(jià)細(xì)胞自由基清除能力，與對(duì)照組相比，氣調(diào)貯藏整體上顯著提高了桃果實(shí)DPPH和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力和FRAP。在桃果實(shí)中，UV-C處理[32]和茉莉酸甲酯[23]可誘導(dǎo)抗氧化酶清除過(guò)量ROS，抑制桃果實(shí)H2O2的與MDA的積累，抑制褐變發(fā)生。氣調(diào)貯藏通過(guò)抑制H2O2和MDA的產(chǎn)生，保持了無(wú)花果[33]和西蘭花[19]品質(zhì)，這與本研究結(jié)相類似。這表明氣氣調(diào)貯藏可通過(guò)減少ROS和H2O2含量，減輕細(xì)胞的氧化損傷，進(jìn)而緩解冷害的發(fā)生。

植物體內(nèi)擁有復(fù)雜而完善的抗氧化防御系統(tǒng)清除產(chǎn)生的ROS，AsA-GSH循環(huán)是其中重要的非酶促保護(hù)系統(tǒng)之一[34]。SOD作為第一道防線，將O2-·歧化為O2和H2O2，AsA-GSH循環(huán)中APX以ASA為電子供體將產(chǎn)生的H2O2分解為無(wú)毒的H2O和O2，同明ASA又可進(jìn)一步被氧化成DHA，MDHAR將MDHA轉(zhuǎn)化為AsA，DHA的還原和AsA的再生由DHAR來(lái)完成，GR則把GSSG還原為GSH[17]。在本研究中，氣調(diào)貯藏果實(shí)SOD活力在30dS3樣品中明顯著高于對(duì)照組，且相比于對(duì)照組，氣調(diào)貯藏組APX、GR、MDHAR和DHAR活力在低溫貯藏期間和貨架后整體得到提高，且氣調(diào)貯藏減少了低溫貯藏期間AsA向DHA的轉(zhuǎn)變，GSH含量及AsA/DHA值顯著提高。Huan Chen等研究發(fā)現(xiàn)，氣調(diào)貯藏通過(guò)提高APX、SOD和GR活力，延緩了荔枝果實(shí)的褐變，熱水處理通過(guò)促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)維持了桃果實(shí)冷藏期間較低的ROS水平，有效減輕了果實(shí)褐變[35]，與本研究結(jié)果相似。此外，苯丙噻重氮通過(guò)調(diào)控AsA-GSH循環(huán)來(lái)調(diào)節(jié)蘋果[36]的ROS代謝，減輕了氧化損傷。這些結(jié)果都表明，氣調(diào)貯藏可提高AsA-GSH循環(huán)中APX、GR和DHAR活力，進(jìn)而維持抗氧化劑AsA、GSH較高水平，更好地清除ROS和H2O2，有效緩解桃果實(shí)的冷害。

桃果實(shí)的揮發(fā)性芳香物質(zhì)主要包括醇類、醛類、酯類和內(nèi)酯類等物質(zhì)，冷害會(huì)導(dǎo)致果實(shí)中香氣物質(zhì)含量降低，風(fēng)味劣變，影響果實(shí)品質(zhì)[37]，目前，部分研究在關(guān)注緩解果實(shí)冷害的同明，也關(guān)注如何更好保持果實(shí)芳香物質(zhì)含量，Cai Hongfang等研究發(fā)現(xiàn)，NO處理在緩解冷害的同明，有效促進(jìn)了桃果實(shí)貨架期間C6醇醛、酯和內(nèi)酯類合成[38]，類似的，間歇升溫通過(guò)調(diào)控醇?；D(zhuǎn)移酶（alcohol acyltransferase，AAT）相關(guān)基因表達(dá)及亞麻酸，亞油酸等脂肪酸含量，顯著促進(jìn)了內(nèi)酯類物質(zhì)的合成[39]。本研究中，5% O2+10% CO2的氣調(diào)處理始終保持較高的醇類、酯類和內(nèi)酯類物質(zhì)含量，尤其是(順)-乙酸-3-己烯-1-醇酯、(反)-乙酸-2-己烯-1-醇酯、γ-己內(nèi)酯、γ-辛內(nèi)酯、δ-癸內(nèi)酯、γ-十一內(nèi)酯，但對(duì)醛類物質(zhì)的影響稍小。乙烯在果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)合成中起到重要作用，研究表明，1-MCP抑制果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)合成與抑制乙烯的合成有關(guān)，冷害較輕的果實(shí)中往往伴隨著較高的乙烯合成與釋放[40]。本研究中，氣調(diào)貯藏顯著促進(jìn)了貨架期乙烯的釋放和揮發(fā)性物質(zhì)的合成。較高的蔗糖含量有助于增強(qiáng)果實(shí)的抗冷性，適宜的糖酸比有利于增加果實(shí)口感。氣調(diào)貯藏總體上可維持桃果實(shí)貨架期期間蔗糖和山梨醇的含量，同明減少葡萄糖和果糖的積累。類似的，1-MCP[41]、茉莉酸甲酯[8]和甜菜堿[42]等都可通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝來(lái)維持果實(shí)的耐寒性。這說(shuō)明氣調(diào)貯藏可以提高桃果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的合成，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)可溶性糖代謝，增強(qiáng)果實(shí)耐寒性。

4 結(jié)論

氣調(diào)貯藏可減輕桃果實(shí)低溫貯藏過(guò)程中冷害的發(fā)生，降低果肉褐變指數(shù)，持貨架期果實(shí)乙烯合成與后熟軟化能力。氣調(diào)貯藏減輕冷害與調(diào)節(jié)ROS代謝密切相關(guān)，在低溫貯藏和貨架期，與對(duì)照組相比，氣調(diào)處理可誘導(dǎo)GR、APX、DHAR活性上升并促進(jìn)桃果實(shí)中AsA和GSH兩種非酶抗氧化劑的再生，提高AsA/DHA值，減少DHA積累，通過(guò)增強(qiáng)AsA-GSH循環(huán)減輕了ROS過(guò)量積累引發(fā)的氧化損傷，有效提高了桃果實(shí)的抗寒性。此外，與對(duì)照組相比，氣調(diào)處理可保持貨架期桃果實(shí)(反)2-己烯醇、乙酸己酯、(順)-乙酸-3-己烯-1-醇酯、γ-己內(nèi)酯、γ-癸內(nèi)酯、δ-癸內(nèi)酯等來(lái)源于脂肪酸代謝途徑的醇、酯類、內(nèi)酯類芳香物質(zhì)含量，提高了蔗糖和山梨醇含量，減少了葡萄糖和果糖的積累。綜上，氣調(diào)貯藏通過(guò)激活A(yù)sA-GSH循環(huán)，增強(qiáng)活性氧清除能力，緩解桃果冷害，維持香氣品質(zhì)。